Name: Direct imagerie calcique cellulaire Combiné avec Gene Silencing siARN Mediated Identifie Ca 2 + Canaux de fuite dans la membrane du RE et de leurs mécanismes de régulation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: Découvrez l'imagerie calcique cellulaire combinée au silençage génique siARN pour identifier les canaux de fuite Ca²⁺ du réticulum endoplasmique et leurs mécanismes de régulation dans les cellules HeLa.

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SL a été soutenu par une bourse de recherche de la DFG (Graduate School Research 845). Ce travail a été soutenu par des subventions de l&#39;(530/C1 SFB &amp; POUR 967) et par la DFG HOMFOR.

1. Préparation des solutions mères <ol><li> Préparer sans calcium tampon (140 mM NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 0,5 mM EGTA, 10 mM de glucose dans 10 mM HEPES-KOH (pH 7,35)). </li><li> Solubiliser FURA-deux heures dans le DMSO pour obtenir une solution à 1 mM. Mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que la solution est jaune clair homogène. Protéger la Coupe de la lumière. Diluer le FURA-deux heures solution mère dans 1 ml Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine à une concentration finale de 4 uM pour le chargement des cellules HeLa. </li><li> Préparer une solution stock de 12,5 mM puromycine dans l'eau distillée (pH 7,0). Aliquotes Conserver à -20 ° C. Diluer la solution 12,5 mM puromycine stock dans la mémoire tampon sans calcium à une concentration finale de 500 uM puromycine. </li><li> Dissoudre thapsigargine dans le DMSO pour obtenir une solution à 1 mM. </li><li> Solubiliser 1 mg ophiobolin A dans 20 ul de chloroforme et, ultérieurement, mélanger avec 25 ul de DMSO. Le microtube reste ouverte jusqu'à chloroforme est évaporé. Ainsi, la dernière ophiobolin Une concentration est de 100 mm. Aliquotes Conserver à -20 ° C. Avant l'utilisation, des solutions diluées d'actions en calcium sans tampon à une concentration finale de 100 uM. Ainsi, la concentration finale de DMSO pour l'imagerie de cellules vivantes ne dépasse pas 0,1%. </li><li> Dissoudre trifluopérazine dans le DMSO à une concentration de 10 mM et stocker des aliquotes à -20 ° C. Des solutions diluées d'actions en calcium sans tampon à une concentration finale de 10 uM avant l'utilisation. Ainsi concentration finale de DMSO pour l'imagerie de cellules vivantes, comme pour ophiobolin A, ne dépasse pas 0,1%. </li><li> Dissoudre les siRNA (SEC61A1 siARN, SEC61A1-UTR siRNA et siRNA contrôle) en eau libre de RNase pour préparer une solution stock de 20 pM. Mélanger à l'aide d'un vortex et d'observer la solubilisation par l'œil. Magasin de 50 aliquotes à -20 ° C. </li></ol> 2. Extinction de gène dans les cellules HeLa Afin d'étudier l'apport d'une certaine protéine d'ER d'efflux de Ca 2 +, le gène respectives doit être efficacement réduit au silence avec deux siRNA différents (Fig. 1). En outre, l'effet de l'inactivation doit être surmontée par l'expression du gène de type sauvage respectif. Typiquement, nous utilisons des siRNA qui sont dirigées contre le codage et la non-codantes (UTR) région, respectivement, du gène d'intérêt. Employant UTR-dirigé siARN fournit un moyen commode pour la complémentation. <ol><li> Seed 5,2 x 10 5 cellules HeLa (ATCC pas. CCL-2) dans une boîte de culture de 6 cm avec un glissement de 25 mm de couverture (pré-traitées avec 200 pi de poly-L-lysine (1 mg / ml) pendant 1 h) dans Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine et incuber à 37 ° C dans un environnement humidifié avec 5% de CO 2 (volume final 3,9 ml). </li><li> Transfecter les cellules avec SEC61A1 siARN, SEC61A1-UTR siARN, ou un siRNA contrôle négatif en utilisant le réactif HiPerFect conformément aux instructions du fabricant (concentration finale de siRNA: 20 nM). En bref, préparer siRNA fraîchement dans un microtube distincte avant la procédure de transfection réelle: Ajouter 20 ul de réactifs de transfection HiPerFect à 4 pl de chaque siARN (20 uM), qui est dissous dans 80 ul de OptiMEM. Ce mélange est doucement agité et incubé à température ambiante pendant 10 min. Ajouter le mélange de siRNA (104 ul) goutte à goutte à l'5,2 ensemencé x 10 5 cellules HeLa (3,9 ml). </li><li> Après 24 h, changer le milieu (3,9 ml) et transfecter des cellules pour une deuxième fois avec le mélange de siARN mêmes (104 pl). </li><li> Évaluer taire par analyse Western blot. Il devrait être supérieure à 80%. Laver les cellules de la boîte de culture de cellules dans un tampon phosphate salin (PBS) et les récolter en DMEM. Compter les cellules en utilisant le compteur cellulaire automatisé comtesse. Lyse des cellules dans un tampon de lyse cellulaire (10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, pH 8,0, MgCl2 3 mM, 0,5% NP40) complété avec un cocktail de protéase-inhibiteur (3 ug / ml pepstatine A, 3 mg / ml de leupeptine, 3 pg / ml antidouleur, 3 ug / ml Chymastatin) et mélanger avec SDS-tampon d'échantillon (60 mM Tris-HCI, pH 6,8, SDS 2%, glycérol 10%, 5% β-mercaptoéthanol, 0,01% bleu de bromophénol ) pour obtenir une concentration finale de 10.000 cellules / ul. Échantillons de chaleur à 56 ° C pendant 15 minutes et, ensuite, ajouter quelques perles de verre et de vortex pendant 20 min pour un fragment d'ADN. Séparée 20 ul de chaque échantillon par un type Laemmli SDS-PAGE (typiquement 15% de polyacrylamide pour le gel de séparation). Transfert protéines séparées sur une membrane de PVDF par électrotransfert («wet-blot") à prix constants 400 mA pendant 3 h ou toute la nuit dans un tampon de transfert (100 mM glycine, 12,5 mM de Tris-HCl). Ensuite, un bloc de 5% (p / v) lait faible en gras séché dans du PBS pendant 30 min à température ambiante, puis d'exposer la tache à l'anticorps primaires dirigés contre l'extrémité C-terminale Sec61α de lapin et un anti-β-actine d'anticorps de souris. Lavez la tache dans PBS-TritonX-100 (0,05%) et tWICE dans du PBS pendant 5 min, respectivement. Visualisez les anticorps primaires en utilisant ECL Plex chèvre anti-IgG de lapin-Cy5 ou ECL Plex chèvre anti-IgG de souris-Cy3-conjugué et le système d'imagerie Typhoon-Trio en combinaison avec l'image Quant TL 7.0 du logiciel. Dans le cas du gène SEC61A1, l'effet maximal taire est généralement considérée 96 h après la transfection d'abord. Une expérience représentative est montré dans la Fig. 2. </li></ol> 3. La complémentation des cellules HeLa Afin de sauver le phénotype des SEC61A1 taire, l'ADNc a été inséré dans SEC61A1 le site de clonage multiple (MCS) d'un site interne d'entrée pCDNA3-ribosomiques (IRES)-GFP-vecteur qui contenait le cytomégalovirus (CMV), le MCS, l'IRES, plus la protéine fluoresecent verte (GFP) séquence codante. <ol><li> 48 h après la transfection de siRNA d'abord, l'échange de la moyenne (3,9 ml) pour une deuxième fois et transformer les cellules avec soit vecteur vide ou SEC61A1 plasmide d'expression en utilisant Fugene HD selon le protocole du fabricant (rapport final de vecteur à Fugene HD est de 4 mg vectoriel à 16 ul HD Fugene). En bref, préparer les plasmides fraîchement dans un microtube distincte avant la procédure de transformation: Ajouter 16 ul réactif Fugene transformation HD à 4 pg de chaque plasmide qui est dissous dans 80 ul de OptiMEM. Vortexer doucement ce mélange et laisser incuber à température ambiante pendant 10 min. Ajouter le mélange de plasmide (0,1 ml) goutte à goutte au ensemencé 5,2 x 10 5 cellules HeLa (3,9 ml). </li><li> Après 48 h de plasmide d'expression, des boîtes de culture soumis à la microscopie par fluorescence avant l'imagerie calcique et la récolte. Si nécessaire, remplacer DMEM par PBS pour une meilleure signaux de fluorescence. Enregistrer des images de fluorescence sur un microscope à fluorescence équipé d'une caméra CCD refroidie. Efficacité de transformation peut être déterminée en divisant le nombre de cellules présentant fluorescence de la GFP par les cellules comptées dans le mode clair et devrait être supérieur à 80%. Un résultat typique est montré dans la Fig. 3. </li></ol> 4. Direct imagerie calcique cellulaire <ol><li> Avant la mesure, le transfert de la lamelle revêtement avec des cellules HeLa transfectées dans une boîte de culture séparée 3,5 cm. Chargez les cellules avec 4 pM FURA-deux heures dans 1 ml de DMEM pendant 45 min à 25 ° C dans l'11,12 sombre. </li><li> Correction d'un bordereau de 25 mm de couverture dans la chambre de métal iMic et laver les cellules deux fois et les incuber dans un tampon sans calcium (à chaque fois 300 pl.) </li><li> Commencer à recueillir des données sur un microscope iMic polychrome V par alternance passionnante à 340 nm et 380 nm et en mesurant la fluorescence émise à 510 nm (set de filtre: lame séparatrice, 565 nm; émetteur, nm 605/70). Exemples d'images contenant de 20 à 50 cellules / image toutes les 3 s. Enregistrement Fura-2 signaux que le ratio F340/F380, où F340 et F380 correspondent à l'arrière-plan soustrait l'intensité de fluorescence à 340 et 380 nm, respectivement. </li><li> Après 1 min, traiter les cellules avec puromycine (500 uM) en calcium sans tampon ou avec le même tampon. Sinon, le traitement des cellules avec un inhibiteur de petite taille (par exemple 10 ou 100 uM trifluopérazine uM ophibolin A) ou avec le tampon sans calcium. </li><li> Après les mesures ratiométrique sont effectuées pour 2 ou 10 min, ajouter thapsigargine (1 pM) et de continuer les mesures. </li><li> Finalement, cytoslic [Ca 2 +] est estimée à partir de mesures du rapport par une méthode d'étalonnage établie 2. Analyser les données par Excel 2007 et d'origine 6.1. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Jusqu'ici, nous avons abordé la question de savoir si silençage du gène affecte SEC61A1 calcium (Ca 2 +) des fuites à partir du RE (figure 1). Le gène a été réduit au silence SEC61A1 par deux différents siRNA dans les cellules HeLa pendant 96 heures. Alors que faire taire la croissance cellulaire à peine touché et la viabilité, le transport des protéines dans le RE de cellules de semi-perméabilisées était presque complètement inhibée. En outre, les cellules SEC61A1 silence ont été gravement touchées à l'égard de Ca 2 + de fuite de l'ER. L'effet de l'inactivation des gènes a été infirmée par l'expression du gène SEC61A1. Ainsi, Sec61 complexes qui sont présents dans la membrane du RE de toutes les cellules nucléées forme Ca 2 + canaux de fuite qui peut être appelé à jouer un rôle crucial dans l'homéostasie du Ca 2 +. Toutefois, la présence de grandes, de l'eau des pores remplis avec la perméabilité aux ions incontrôlée, comme formé par Sec61 complexes dans la membrane du RE, pourrait nuire sérieusement à la libération régulée de Ca 2 + de la lumière du RE dans le cytosol, un mécanisme essentiel pour intracellulaire signalisation. Nous avons identifié une calmoduline (CaM) motif de liaison à la fraction N-terminale cytosolique de Sec61α mammifères que Cam liés mais pas de Ca 2 + libre apocalmodulin avec une affinité nanomolaire et une spécificité de séquence. Au niveau cellulaire, deux antagonistes CaM différents stimulé Ca (fig. 4 et 5). Ce dernier n'a pas été observée lorsque Sec61 canaux étaient présents qui contenait des mutations dans le motif de QI de Sec61α. Ainsi, le Ca 2 +-CaM est impliqué dans la limitation des fuites de Ca 2 + du RE (Fig. 6). <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Organigramme. Voir le texte pour plus de détails. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. L'analyse des données pour faire taire l'efficacité. Taire a été évaluée par Western-blot utilisant des anticorps qui ont été dirigées contre Sec61α et β-actine (contrôle du chargement). Les anticorps primaires ont été visualisées en utilisant des anticorps ECL Plex secondaire et l'imagerie de fluorescence. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. L'analyse des données d'efficacité de la transfection. Les images ont été enregistrées sur un microscope à fluorescence équipé d'une caméra CCD refroidie. Efficacité de transformation peut être déterminée en divisant le nombre de cellules présentant fluorescence de la GFP par les cellules comptées dans le mode fond clair. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Les captures d'écran la figure 4. Partir de l'imagerie cellulaire du calcium en direct de cellules HeLa en présence du contrôle ou des SEC61A1-siRNA et la présence ou l'absence des cellules CaM-antagoniste ophiobolin HeLa A. ont été traités avec siRNA dirigé contre SEC61A1 (B) ou une siRNA contrôle négatif (A) pour 96 h comme indiqué. Ces cellules ont été chargées avec l'indicateur de calcium fura-2 AM et incubés dans un tampon de Ca 2 + libre contenant 0,5 mM, EGTA, puis tampon ou ophiobolin A (Ophio A) dans le tampon a été ajouté et l'incubation a repris. Après 10 min, Ca 2 + communiqué a été initié par l'application thapsigargine (TG) en l'absence de Ca 2 + externe et l'incubation a été poursuivie. Les captures d'écran de l'imagerie calcique en continu ont été prises à l'heure indiquée. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. L'analyse des données pour des expériences d'imagerie de cellules vivantes de calcium. (A) L'analyse cinétique et quantitative d'une série d'expériences comme le montre la Fig. 4A. Cytoslic [Ca 2 +] a été estimée à partir de mesures du rapport par une méthode d'étalonnage établie 2. L'effet de thapsigargine est montré sous forme de diagramme à barres. (BD) Les cellules ont été traitées avec le siRNA contrôle ou le siRNA-indiquée SEC61A1 pendant 48 h puis transformé avec le vecteur de contrôle soit (C), ou SEC61A1 plasmide d'expression (C), ou mutant SEC61A1 plasmide d'expression (D) comme indiqué. Après 48 h, des expériences d'imagerie calcique ont été réalisées comme dans les figures 4 et 5A. L'analyse statistique des changements dans le Ca 2 + cytosolique de concentration après l'ajout de thapsigargine dans des expériences telles que présentées dans A sont représentés. Les valeurs de p &lt;0,001 ont été définis comme significatifs par un test t non apparié et sont indiqués par trois astérisques (***), ns, non significatif. Le nombre de cellules qui ont été analysés sont indiqués. Les valeurs moyennes sont donnés, barres d'erreur représentent les erreurs standard des moyens (SEM). Nous notons que ces exemples ont été adaptés de réf. 13. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig6.jpg" alt="Figure 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 6"> Figure 6. Ces données indiquent que la libération des chaînes naissantes du complexe Sec61 conduit en effet à la libération du calcium du RE et de la formation d'un nanodomain de calcium autour de la bouche cytosolique du complexe Sec61. Ce calcium est lié par la calmoduline et calcium-calmoduline ferme le complexe Sec61. "

<ol><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li>
<li>Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+and+physiological+Ca2%2B+leak+from+the+endoplasmic+reticulum+of+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).</li>
<li>Van Coppenolle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-translocon+complex+mediates+calcium+leakage+from+endoplasmic+reticulum+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores.</a> J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).</li>
<li>Flourakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+calcium+leak+via+translocon+is+a+first+step+for+iPLA2-pathway+regulated+store+operated+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Passive calcium leak via translocon is a first step for iPLA2-pathway regulated store operated channel activation.</a> FASEB J. 20, 1215-1217 (2006).</li>
<li>Giunti, R., Gamberucci, A., Fulceri, R., Banhegyi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+translocon+and+a+cation+channel+are+involved+in+the+passive+Ca2%2B+leak+from+the+endoplasmic+reticulum%3A+a+mechanistic+study+on+rat+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Both translocon and a cation channel are involved in the passive Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum: a mechanistic study on rat liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 462, 115-121 (2007).</li>
<li>Ong, H. L., Liu, X., Sharma, A., Hegde, R. S., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+release+via+the+ER+translocon+activates+store+operated+calcium+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ release via the ER translocon activates store operated calcium entry.</a> Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 453, 797-808 (2007).</li>
<li>Amer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocon+closure+to+Ca2%2B+leak+in+proliferating+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Translocon closure to Ca2+ leak in proliferating vascular smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 296, 910-916 (2009).</li>
<li>Tu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilins+form+ER+Ca2%2B+leak+channels%2C+a+function+disrupted+by+familial+Alzheimer%27s+disease-linked+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presenilins form ER Ca2+ leak channels, a function disrupted by familial Alzheimer's disease-linked mutations.</a> Cell. 126, 981-993 (2006).</li>
<li>Hamman, B. D., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiP+maintains+the+permeability+barrier+of+the+ER+membrane+by+sealing+the+lumenal+end+of+the+translocon+pore+before+and+early+in+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation.</a> Cell. 92, 747-758 (1998).</li>
<li>Alder, N. N., Shen, Y., Brodsky, J. L., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+underlying+BiP-mediated+gating+of+the+Sec61+translocon+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 168, 389-399 (2005).</li>
<li>Aneiros, E., Philipp, S. E., Lis, A., Freichel, M., Cavalie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Ca2%2B+signalling+by+Na%2B%2FCa2%2B+exchangers+in+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Modulation of Ca2+ signalling by Na+/Ca2+ exchangers in mast cells.</a> J. Immunol. 174, 119-130 (2005).</li>
<li>Gross, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC5+is+a+Ca2%2B-activated+channel+functionally+coupled+to+Ca2%2B-selective+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">TRPC5 is a Ca2+-activated channel functionally coupled to Ca2+-selective ion channels.</a> J. Biol. Chem. 284, 34423-34432 (2009).</li>
<li>Erdmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+calmodulin+with+Sec61a+limit+Ca2%2B+leakage+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction of calmodulin with Sec61a limit Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> EMBO J. 30, 17-31 (2011).</li>
</ol>

Dans les cellules de mammifères, le réticulum endoplasmique (RE) joue un rôle clé dans la biogenèse des protéines ainsi que dans la signalisation du calcium. Ici, nous avons décrit un système expérimental qui nous permet d&#39;aborder directement le rôle d&#39;un potentiel de Ca 2 + canal de fuite et de caractériser son putatifs des mécanismes de régulation 13. Ce système expérimental nous donne l&#39;occasion unique de i) évaluer la contribution des différentes protéines de la membrane passive ER à l&#39;efflux de Ca 2 + du RE dans divers types cellulaires, ii) de caractériser les protéines et les mécanismes qui limitent cette passive de Ca 2 + efflux, et iii) étudier les effets des mutations dans les maladies liées composantes pertinentes. Nous notons que seules les cellules viables devraient être analysés et que la viabilité globale devrait être supérieure à 80%. Par conséquent, la viabilité cellulaire est évaluée régulièrement employant nucléaires ID réactif bleu / vert viabilité des cellules selon le protocole du fabricant. Par ailleurs, l&#39;analyse statistique des changements dans le cytosol concentration de Ca2 + est obligatoire. Par conséquent, les expériences doivent être réalisées pour quatre lots différents de cellules et de deux lamelles avec au moins 20 cellules doivent être analysés pour chaque condition dans une expérience unique. Nous notons que les différentes expériences doivent être réalisées au même moment après l&#39;ensemencement sur les feuillets de couverture.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> DMEM + glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 31966 </td></tr><tr><td> OptiMEM + glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 51985 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> AAP </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> HiPerFect </td><td> Qiagen </td><td> 301707 </td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 04709713 </td></tr><tr><td> Nucléaire-ID Bleu / Vert réactif viabilité cellulaire </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ENZ-53004 </td></tr><tr><td> FURA-deux heures </td><td> Invitrogen </td><td> F-1221 </td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Sigma </td><td> P 7255 </td></tr><tr><td> Thapsigargine </td><td> Invitrogen </td><td> T-7459 </td></tr><tr><td> Un Ophiobolin </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ALX-270-109 </td></tr><tr><td> Trifluopérazine </td><td> Sigma </td><td> T 6062 </td></tr><tr><td> Comtesse ® Compteur de cellules automatisé </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Typhon-Trio système d&#39;imagerie </td><td> GE Healthcare </td><td></td></tr><tr><td> TE2000-S microscope avec caméra DS-5Mc </td><td> Nikon </td><td></td></tr><tr><td> Microscope iMic polychrome V </td><td> Jusqu&#39;à la photonique </td><td></td></tr></tbody></table>

direct imagerie calcique cellulaire combiné avec gene silencing siarn mediated identifie ca 2 + canaux de fuite dans la membrane du re et de leurs mécanismes de régulation

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Dans les cellules de mammifères, le réticulum endoplasmique (RE) joue un rôle clé dans la biogenèse des protéines ainsi que dans la signalisation calcique 1. Le hétérotrimériques Sec61 complexe dans la membrane du RE fournit une voie aqueuse pour les polypeptides nouvellement synthétisés dans la lumière du RE. De récents travaux de différents laboratoires a suggéré que ce complexe peut également hétérotrimériques forme transitoire canaux Ca 2 + fuite de 2-8. L&#39;observation clé de cette idée était que la libération des polypeptides naissants du ribosome et Sec61 complexes par la puromycine conduit à libération transitoire de Ca 2 + du RE. Par ailleurs, il avait été observé in vitro que la protéine de ER luminale BiP est impliqué dans la prévention de la perméabilité aux ions au niveau de l&#39;Sec61 9,10 complexes. Nous avons établi un système expérimental qui nous permet d&#39;aborder directement le rôle du complexe Sec61 que le potentiel de Ca 2 + canal de fuite et de caractériser les mécanismes de régulation de ses putatifs 11-13. Ce système combine gene silencing siRNA médiation et de cellules vivantes de Ca 2 + imagerie 13. Les cellules sont traitées avec des siRNA qui sont dirigées contre le codage et la région non traduite (UTR), respectivement, du gène ou de SEC61A1 un siRNA contrôle négatif. Dans l&#39;analyse de complémentation, les cellules sont co-transfectées avec un vecteur d&#39;IRES-GFP qui permet à l&#39;ARNsi résistant expression de type sauvage SEC61A1 gènes. Puis les cellules sont chargées avec le ratiométrique Ca 2 +-indicateur de fura-2 pour surveiller simultanément les changements dans les cytosolique de Ca 2 + concentration dans un nombre de cellules au moyen d&#39;un microscope à fluorescence. La mesure en continu de Ca 2 + cytosolique permet également à l&#39;évaluation de l&#39;impact de divers agents, tels que la puromycine, inhibiteurs de petites molécules, et thapsigargine le Ca 2 + de fuite. Ce système expérimental nous donne l&#39;occasion unique de i) évaluer la contribution des différentes protéines de la membrane passive ER à l&#39;efflux de Ca 2 + du RE dans divers types cellulaires, ii) de caractériser les protéines et les mécanismes qui limitent cette passive de Ca 2 + efflux, et iii) étudier les effets des mutations dans les maladies liées composantes pertinentes.

Le réticulum endoplasmique joue un rôle clé dans la biogenèse des protéines et dans l&#39;homéostasie calcique. Nous avons établi un système expérimental qui nous permet d&#39;aborder le rôle des canaux Ca2 + de fuite et de caractériser leur putatifs mécanismes de régulation. Ce système implique gene silencing siRNA médiation et de cellules vivantes Ca2 + imagerie.

Direct imagerie calcique cellulaire Combiné avec Gene Silencing siARN Mediated Identifie Ca 2 + Canaux de fuite dans la membrane du RE et de leurs mécanismes de régulation

Dans les cellules de mammifères, le réticulum endoplasmique (RE) joue un rôle clé dans la biogenèse des protéines ainsi que dans la signalisation calcique1. Le complexe hétérotrimérique Sec61...

Dans les cellules de mammifères, le réticulum endoplasmique ou RE joue un rôle important dans la biogenèse des protéines et la signalisation calcique. Le complexe hétérotrimère Sec61 dans la membrane du RE fournit un passage aqueux permettant aux polypeptides nouvellement synthétisés d'entrer dans la lumière du RE. De récentes données suggèrent que Sec61 pourrait également former des canaux de fuite calciques transitoires afin d'étudier directement le rôle du complexe Sec61 en tant que canal de fuite calcique potentiel.Et pour caractériser ses mécanismes régulateurs putatifs, les cellules sont d'abord traitées par des ARNsi dirigés contre le gène sex 61 A one. Dans l'analyse de complémentation, les cellules sont cotransfectées avec un vecteur iris GFP qui permet l'expression, résistante à l'ARNi, du gène sauvage sex 61 A one. Ensuite, les cellules sont chargées avec l'indicateur rapportométrique de calcium RO two, et les variations de la concentration cytosolique de calcium sont suivies par microscopie de fluorescence.Alors que les niveaux de calcium sont mesurés, des changements de solution sont effectués afin d'évaluer l'impact de divers agents tels que les antagonistes de la calmoduline et les fab fragments d'argon sur les fuites de calcium. L'analyse quantitative des images obtenues révèle les modifications du flux de calcium F induites par l'inactivation de sex 61 A un. Dans cette vidéo, un modèle du rôle de sex 61 A un dans le flux de calcium F sera présenté, après la démonstration de la procédure et l'exposé des résultats.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les expériences de bio-lipides planétaires ou les mesures en canal unique, réside dans le fait que les protéines membranaires candidates peuvent être analysées dans leur environnement naturel, sans purification fastidieuse ni réintégration fonctionnelle généralement inefficace. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation calcique, telles que, par exemple, quelle est la contribution d'une protéine membranaire spécifique du réticulum endoplasmique au flux de calcium provenant du réticulum endoplasmique dans différents types cellulaires, et comment sont-elles régulées ? La démonstration de la procédure sera assurée par Sway Long et NICO, deux étudiants diplômés talentueux de nos laboratoires. Commencez cette procédure en préparant les solutions et les réactifs à utiliser. Tout d'abord, préparez le tampon sans calcium conformément aux instructions du protocole écrit joint.Ensuite, diluez une solution mère de l'indicateur calcique. Ajoutez 2 µL de Fura 2 à 1 mL de DMEM contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine pour obtenir une concentration finale de quatre micromoles. Diluez une solution mère d'Apso Garin à 1 millimolaire dans un tampon sans calcium pour obtenir une concentration finale de trois micromoles. Préparez également 200 micromoles d'oléine A et 20 micromoles afin de réduire le risque d'effets hors cible d'un ARNi particulier. Deux ARN interférents différents sont utilisés pour inhiber chaque gène afin d'évaluer d'éventuels effets secondaires de la procédure de transfection.Des ARNsi de contrôle négatif, composés d'une séquence aléatoire de nucléotides, sont transfectés en parallèle avec les ARNsi expérimentaux. Il est important que l'effet du silençage médié par ARNsi puisse être récupéré par l'expression de l'ADNc de type sauvage. Par conséquent, les ARNsi utilisés pour l'expérience sont spécifiquement choisis de sorte que le plasmide de récupération ne soit pas affecté par les ARNsi. Dans cette expérience, les ARNsi sont dirigés contre la région codante et la région non codante ou région non traduite, abrégée en UTR, du gène d'intérêt.Lorsque les ARNsi sont dirigés contre le sauvetage par la région UTR, des plasmides dépourvus de la région UTR endogène peuvent être utilisés pour effectuer la transfection dans des cellules HeLa. Préparez les cellules pour la transfection en plaçant un coverslip de 25 millimètres recouvert de polylysine dans une boîte de culture cellulaire de six centimètres pour chaque transfection ; après une heure, ajoutez 5,2 × 10⁵ cellules HeLa et du DMEM supplémenté dans chaque boîte. Pour transfecter les cellules, étiquetez un tube microcentrifuge.Pour chaque réaction de transfection, ajouter à chaque tube quatre microlitres de S irna à 20 micromolaire dissous dans 80 microlitres d'OptiMEM. Les échantillons SEC 61 A un, sex 61 A un UTR et l'irna de contrôle négatif sont préparés dans chaque tube. Ajouter 20 microlitres de réactif de transfection Hyperfect, vortexer doucement, puis incuber les réactions à température ambiante pendant 10 minutes. Pour transfecter les cellules, ajouter goutte à goutte le mélange d'irna (104 microlitres au total) aux cellules Hela en culture et agiter doucement la boîte pour assurer une distribution uniforme des complexes de transfection.Incuber à 37 degrés Celsius dans un environnement humidifié contenant 5 % de dioxyde de carbone. Après 24 heures, remplacer le milieu par 3,9 millilitres de milieu frais. Ensuite, afin d'augmenter l'efficacité de la transfection, réaliser une seconde transfection en utilisant le même mélange d'ARNi. Pour évaluer l'inhibition, effectuer une analyse par immunotransfert.L'efficacité de l'extinction doit être supérieure à 80 %, comme illustré ici pour sex 61 A un. L'effet d'extinction maximal est généralement observé 96 heures après le premier transfectage, 48 heures après le premier transfectage préparé pour restaurer le phénotype résultant de l'extinction de sex. 61, commencez par étiqueter un nouveau tube de microcentrifugeuse.Pour chaque réaction, les cellules seront maintenant transfectées soit avec un vecteur vide, soit avec un plasmide d'expression du type sauvage sex. 61 A un. Le plasmide d'expression de type sauvage utilisé ici a été généré en insérant le cDNA de sex 61 A un dans le site de clonage multiple d'un pcd.Un vecteur GFP à trois entrées ribosomiques internes contenant le promoteur du cytomégalovirus, l'iris ainsi que la séquence codant pour la protéine fluorescente verte. Préparer le réactif de transfection en ajoutant quatre microgrammes de chaque plasmide dissous dans 80 microlitres d'OptiMEM à chaque tube. Puis ajouter à ceci 16 microlitres de réactif de transfection FuGENE HD, vortexer doucement cette solution et l'incuber à température ambiante pendant 10 minutes.Ensuite, après avoir changé le milieu, ajouter goutte à goutte le mélange de plasmide aux cellules Heli fixées (5,2 × 10⁵) et agiter doucement la boîte pour assurer une répartition uniforme des complexes de transfection. Placer les cellules à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone, puis incuber pendant 48 heures supplémentaires. Pour déterminer l'efficacité de la transfection, évaluer l'expression de la GFP par microscopie à fluorescence.Après 48 heures, au moins 80 % des cellules doivent être transfectées. Avant l'acquisition d'images, utilisez une pince pour transférer les lamelles portant les cellules HeLa transfectées dans une nouvelle boîte de culture cellulaire de 3,5 centimètres et ajoutez un millilitre de DMEM contenant quatre micromolaire.Si vous êtes à 2:00 du matin, incubez pendant 45 minutes à 25 degrés Celsius à l'obscurité. Pour effectuer l'imagerie, transférez la lame couvre-objet portant le plus petit nombre de cellules chargées dans une chambre d'enregistrement en métal et fixez-la en vissant les deux parties de la chambre ensemble. À l'aide d'une pipette, ajoutez et retirez 300 microlitres de tampon sans calcium sur les cellules afin de les laver.Répétez, puis montez la chambre d’enregistrement sur un microscope I MIC équipé d’un cinq crémateur polychrome. À l’aide d’un jeu de filtres pour URA deux, recherchez un champ contenant au moins 20 cellules afin d’estimer la fluorescence indépendante du calcium de FU A deux. La longueur d’onde d’excitation utilisée lors de cette étape est de 360 nanomètres.Une fois qu'un champ approprié est sélectionné, configurez le logiciel d'imagerie pour exciter à 340 nanomètres et 380 nanomètres et mesurer la fluorescence émise à 510 nanomètres toutes les trois secondes. Réglez le temps d'exposition de manière à obtenir des intensités de fluorescence d'environ 1000 unités arbitraires pour le dispositif présenté ici. Un temps d'exposition de cinq millisecondes est défini. En outre, délimitez les régions d'intérêt (ROIs) pour une zone de fond sans cellules ainsi que pour jusqu'à 20 contours cellulaires.Commencez l'imagerie de cellules vivantes pendant que l'expérience est en cours ; le système affichera les images rapport métrique pour moins de deux signaux ainsi que les rapports F340/F380 en temps réel pour chaque ROI marquée sous forme de graphique linéaire, où F340 et F380 correspondent à l'intensité de fluorescence dans les ROI à 340 et 380 nanomètres respectivement. Après une minute, ajoutez les solutions d'essai dans la chambre d'imagerie afin de tester différents paramètres expérimentaux. Dans ces expériences, l'antagoniste de la calmoduline, le trifluorin et la bollin A sont testés après que des mesures rapport métrique ont été effectuées pendant 10 minutes supplémentaires.Pour les antagonistes modulaires de CAL, ajoutez du DSA gargan et poursuivez les mesures. Enregistrez 400 paires d'images par expérience. Une fois les images acquises, examinez-les et délimitez les régions d'intérêt (ROI) pour au moins 20 cellules par champ observé.Utilisez ensuite l'option d'analyse cinétique du logiciel pour créer une série d'images de rapport soustraites du fond et un graphique montrant la cinétique du rapport calcium soustraite du fond. Pour chaque ROI, exportez finalement les données vers Excel et Origin en utilisant une méthode de calibration établie. La concentration cytosolique en calcium peut être calculée à partir des mesures de rapport afin d'examiner si le gène sex 61 A influence les fuites de calcium depuis le réticulum endoplasmique.Le gène sex 61 A un a été silencé par deux ARN différents et des cellules helo pendant 96 heures. Le silencement a été évalué par analyse de sang Western de nombres cellulaires similaires en triple exemplaire comme indiqué ici, il y a un signal fort de 6 61 alpha dans les bandes une à trois et un signal significativement plus faible dans les bandes quatre à six et sept à neuf, correspondant aux cellules avec silence du gène 6 61 A un. Pour quantifier les résultats, les signaux de sex 61 alpha ont été normalisés aux signaux de bêta-actine, un silencement supérieur à 80 % a été obtenu afin de tester le rôle de la calmoduline dans le flux de calcium du RE.Une imagerie URA deux de cellules sexuelles 61 A traitées par l'hélo a été réalisée en présence ou en l'absence de l'antagoniste de la calmoduline, la bolline A. Ce film montre des cellules témoins traitées avec la bolline A, 10 minutes après le traitement par la bolline A. La libération calcique a été initiée par l'application de FSO Gargan, un inhibiteur circulaire qui révèle la libération de calcium depuis le réticulum endoplasmique en l'absence de calcium externe, comme on peut le voir ici.L'ajout d'argon FSA a entraîné une augmentation transitoire mais significative de la fluorescence, indiquant un flux de calcium F provenant du réticulum endoplasmique. En revanche, le flux de calcium F après l'ajout de garin FSO dans les cellules osseuses PHE, traitées par la sex 61 A une, est beaucoup moins marqué, comme on peut le voir ici. Cette différence est clairement visible sur ce diagramme, qui représente le calcium cytosolique estimé en fonction du temps dans une série de films. Les résultats quantitatifs présentés ici confirment une augmentation du flux de calcium dans les cellules témoins en réponse à l'argon thic en présence de bolin A, comme illustré dans ce diagramme en barres.Le même phénomène a été observé pour un second antagoniste de cam triazine. Toutefois, les effets des antagonistes de cam n'étaient pas présents lorsque le complexe sex 61 était éliminé des cellules par l'un ou l'autre des deux sex. 61 A un siARN spécifique, une récupération partielle de ce phénotype peut être observée lorsque les cellules silencieuses sex 61 A un ont été transfectées avec sex.61 un plasmide d'expression unique, comme on peut le voir ici. La réponse en calcium en présence d'agonistes de la calmoduline est partiellement restaurée par la transfection du plasmide de type sauvage insensible à l'ARNi. Ces résultats suggèrent que la calmoduline participe à la limitation du flux de calcium dans le réticulum endoplasmique au niveau d'un complexe de type sex 61 dans les cellules.Si tel est le cas, la transfection d’un gène sex 61 A un portant une double mutation dans le site de fixation de la calmoduline ne devrait pas permettre de corriger le phénotype induit par l’irna. En effet, lorsque les cellules ont été transfectées à l’aide d’un plasmide d’expression sex 61 A un portant une double mutation dans le motif IQ, aucune correction du phénotype n’a été observée globalement. Ces données indiquent que la libération des chaînes naissantes à partir du complexe sex 61 entraîne effectivement une libération de calcium depuis le réticulum endoplasmique et la formation d’un nano-domaine calcique autour de l’orifice cytosolique du complexe sex 61.Ce calcium est fixé par Cal Moulin, et le complexe calcium-Cal Moulin ferme le complexe sex 61. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de combiner un ARNi induisant le silençage génique dans des cellules humaines avec l'imagerie du calcium intracellulaire en suivant cette procédure. D'autres méthodes, comme l'expression de cDNAs portant des mutations associées à des maladies, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que l'impact potentiel de mutations liées à des maladies sur des composants cellulaires.Et n'oubliez pas que manipuler des médicaments tels que le tap peut être extrêmement dangereux, et que des précautions, comme le port de gants, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Direct imagerie calcique cellulaire Combiné avec Gene Silencing siARN Mediated Identifie Ca 2 + Canaux de fuite dans la membrane du RE et de leurs mécanismes de régulation (Vidéo) | JoVE Journal

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