ampliPHOX détection colorimétrique sur un microréseau d'ADN pour la grippe

L’objectif global de l’expérience suivante est d’utiliser une nouvelle méthode d’amplification rapide du signal pour détecter et caractériser les sous-types viraux de la grippe sur la puce antigrippale et la plateforme de microréseaux à faible densité. Ceci est réalisé en incorporant des DTP biotinylés et en utilisant des amorces avec une extrémité phosphol à cinq premiers pour amplifier le segment de gène matriciel et un segment de gène non structurel à partir d’extraits d’ARN de la grippe. La PCR est suivie d’une digestion et d’une fragmentation enzymatiques pour générer un produit viral biotinylé et amplifié court brin simple, qui est ensuite hybridé à la puce après hybridation.

La détection du renard utilise la photopolymérisation pour faire pousser de grandes taches de polymère où l’hybridation se produit, et des modèles d’hybridation différentielle sont utilisés pour détecter les sous-types viraux de la grippe. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la détection de fluorescence standard est qu’elle est plutôt peu coûteuse et qu’elle fournit un résultat rapide visible à l’œil nu avec une sensibilité analytique similaire à celle de la fluorescence. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la caractérisation des virus de la grippe à l’aide de la puce antigrippale, il s’agit d’une méthode de détection universelle.

Ampl Fox peut également être appliqué à une grande variété d’autres systèmes, tels que d’autres microréseaux à faible densité à base d’ADN et de protéines. En théorie, tout produit biotinylé devrait pouvoir être détecté à l’aide d’amox. Amber Taylor, une scientifique associée, et Kevin Moulton, un assistant de recherche ici à Endeavor, qui ont tous deux joué un rôle central dans le développement de l’instrument Fox et de la chimie de détection au cours des dernières années, feront la démonstration de la procédure.

Extrayez l’ARN viral de 200 microlitres d’isolat viral à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN viral et du protocole du fabricant. Éluez 60 microlitres du volume final et stockez les extraits à moins 70 degrés Celsius ou moins pour une utilisation ultérieure. Préparez ensuite le master mix R-T-P-C-R sur ICE selon le protocole du fabricant.

À l’aide d’un mélange DNTP BIOTINYLÉ, ajoutez le mélange d’amorce de puce antigrippe, qui contient les concentrations indiquées pour le mélange principal. Une amorce de chaque série doit contenir un groupe phosphol à cinq premiers pour faciliter la digestion enzymatique. L’ensemble d’amorces contre la grippe A produit un produit de paire de bases 1032 et l’ensemble d’amorces contre la grippe B produit un produit de paire de bases 811.

Vortex brièvement et distribuez 18 microlitres de mélange principal dans des tubes PCR à paroi mince. Ajoutez ensuite deux microlitres de matrice d’ARN dans chaque tube de réaction. Transférez les tubes PCR dans un thermocycleur et utilisez un profil de cyclage avec une température d’agenouillement appropriée.

Le profil cycliste utilisé dans ce test est illustré ici. Préparez le mélange de digestion enzymatique en combinant 2,2 microlitres de tampon de réaction enzymatique, 0,8 microlitre d’eau libre de nucléases et 1,0 microlitre d’enzyme exonucléase lambda par réaction PCR. Retirez les échantillons du thermocycleur et ajoutez quatre microlitres dans chaque tube PCR.

Retournez les échantillons dans le thermocycleur et programmez le thermocycleur comme indiqué à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, suivi de 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, appliquez des puits d’hybridation à usage unique autour des microréseaux à hybrider. Ensuite, lavez les lames dans 110 millilitres d’eau purifiée sur un agitateur orbital pendant cinq minutes.

Séchez les lames en touchant doucement une lingette en tissu sur le bord du puits. Combinez 22 microlitres de deux tampons d’hybridation avec chacun des produits d’ADN simple brin fragmentés mélangés brièvement et pipetez 40 microlitres dans les puits de la puce. Laissez les lames s’hybrider pendant une heure dans une chambre d’humidité après l’hybridation, retirez les lames de la chambre d’humidité et rincez brièvement chaque lame avec deux millilitres de tampon de lavage D.Placez les lames dans un support à glissières.

Ensuite, ajoutez 110 millilitres de tampons de lavage A et B dans les récipients séparés à l’aide d’un agitateur orbital. Lavez la grille coulissante dans le tampon A à 60 à 90 tr/min, la vitesse utilisée pour tous les lavages suivants pendant une minute. Retirez ensuite la grille coulissante du tampon de lavage A et rincez brièvement avec le tampon de lavage D.Transférez la grille coulissante sur le tampon de lavage B et lavez sur l’agitateur orbital pendant cinq minutes.

Après le lavage, séchez délicatement les matrices de chaque lame avec une lingette en tissu et placez les lames séchées dans la chambre d’humidité. En préparation des étapes de détection métrique de couleur fox, combinez 10 microlitres d’amplitude, 20 microlitres de tampon de deux x amplitude et 10 microlitres d’eau purifiée pour chaque réseau à traiter, transférez 40 microlitres de mélange d’étiquetage dans chaque réseau et laissez la réaction de marquage se dérouler dans une chambre d’humidité fermée Pendant cinq minutes Pendant l’hybridation, préparer 110 millilitres de tampon de lavage C dans un récipient. Après l’étiquetage, rincez immédiatement chaque matrice avec le tampon de lavage D.Placez chaque lame dans le support de lames et lavez et lavez le tampon C sur l’agitateur orbital pendant cinq minutes après le lavage du tampon en mer, plongez brièvement le support de lames trois fois dans un récipient d’eau purifiée.

Pour éliminer les résidus de sel, séchez les réseaux comme indiqué précédemment. Stockez les matrices dans une boîte à diapositives sombre jusqu’à l’activation de la photo et l’imagerie, qui devraient être terminées dans les 24 heures. Ensuite, allumez le lecteur Amli Fox et assurez-vous que le logiciel de visualisation Amli est prêt pour l’activation des photos avant la détection de l’échantillon de matrice.

Tout d’abord, déterminez le temps optimal de photoactivation pour tous les échantillons en suivant une courte procédure d’étalonnage. Une fois par jour, réchauffez ensuite la solution Amplify à température ambiante et vortex brièvement pour mélanger à pipette trois microlitres d’amplificateur dans le flacon amplify et vortex à fond. Pendant 10 secondes, appliquez uniformément 40 microlitres de solution Amplify sur une seule lame à la fois, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles.

Insérez la diapositive de la micropuce dans la baie d’activation photo du lecteur Amplify. Démarrez l’activation des photos en sélectionnant, démarrez dans le logiciel PL view en utilisant le temps d’activation des photos déterminé dans le processus d’étalonnage. Une fois terminé, rincez la puce avec deux millilitres d’eau purifiée pour éliminer l’excès de polymère clair d’amplification s’est maintenant produite sur des points contenant de l’ADN cible, mais est mieux visualisée.

Après la coloration, laissez sécher les taches de polymère pendant deux minutes. Ensuite, répartissez deux gouttes de rouge abondant sur le réseau et laissez la coloration se poursuivre pendant deux minutes Après la coloration, rincez rapidement la lame à l’eau purifiée et séchez-la comme indiqué précédemment, insérez la lame dans la baie d’imagerie du lecteur Amli Fox pour collecter une image à l’aide du logiciel amli pour traiter les résultats. L’image de gauche montre la détection d’un spécimen de roman de 2009 H one N par Amli Fox.

Alors que l’image de droite utilise la fluorescence traditionnelle générée par un scanner de microréseaux à fluorescence confocale, le même modèle de détection global peut être facilement vu pour les deux méthodes. Cependant, le résultat du renard Amli est visible à l’œil nu. Ces images montrent des résultats de puce antigrippale d’origine humaine, H trois N deux d’origine humaine, H un N un, d’origine porcine, H un N un, et un réseau de renards négatif sans grippe détectable.

Une séquence deux et trois entourées de bleu produit un signal pour toute la grippe. A sous-types représentés, mais les séquences encadrées en rouge en bas à droite ne produisent que le signal pour l’origine porcine, H un N un spécimen. L’échantillon négatif montre un signal sur une séquence de contrôle interne décrite en vert, indiquant qu’il n’y a pas d’inhibition ou de défaillance de la réaction R-T-P-C-R.

Une fois maîtrisé, l’ensemble du processus, de l’extraction du flacon à la détection d’amox et à l’interprétation du résultat final, peut être effectué en six heures environ. La partie détection Ampl Fox de la procédure, y compris l’étalonnage de l’instrument, peut être terminée en environ 30 minutes après cette procédure. D’autres méthodes comme le séquençage partiel ou complet du génome peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires.

Ce test de dépistage de la grippe est destiné à servir de dépistage initial, en particulier pour les échantillons qui donnent lieu à un profil d’hybridation unique. Comme la détection est un test général, nous espérons que les chercheurs trouveront de nouvelles applications intéressantes de microréseaux à faible densité pour lesquelles la détection pourrait apporter une valeur ajoutée.