Imagerie des cellules vivantes des cellules sensorielles de précurseurs d'organes en Intact Drosophile Les chrysalides

Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode pour l'imagerie de cellules vivantes de façon asymétrique divisant sensorielles des cellules progénitrices d'organes et les cellules épidermiques intacts

L’objectif global de cette procédure est de préparer Driss Pupi à l’imagerie de cellules vivantes de cellules progénitrices d’organes sensoriels thoraciques en division ou de cellules SOP pendant la métamorphose. Ceci est accompli en mettant d’abord en place le croisement génétique approprié pour obtenir une descendance puy pour l’imagerie de cellules vivantes. La deuxième étape de la procédure consiste à collecter des cellules progénitrices neurales à l’étape appropriée pour visualiser les cellules progénitrices neurales en division asymétrique.

La troisième étape de la procédure consiste à retirer le boîtier de la pupille afin de monter la chrysalide pour l’imagerie. La dernière étape de la procédure consiste à monter la chrysalide entre la lame et la lamelle et à procéder à l’imagerie de cellules vivantes. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la dynamique des protéines marquées par fluorescence au cours de la division cellulaire asymétrique et de la différenciation de cellules d’organes sensoriels de type sauvage ou mutantes par épifluorescence ou microscopie confocale.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’immunohistochimie est que la dynamique des protéines peut être suivie en temps réel et sur plusieurs heures dans un pipa intact à partir de la ligne souhaitée et de la protéine de fusion marquée GFP. Sous le contrôle de l’UAS, identifiez les enfants qui ont subi une mise à l’eau dans l’heure. Ces puy posséderont une morphologie pupillaire caractéristique mais manqueront de pigmentation.

Le puy sélectionné peut soit être transféré dans un nouveau fichier, soit marqué sur le fichier transversal pour se rappeler lesquels étaient blancs. 18 heures plus tard, lorsque le puy atteint le stade approprié, placez un morceau de ruban adhésif double face sur une lame de microscope et collez le boîtier de la pupille sur la lame, côté ventral vers le bas, sous le microscope de dissection. Identifiez et saisissez le bord de l’URM à l’aide d’une paire de pinces et soulevez-le doucement, révélant la tête de la mouche immature.

Veiller à ne pas perforer le corps de la mouche. Déchirez doucement le côté de la pupille et retirez-la complètement pour révéler le thorax et la partie antérieure de l’abdomen. Continuez à déchirer soigneusement le même côté vers l’arrière et tirez le boîtier de la pupille du côté opposé et collez-le sur le ruban adhésif.

Maintenant que l’abdomen est complètement exposé, poussez doucement une brosse à poils doux sous la tête de la chrysalide et soulevez-la du reste de la pupille. Placez la nymphe sur une lame de microscope, côté dorsal vers le haut Placez la chrysalide à un angle de 45 degrés de sorte que la lamelle touche la région des cellules SOP thoraciques. Tout d’abord, fabriquez un cadre carré de 18 x 18 millimètres avec du papier filtre watman en découpant une fenêtre de 10 x 10 millimètres au centre.

Plongez le cadre dans l’eau jusqu’à ce qu’il soit saturé, puis placez-le autour de la nymphe. À l’aide d’une seringue de cinq cc, appliquez une couche uniforme de graisse silicone autour du cadre, de sorte que l’épaisseur de la couche soit à peine supérieure au diamètre de la pupille. Pipetez environ un microlitre d’eau au centre d’une lamelle de 22 x 22 millimètres et positionnez la lamelle de manière à ce que la gouttelette touche le nodom de la pupille.

Appuyez doucement pour former un joint complet et une surface plane contre la nymphe. Maintenant que la chrysalide vivante a été montée, elle peut être imagée à l’aide de la microscopie confocale en combinant les techniques de dissection et de montage. Avec l’imagerie en direct, on peut visualiser l’accumulation de la protéine de fusion de l’actine GFP au niveau du sillon de clivage d’une cellule SOP mitotique.

Au fil du temps, la distribution du partenaire de Num RFP et RAB 5G FP peut être comparée sur deux cellules filles SOP. Notez que si le partenaire de NUM RFP est distribué de manière asymétrique, RAB 5G FP est distribué uniformément dans les deux cellules aux derniers stades de la pupille. Les organes sensoriels externes différenciés peuvent être visualisés, les ménos, les cavités sensorielles et les cheveux présentent une autofluorescence et sont montrés ici en chevauchement avec L-G-L-G-F-P exprimés dans un sous-ensemble de cellules SOP.

Utilisation du système Markem Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de 10 minutes si elle est correctement exécutée. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunohistochimie peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’identification des sulfates des cellules d’organes sensoriels avec des marqueurs d’anticorps spécifiques ou l’étude de colocalisation des protéines de fusion GFP avec des protéines endogènes.