In vivo laser axotomie en C. elegans

L'objectif général de cette procédure est de sectionner précisément les neurones du CL à l'aide d'un laser in vivo. Cela est réalisé en assemblant le système de taxotomie et en focalisant, alignant et ajustant avec précision la puissance du laser. Lorsque les vers sont immobilisés sur une lame de microscope, leurs neurones peuvent être sectionnés avec un contrôle spatial et temporel précis.

L'étendue de la régénération des neurones sectionnés est ensuite mesurée en quantifiant les cônes de croissance et/ou en traçant la longueur des neurites. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le laser femtoseconde, est que le laser à impulsions microponctuelles constitue un système économique, facile à installer et à entretenir, et facilement adaptable à un large éventail d'applications, bien que nous appliquions généralement cette méthode à l'étude de la régénération des neurones moteurs GABAergiques. Ce système peut également être utilisé pour ablater d'autres types cellulaires, tels que les cellules musculaires cutanées ou des synapses neuronales spécifiques.

Cette méthode nécessite un système laser à micro-point. Le laser est monté sur le port d'épi-fluorescence d'un microscope composé et comprend un miroir dichroïque unique correspondant au fluorophore des cellules à découper, un générateur d'impulsions et une pédale pour commander le laser. Au minimum, le microscope doit être équipé d'un objectif à immersion huile de 100 fois, ouverture numérique 1,4, et d'un objectif 4 fois.

Disposer d'une platine motorisée avec commande par joystick et être montée sur une table anti-vibrations pour l'illumination. Une source lumineuse équipée d'un guide de lumière et d'un mécanisme d'obturateur est fixée au laser micro point. Le mécanisme d'obturateur permet de réduire l'intensité d'illumination indépendamment du laser.

Une caméra reliée à un ordinateur nécessite une fréquence d'images d'au moins 16 hertz et doit fonctionner correctement dans des conditions de faible luminosité. L'ordinateur doit être équipé d'un logiciel d'imagerie tel que Nikon Elements pour visualiser les neurones, piloter la caméra et commander la platine motorisée. Une fois entièrement assemblé, l'utilisateur peut focaliser le microscope d'une main, déplacer la platine de l'autre, activer le laser à l'aide de la pédale au pied et disposer d'une vue claire de l'image à l'écran.

Couper des neurones dans un organisme de la taille d'un grain de sable peut s'avérer difficile. Pour y parvenir, le laser doit être fortement focalisé dans les trois dimensions. Commencez par focaliser le plan Z.

Insérez le filtre neutre ND 16 pour atténuer le laser pendant la mise au point afin d’obtenir une mise au point plus précise, en insérant à la fois le filtre ND 16 et les quatre filtres fluorescents. Ensuite, réglez le laser micro point sur une impulsion en tournant l’interrupteur pour sélectionner, puis déplacez la roue à filtres vers le filtre passe-long approprié. Placez maintenant une lame réfléchissante sur la platine et focalisez-vous sur les trous d’aiguille présents dans celle-ci à l’aide de l’objectif 4 fois et de la lumière transmise.

Une fois la mise au point effectuée, ajoutez une goutte d'huile à immersion sur la lame et effectuez à nouveau la mise au point sur les trous d'aiguille à l'aide de l'objectif 100 fois. Ensuite, utilisez le levier de commutation du trajet optique pour ouvrir l'obturateur de la caméra et ouvrir l'obturateur du laser. Si une mise au point précise s'avère difficile, réduisez l'intensité de la lumière transmise afin que les bords du trou d'aiguille soient nets.

Pour tester la mise au point, utilisez la pédale pour déclencher le laser. Si le plan Z est correctement mis au point, un petit trou doit apparaître dans le miroir. Réglez maintenant légèrement la mise au point du microscope au-dessus du plan de la lame miroir et tirez à nouveau avec le laser.

Cela devrait produire un trou encore plus petit que le premier tir ou ne laisser aucune marque du tout. Les mêmes résultats devraient être observés lorsqu'on fait le point en dessous de la lame réfléchissante. Toutefois, si un trou plus grand est produit, il faut alors recentrer le laser à l’aide de la bague de mise au point située sur la tête d’ablation.

Enfin, vérifiez que le trou est toujours correctement aligné avec les réticules dans l’oculaire. Avec une utilisation régulière, le plan de focalisation Z a rarement besoin d’être ajusté. Pour focaliser le laser dans le plan XY, faites un autre trou dans le miroir, puis accédez au logiciel Nikon Elements.

Activez le mode de capture en direct dans le menu d'acquisition. Dans la barre d'outils de mesure, sélectionnez l'éditeur de région d'intérêt (ROI), choisissez l'outil double croix et faites glisser les fils de croix afin de les aligner sur le centre du nouveau trou. Cliquez sur Enregistrer la ROI, puis quittez l'éditeur pour reprendre la capture en direct.

Pour manipuler la platine à l'aide de la souris, activez le réglage souris XY. Le laser est désormais focalisé. Réinitialisez les filtres à densité neutre à leur position d'origine et réglez les impulsions laser de un à 10 pour une utilisation ultérieure.

Préparez d'abord une solution de 3 % d'aros fondu dans une solution M nine et versez environ cinq millilitres dans un tube de 50 millilitres. Placez le tube dans un bain-marie à une température de 55 à 65 degrés Celsius et conservez le reste pour une utilisation ultérieure. Utilisez maintenant deux lames recouvertes d'étiquetage.

Fixez avec du ruban adhésif une paire de lames propres et une goutte d'agarose afin de former un tampon sur lequel placer les vers. Après 30 secondes, lorsque l'agarose sera solidifiée, déposez à l’aide d’une micropipette trois à cinq microlitres de billes de polystyrène de 0,05 à 0,1 micromètre sur le tampon dans les 10 minutes, puis disposez rapidement cinq à dix vers transgéniques sur les billes à l’aide d’un curet en platine, de manière à ce que leurs neurones marqués soient facilement visibles. Pour éviter d’endommager les vers, posez délicatement une lame couvre-objet standard sur les vers.

Déplacez-le autour. La préparation microscopique est maintenant prête pour effectuer des analyses taxonomiques. À l’aide de l’oculaire, localisez les vers avec un grossissement de quatre fois, recentrez avec l’objectif 100 fois, éteignez la lumière transmise, allumez la fluorescence et basculez le trajet optique vers la caméra.

Utilisez la souris pour centrer le neurone sur les réticules. Appuyez maintenant sur la pédale pour déclencher le laser. La puissance laser adéquate sectionnera le neurone en une ou deux impulsions.

Une puissance laser trop élevée provoquera des dommages périphériques ou percera un trou dans le ver. Pour régler la puissance du laser, déplacez la plaque atténuateur. Si le laser devient faible, la position de la plaque atténuateur peut être ajustée afin de maintenir la coupe. Toutefois, cela indique probablement que le Kumar dans quatre 40 dans la pile D du laser doit être remplacé une fois l'opération effectuée correctement.

La taxotomie au laser produit une petite rupture dans le neurone. Dans certains cas, une petite cicatrice peut se former autour du site de la lésion. En pratique, entre un et trois neurones sont coupés par animal, mais il n'existe aucune limite théorique.

Lorsque l'opération est terminée, récupérez les vers en retirant la lame couvre-objet par un mouvement directement vers le haut, en veillant à ce que les vers restent sur le tampon en agarose. Ne faites pas glisser la lame couvre-objet. Utilisez une pince fine pour découper le tampon autour des vers.

Placer la lame sur une boîte de gélose NGM fraîchement ensemencée contenant OP50 et libérer les vers avec 10 microlitres de M neuf stérile. Entre huit et 48 heures après la régénération par exotomie, on peut évaluer celle-ci en remontant les vers sains sur trois à cinq microlitres de billes de polystyrène et en visualisant leurs neurones dans les neurones sectionnés. Un moignon neuronal situé en aval du site de coupure restera en place. Initialement, les moignons distal et proximal se rétractent après la coupure, mais la régénération est attendue à partir du moignon proximal.

La régénération peut être évaluée en fonction de la formation d'un cône de croissance. Alternativement, la longueur des neurites peut être tracée et comparée ; typiquement, entre 60 et 70 % des neurones GABA forment des cônes de croissance dans les 24 heures suivant la coupure. Si le laser ne coupe pas correctement, cela est probablement dû soit au fait que le laser est hors focus, soit au fait que le colorant dans la cellule de colorant doit être remplacé.

En outre, si vous constatez que les vers bougent, cela est probablement dû au fait que le tampon d'agarose est trop humide. Nous constatons qu'il est nécessaire de laisser reposer les tampons environ 30 secondes avant d'y placer les vers afin d'éviter ce problème. De plus, vous pouvez essayer d'utiliser des microbilles de taille plus petite pour immobiliser les vers.

Enfin, si vous observez que les axones présentent un aspect perlé, cela est probablement dû au fait que le tampon d'agarose est trop sec. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment installer le système laser microponctuel. Monter les vers pour la taxotomie, sectionner des neurones individuels et évaluer la régénération ultérieure.