Imagerie des cellules vivantes des cellules sensorielles de précurseurs d'organes en Intact Drosophile Les chrysalides
27 mai 2011
Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode pour l'imagerie de cellules vivantes de façon asymétrique divisant sensorielles des cellules progénitrices d'organes et les cellules épidermiques intacts Drosophile Pupes
L’objectif global de cette procédure est de préparer Driss Pupi à l’imagerie de cellules vivantes de cellules progénitrices d’organes sensoriels thoraciques en division ou de cellules SOP pendant la métamorphose. Ceci est accompli en mettant d’abord en place le croisement génétique approprié pour obtenir une descendance puy pour l’imagerie de cellules vivantes. La deuxième étape de la procédure consiste à collecter des cellules progénitrices neurales à l’étape appropriée pour visualiser les cellules progénitrices neurales en division asymétrique.
La troisième étape de la procédure consiste à retirer le boîtier de la pupille afin de monter la chrysalide pour l’imagerie. La dernière étape de la procédure consiste à monter la chrysalide entre la lame et la lamelle et à procéder à l’imagerie de cellules vivantes. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la dynamique des protéines marquées par fluorescence au cours de la division cellulaire asymétrique et de la différenciation de cellules d’organes sensoriels de type sauvage ou mutantes par épifluorescence ou microscopie confocale.
Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’immunohistochimie est que la dynamique des protéines peut être suivie en temps réel et sur plusieurs heures dans un pipa intact à partir de la ligne souhaitée et de la protéine de fusion marquée GFP. Sous le contrôle de l’UAS, identifiez les enfants qui ont subi une mise à l’eau dans l’heure. Ces puy posséderont une morphologie pupillaire caractéristique mais manqueront de pigmentation.
Le puy sélectionné peut soit être transféré dans un nouveau fichier, soit marqué sur le fichier transversal pour se rappeler lesquels étaient blancs. 18 heures plus tard, lorsque le puy atteint le stade approprié, placez un morceau de ruban adhésif double face sur une lame de microscope et collez le boîtier de la pupille sur la lame, côté ventral vers le bas, sous le microscope de dissection. Identifiez et saisissez le bord de l’URM à l’aide d’une paire de pinces et soulevez-le doucement, révélant la tête de la mouche immature.
Veiller à ne pas perforer le corps de la mouche. Déchirez doucement le côté de la pupille et retirez-la complètement pour révéler le thorax et la partie antérieure de l’abdomen. Continuez à déchirer soigneusement le même côté vers l’arrière et tirez le boîtier de la pupille du côté opposé et collez-le sur le ruban adhésif.
Maintenant que l’abdomen est complètement exposé, poussez doucement une brosse à poils doux sous la tête de la chrysalide et soulevez-la du reste de la pupille. Placez la nymphe sur une lame de microscope, côté dorsal vers le haut Placez la chrysalide à un angle de 45 degrés de sorte que la lamelle touche la région des cellules SOP thoraciques. Tout d’abord, fabriquez un cadre carré de 18 x 18 millimètres avec du papier filtre watman en découpant une fenêtre de 10 x 10 millimètres au centre.
Plongez le cadre dans l’eau jusqu’à ce qu’il soit saturé, puis placez-le autour de la nymphe. À l’aide d’une seringue de cinq cc, appliquez une couche uniforme de graisse silicone autour du cadre, de sorte que l’épaisseur de la couche soit à peine supérieure au diamètre de la pupille. Pipetez environ un microlitre d’eau au centre d’une lamelle de 22 x 22 millimètres et positionnez la lamelle de manière à ce que la gouttelette touche le nodom de la pupille.
Appuyez doucement pour former un joint complet et une surface plane contre la nymphe. Maintenant que la chrysalide vivante a été montée, elle peut être imagée à l’aide de la microscopie confocale en combinant les techniques de dissection et de montage. Avec l’imagerie en direct, on peut visualiser l’accumulation de la protéine de fusion de l’actine GFP au niveau du sillon de clivage d’une cellule SOP mitotique.
Au fil du temps, la distribution du partenaire de Num RFP et RAB 5G FP peut être comparée sur deux cellules filles SOP. Notez que si le partenaire de NUM RFP est distribué de manière asymétrique, RAB 5G FP est distribué uniformément dans les deux cellules aux derniers stades de la pupille. Les organes sensoriels externes différenciés peuvent être visualisés, les ménos, les cavités sensorielles et les cheveux présentent une autofluorescence et sont montrés ici en chevauchement avec L-G-L-G-F-P exprimés dans un sous-ensemble de cellules SOP.
Utilisation du système Markem Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de 10 minutes si elle est correctement exécutée. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunohistochimie peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’identification des sulfates des cellules d’organes sensoriels avec des marqueurs d’anticorps spécifiques ou l’étude de colocalisation des protéines de fusion GFP avec des protéines endogènes.
Aperçu
Ce vidéo montre une méthode d'imagerie de cellules vivantes permettant d'observer la division asymétrique des cellules progénitrices d'organes sensoriels et des cellules épidermiques chez des puces de Drosophile intacts. Le protocole permet une visualisation en temps réel de la dynamique des protéines durant la division et la différenciation cellulaires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Biologie du développement
Contexte
- L'imagerie de cellules vivantes permet d'obtenir des informations sur les processus cellulaires en temps réel.
- Les puces de Drosophila servent de modèle pour l'étude du développement des organes sensoriels.
- La division cellulaire asymétrique est essentielle à une formation adéquate des organes.
- Le marquage fluorescent permet de suivre des protéines spécifiques au cours du développement.
Objectif de l'étude
- Visualiser la dynamique des cellules progénitrices d'organes sensoriels en division.
- Comparer la distribution des protéines dans les cellules filles lors de la division asymétrique.
- Approfondir la compréhension du développement des organes sensoriels chez Drosophila.
Méthodes utilisées
- Mettre en place des croisements génétiques pour obtenir une descendance appropriée pour l'imagerie.
- Collecter les nymphes au stade de développement adéquat.
- Monter la nymphe pour l'imagerie en utilisant une technique spécialisée.
- Utiliser la microscopie confocale pour observer des protéines marquées par fluorescence.
Résultats principaux
- L'imagerie en temps réel révèle la dynamique de l'actine et d'autres protéines pendant la division cellulaire.
- Une distribution asymétrique des protéines a été observée dans les cellules filles SOP.
- Les organes sensoriels externes présentaient une autofluorescence, facilitant la visualisation.
- La technique peut être réalisée efficacement, augmentant ainsi le débit expérimental.
Conclusions
- Cette méthode fournit un outil puissant pour l'étude de la dynamique des cellules vivantes chez Drosophila.
- L'imagerie en temps réel surpasse les méthodes traditionnelles telles que l'immunohistochimie.
- De futures études pourront s'appuyer sur cette technique pour explorer d'autres questions cellulaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
L'imagerie de cellules vivantes des cellules précurseurs d'organes sensoriels dans des puces entières de Drosophila permet une visualisation en temps réel de la dynamique asymétrique des protéines pendant la division cellulaire, offrant ainsi des aperçus mécanistiques sur la régulation de la voie de signalisation Notch. Cette approche facilite la validation de cibles en permettant l'observation directe de la ségrégation des déterminants du destin cellulaire et de l'activité de la voie dans un système génétiquement modulable et pertinent pour les maladies. La méthode renforce la confiance prédictive en phase de découverte précoce en reliant la dynamique protéique subcellulaire aux issues du destin cellulaire, éclairant ainsi les stratégies de dé-risquage pour les cibles impliquées dans la division asymétrique et la différenciation des cellules souches.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques en visualisant la distribution asymétrique de déterminants du destin cellulaire, comme Numb, durant la mitose.
- Valeur scientifique : Soutient la validation fonctionnelle de cibles grâce à la corrélation en temps réel entre la dynamique des protéines et l'inhibition de la voie Notch dans les cellules filles.
- Valeur opérationnelle : Facilite la réduction des risques biologiques en permettant la comparaison entre conditions sauvages et mutantes à l'aide d'une analyse mosaique MARCM sur tissu intact.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour des flux opérationnels ultérieurs en établissant une imagerie dynamique reproductible de la division cellulaire selon un protocole standardisé chez des nymphes intacts.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation des tests et des résultats quantitatifs grâce à des profils mesurables de localisation protéique (par exemple, l’actine au sillon de division, une distribution symétrique de RAB5).
- Valeur opérationnelle : Met en évidence la préparation au criblage et la possibilité de montée en échelle via un protocole de montage réalisé en moins de 10 minutes, permettant des sessions d’imagerie répétées.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Aborde la pertinence pathologique à travers des mécanismes évolutivement conservés de division cellulaire asymétrique et de signalisation Notch dans le développement des organes sensoriels.
- Valeur scientifique : Décrit la continuité translationnelle depuis la découverte (spécification du SOP) jusqu'à la différenciation terminale (formation de l'organe externe avec autofluorescence).
- Valeur stratégique : Soutient les décisions d'avancement ajustées au risque en reliant la dynamique des protéines aux résultats fonctionnels dans les lignées cellulaires progénitrices.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la découverte précoce à l'identification de candidats en permettant une évaluation en temps réel de l'engagement de la cible et de la modulation de la voie dans la division cellulaire asymétrique.
- Biologie de la découverte : Explique comment la méthode permet de tester des hypothèses, de clarifier des voies biologiques et de réduire les risques biologiques grâce à la visualisation directe de la ségrégation des inhibiteurs de Notch.
- Criblage : Décrit la préparation du test, sa reproductibilité et ses résultats quantitatifs par le biais d’un montage standardisé et du suivi de protéines fluorescentes dans des protocoles normalisés de mitose.
- Analytique : Met en évidence les mesures, les signaux ou les résultats statistiques permettant aux équipes de comparer différentes conditions, comme la distribution asymétrique ou symétrique des protéines dans les cellules filles.
- Recherche translationnelle : Relie la méthode à la continuité préclinique par la conservation des mécanismes de division asymétrique dans la régénération tissulaire dirigée par les cellules souches.
- Réutilisation en entreprise : Présente la méthode comme une capacité réutilisable plutôt qu’une technique à usage unique, adaptable à de multiples protéines marquées par la GFP et à divers fonds génétiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive, validation des cibles, réduction de l'ambiguïté mécanistique dans la spécification du destin cellulaire.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité de l'imagerie en temps réel dans des modèles développementaux intacts.
- Valeur stratégique : Meilleures décisions d'aller/ne pas aller, efficacité du capital et réduction des risques biologiques en phase avancée grâce à une compréhension mécanistique précoce.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation et décisions d'avancement ajustées au risque, fondées sur l'observation directe de la dynamique des protéines cibles dans des contextes pertinents pour la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Expertise scientifique requise en génétique de Drosophila, systèmes Gal4/UAS et marquage par protéines fluorescentes.
- Les besoins en instrumentation et en infrastructure analytique comprennent la microscopie confocale ou épifluorescente ainsi que des chambres de montage à base de silicone.
- Exigences de standardisation entre équipes pour les croisements génétiques, le stade des pupes et l'analyse de mutants basée sur MARCM.
- Considérations d'adaptation entre systèmes modèles, en notant la conservation des mécanismes de division asymétrique mais des ajustements spécifiques à l'espèce pour le montage.
- Limites pratiques appuyées par les données sources : la technique nécessite un thorax pupal intact et est limitée aux stades où les SOP sont mitotiquement actives (les 12 premières heures après la formation de la pupe).
