Caractérisation des isolés, ventilés et instrumentés poumons de souris perfusées avec un flux pulsatile

Étudier les relations entre la pression pulmonaire pulsatile et le débit. Ce protocole explique comment isoler, ventiler et perfuser les poumons de souris. La trachée est exposée chirurgicalement pour la ventilation.

Ensuite, le cœur et les poumons sont isolés afin que l’artère pulmonaire et l’oreillette gauche puissent être canulées. Le système pulmonaire est alors perfusé. Les expériences sont réalisées en modifiant le débit, l’amplude, la forme d’onde et/ou la fréquence de l’artère pulmonaire.

Les formes d’onde de pression de l’artère pulmonaire et de l’oreillette gauche qui en résultent sont enregistrées et démontrent les relations de flux de pression pulmonaire pulsatile. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les préparations in vivo, est que les relations pression-débit changent. Des relations de débit de pression pulsatile peuvent être obtenues en l’absence de changements dans l’état du volume, le tonus du système nerveux sympathique, l’activité et les effets de l’anesthésie.

De plus, la plupart des préparations pulmonaires isolées ne mesurent que les relations de débit de pression stables, alors que notre technique permet de déterminer les relations de flux de pression pulsatile. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la physiologie pulmonaire, telles que comment la maladie vasculaire pulmonaire affecte-t-elle l’hémodynamique pulmonaire pulsatile, ou comment le raidissement de la grande artère pulmonaire affecte-t-il la postcharge ventriculaire droite ? La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car il est difficile d’exposer le cœur et les poumons et de fixer la canule dans l’artère pulmonaire.

Une pression excessive de l’instrumentation peut provoquer un œdème dans les poumons et un mauvais placement de la canule peut perforer l’artère pulmonaire. Avant de commencer l’expérience, il est nécessaire de préparer le système IL one utilisé pour ventiler et perfuser le poumon isolé. Le tube doit être connecté aux transducteurs de pression.

O pompe solitaire et débitmètre complètement Rincez le système avec de l’eau distillée chauffée à 37 degrés Celsius et éliminez toutes les bulles dans le tube. Ensuite, amorcez le tube de la pompe Endur tech avec 1 % de PBS. Maintenant, zéro.

La pression de chaque transducteur P 75 en fermant d’abord sa vanne au système IL one et en ouvrant sa vanne à l’atmosphère. Ensuite, utilisez l’amplificateur SIS pour mettre automatiquement à zéro la pression avant de préparer l’animal, humidifiez la configuration IO one en trempant la pièce poreuse en céramique dans de l’eau distillée. Après avoir anesthésié la souris, stabilisez-la pour la chirurgie en épinglant ses pattes avant sur le tableau de liège.

Vaporisez maintenant le coffre avec de l’alcool à 95 %. Utilisez une pince droite pour saisir la peau au niveau du cou et coupez une ouverture d’un centimètre avec les ciseaux droits. Une fois l’intérieur du cou exposé, coupez le tissu glandulaire blanc dans les muscles superficiels tout en cherchant l’œsophage et la trachée.

Isolez l’œsophage et la trachée des tissus de chaque côté et vers l’arrière et attachez une suture lâche autour de la trachée. Pour canuler la trachée, coupez soigneusement un petit V sur un côté de celle-ci avec les petits ciseaux. Amenez maintenant la souris vers le système IL one à l’aide d’une pince contondante.

Saisissez la canule trachéale et glissez-la dans la trachée. Fixez la canule avec une suture. Commencez la ventilation avec de l’air ambiant, vaporisez la poitrine avec de l’alcool et retirez la peau à l’aide d’une pince droite et de ciseaux droits.

Coupez la peau vers le haut le long du sternum. Soulevez la peau de chaque côté et coupez le long de la ligne des côtes inférieures. Saisissez maintenant le processus xiphoïde à l’aide d’une pince à épiler et utilisez des ciseaux à pointe sphérique pour percer un trou dans le diaphragme à l’endroit où il rencontre le bas du sternum.

Saisissez le diaphragme et coupez-le des côtes. À l’aide de ciseaux à pointe sphérique, saisissez à nouveau le processus xiphoïde et utilisez les ciseaux à pointe sphérique pour couper soigneusement le sternum à travers les côtes sans endommager les poumons, le cœur ou les vaisseaux sanguins. Pour exposer le cœur, saisissez les côtes gauches et coupez leurs extrémités.

Maintenant, injectez lentement dans le ventricule droit 0,1 millilitres d’héparine Après l’injection, coupez le reste des côtes. Utilisez l’arrière ou l’extrémité arrondie de la pince pour éloigner doucement les poumons de la côte tout en coupant les côtes au microscope. Retirez le tissu glandulaire dans la graisse sur le dessus du cœur.

Utilisez la pince à épiler pour retirer les mouchoirs et les couper. Avec les ciseaux à ressort pour placer une suture autour de l’aorte et de l’artère pulmonaire, versez doucement le cœur avec une pince à épiler émoussée. Il devrait y avoir peu de résistance.

Maintenant, attachez une suture lâche avec le double lancer. Ensuite, coupez le bas-ventre. Utilisez des ciseaux coudés pour couper les côtes et la colonne vertébrale.

Cela fera circuler une quantité importante de sang. Utilisez un coton-tige pour arrêter le flux. Une fois le flux sanguin arrêté, amorcez le système IL avec quatre millilitres de RPMI à partir d’une seringue remplie de 10 millilitres de RPMI.

Il est bon de vérifier que le tube ne contient pas de bulles. Maintenant, canulez le ventricule droit en coupant une petite encoche près de l’apex et en insérant la canule Visez vers le bas vers la droite pour atteindre l’artère pulmonaire. L’extrémité de la sonde doit être visible à travers la paroi presque transparente de l’artère pulmonaire.

Serrez ensuite la suture autour de la canule, de l’aorte et de l’artère pulmonaire pour canuler le ventricule gauche. Coupez une encoche dans l’apex et insérez la canule visant vers le haut dans l’oreillette gauche. Une légère pression peut être nécessaire pour trouver la valve, mais une fois trouvée, la canule glissera et sera sécurisée sans suture.

Perfusez manuellement le RPMI de la seringue de 10 millilitres à 0,3 millilitre par minute jusqu’à ce que vous voyiez un écoulement dans le tube de sortie. S’il n’y a pas d’écoulement dans la tubulure de sortie, repositionnez la canule du ventricule gauche. Cependant, s’il n’y a pas de flux dans les poumons, interrompez l’expérience car l’artère pulmonaire a probablement une fuite.

Maintenant que le cœur est complètement canulé, connectez la seringue de 60 millilitres au système IL one. À l’aide de la pompe à débit constant et perfusez le RPMI Perfuse eight à un débit d’un millilitre par minute. Vérifiez s’il y a des fuites lors de la perfusion initiale.

Perfuser progressivement les poumons pendant encore deux minutes, pendant lesquelles les poumons deviendront blancs. Pour les études de flux pulsatiles. Réglez d’abord la cylindrée du piston de la pompe solitaire aux niveaux souhaités.

Réglez ensuite le débit constant. Ouvrez maintenant la vanne de la pompe osli et commencez à enregistrer les données juste avant d’exécuter le profil d’écoulement osli. Une fois que vous avez terminé, ouvrez le fichier de sortie de données et tracez le flux expérimental en fonction des flux expérimentaux de l’essai initial.

Ajustez la cylindrée du piston de la pompe oscillatoire à chaque fréquence afin que Q max soit comme souhaité. Maintenez la ventilation à une pression constante Pendant la collecte de données pour les essais à débit constant, fermez la vanne de la pompe solitaire et réglez le débit constant au niveau souhaité. Commencez à enregistrer des données et suivez le protocole de flux régulier.

Collecte de données pendant au moins 10 secondes à chaque débit entre les essais. Réinitialisez le débit à 0,5 millilitre par minute. Assurez-vous de maintenir la ventilation à une pression constante pendant la collecte des données.

Si des essais de pression auriculaire gauche nulle sont souhaités, retirer le tube d’évacuation pendant les essais. Surveillez avec vigilance la présence d’IARP dans les tubes des voies respiratoires. Il ne faut pas laisser les RPMI atteindre les transducteurs de pression des voies respiratoires, sinon ils seront endommagés.

Voici les résultats de la perfusion à débit constant avec le débit Q dans la rangée supérieure et les pressions de l’artère pulmonaire et de l’auriculaire gauche résultantes dans la deuxième rangée dans diverses conditions. Dans les deux premiers panneaux, la pression auriculaire gauche a augmenté et diminué avec Q parce que le tube d’évacuation était en place, le premier panneau montre la pression d’air à l’extrémité, la pression inspiratoire et le second montre la pression atmosphérique à la pression expiratoire finale. Ensuite, le tube a été retiré de sorte que la pression auriculaire gauche soit constante et indépendante de Q. Ensuite, la hauteur du tube de sortie a été ajustée manuellement de sorte que la pression auriculaire gauche était plus élevée.

Mais indépendamment de Q à nouveau, le premier panneau montre la pression de l’air à la fin, la pression inspiratoire, et le second montre la pression de l’air à la fin. Pression expiratoire. Les relations de débit de pression de l’artère pulmonaire stables qui en résultent pour chaque cas peuvent être obtenues en traçant la pression en fonction du débit.

Voici les résultats de la perfusion du flux pulsatile avec le flux Q dans le panneau supérieur et les pressions résultantes de l’artère pulmonaire, de l’oreillette gauche et de l’air. Dans le panneau inférieur. À partir de ces relations de flux de pression pulmonaire pulsatile, l’impédance vasculaire pulmonaire peut être calculée, ce qui reflète la postcharge ventriculaire droite totale.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 à 30 minutes. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de prendre votre temps et de vous détendre afin que vos mains soient stables. Une fois que les poumons sont correctement perfusés, la partie la plus difficile est terminée.

À la suite de cette procédure, d’autres techniques peuvent être effectuées, telles que l’histologie ou les analyses biochimiques sur le tissu pulmonaire, pour répondre à des questions supplémentaires telles que les mécanismes moléculaires responsables des changements observés dans les relations de flux de pression pulsatile pulmonaire. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la physiologie pulmonaire pour explorer le rôle de gènes et de protéines spécifiques dans le développement et la progression des maladies vasculaires pulmonaires à l’aide de souris génétiquement modifiées.