Name: Mesure de la cohésion globale par tensiométrie surface du tissu (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Découvrez comment mesurer la cohésion intracellulaire dans des agrégats tissulaires 3D par tensiométrie de surface. Cette méthode quantifie l'énergie de liaison entre cellules et corrèle la tension superficielle à l'invasivité tumorale.

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1. La préparation globale pour la mesure de la tension de surface des tissus. Pour les cellules adhérentes, sphéroïdes peuvent être formées en utilisant soit la méthode goutte suspendue ou en générant une feuille cohérente de cellules qui peuvent ensuite être découpé en fragments 1 mm. La formation d'agrégats par la méthode de goutte pendante: <ol><li> Proche-confluentes cultures de cellules adhérentes doivent être cultivés à 90% de confluence, les monocouches quoi doivent être rincés deux fois avec du PBS. Après la vidange bien, ajoutez 2 ml (pour les plaques de 100 mm) de 0,05% de trypsine-1 mM EDTA, et incuber à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules se détacher. Arrêtez trypsinisation en ajoutant 2 ml de milieu complet et doucement l'utilisation d'une pipette 5 ml de triturer le mélange jusqu'à cellules sont en suspension. Transfert des cellules dans un tube de 15 ml conique. </li><li> Ajouter 40 ul d'une 10 mg / ml solution stock DNAse et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. Brièvement au vortex et centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes. </li><li> Rejeter le surnageant et laver culot avec 1 ml de culture de tissus milieu complet. Répéter, puis remettre les cellules en 2 ml de milieu de culture de tissu complet. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hématimètre, ou un compteur de cellules automatisé et d'ajuster la concentration de 2,5 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Retirez le couvercle d'une boîte de culture de tissu de 60 mm et placer 5 ml de PBS dans le fond du plat. Ceci agira comme une chambre de l'hydratation. </li><li> Inverser le couvercle et l'utilisation d'une pipette 20 ul de déposer 10 gouttes ul sur le fond du couvercle. Assurez-vous que des gouttes sont placées suffisamment éloignés afin de ne pas toucher. Il est possible de placer au moins 20 gouttes par plat. </li><li> Inverser le couvercle sur le PBS-remplie chambre inférieure et incuber à 37 ° C CO / 5% 2 / 95% d'humidité, de surveiller l'gouttes par jour et incuber jusqu'au feuilles cellule soit ou agrégats sont formés. </li><li> Une fois la forme des feuilles, ils peuvent être transférés à fond rond en verre Agitateur flacons contenant 3 ml de milieu complet et incubés dans un bain d'eau agité à 37 ° C et 5% de CO 2 jusqu'à la formation de sphéroïdes. </li></ol> La formation d'agrégats par la méthode feuille de cellules: <ol start="9"><li> Suspensions cellulaires simples sont préparés comme décrit ci-dessus, mais la concentration est ajustée à 1x10 6 cellules / ml. </li><li> Transfert de 3 ml de la suspension cellulaire à 10 ml ballons à fond rond (Belco, Vineland, NJ). </li><li> Incuber fioles dans un bain d'eau giratoire / agitateur (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) à 37 ° C, 5% de CO 2 de 4h à 120 rpm jusqu'à cellules récupérer trypsinisation. </li><li> Transfert des cellules à un tube à centrifuger en verre à fond rond et centrifuger à 200 xg dans une fine granulés. Incuber pendant 24 h un autre jusqu'à ce qu'une feuille de formes cohérentes. </li><li> Remuer doucement le tube de culture pour déloger la plaque et versez le contenu du tube de culture dans un petit plat en verre de culture stérile tissus. </li><li> Utilisez scalpels micro pour couper les feuilles en fragments de tailles différentes. </li><li> Incuber fragments à 37 ° C sur l'agitateur giratoire bain-marie à 120 rpm de moins de 5% de CO 2 pendant 2 à 3 jours ou jusqu'à ce qu'ils deviennent sphériques. </li></ol> 2. Mesure de la tension de surface totale <ol><li> Le tensiomètre surface du tissu. L'appareil est représenté dans les figures. 1 et 2. La cellule de compression (Fig. 3) est composé de deux chambres. La chambre extérieure (CO) est relié à une pompe à 37 ° C l'eau circule, et sert à réguler la température de la chambre intérieure (IC). Les chambres sont construites en Delrin broyé et comportent des fenêtres en quartz pour la visualisation de l'agrégat. Le montage inférieure (LA) vis dans la base de la chambre intérieure et est utilisé pour 1) la position de l'agrégat dans la chambre intérieure; 2) sceller le fond de la chambre intérieure; 3) d'élever l'agrégat de lancer la compression, et (4 ) contrôle la distance entre les plaques parallèles et donc la compression de l'agrégat. Le noyau central (CC) de l'assemblage est réglable. La pointe du noyau central (le piédestal) est composée de lisses en Teflon et agit comme la plaque de compression plus faible (LCP). La plaque de compression supérieur (UCP) est un cylindre en téflon 15mm de long qui pend au bras d'équilibre (B) par une flamme redressé nickel-chrome métallique (NCW) *. Au cours d'une expérience, l'agrégat de cellules (A) est positionné sur la plaque inférieure et soulevé jusqu'à ce qu'il touche la plaque supérieure. Le plateau supérieur est relié au bras de la balance (B). La compression de l'ensemble provoque un déplacement du balancier. L'équilibre est un Électrobalance Cahn / Ventron modèle d'enregistrement 2000, qui fonctionne sur le principe de l'équilibre nulle. Le pivot du bras de la balance a une armature dans un champ magnétique permanent. Lorsque la balance est en marche, il module en permanence le courant passant par l'assemblage électromagnétique, qui permet de maintenir l'équilibre du bras en position horizontale. Quand un objet est suspendu au bras de l'équilibre, la tension, dont le solde s'applique à maintenir le bras dans le Horizoposition de NTAL, est proportionnelle à peser l'objet. Cette tension mesure la force extérieure de compression appliquée à l'agrégat. La forme de l'agrégat est contrôlée par l'observation visuelle à travers un stéréoscope 25 x Nikon SMZ10A couplé à un ordinateur équipé d'une carte d'acquisition. Afin de minimiser l'adhérence des agrégats de cellules sur les plaques de compression, à la fois les plaques de compression inférieure et supérieure ont été recouvertes de poly (2-hydroxyéthylméthacrylate) {poly (HEMA)}, un matériau polymère à laquelle les cellules n'adhèrent pas 16. * Le fil est-flammes redressé par pendaison d'une longueur de 15 pouces de fil à partir d'un statif et une pince de serrage liant petite à la fin. Un bec Bunsen est alors monter et descendre la longueur du fil jusqu'à ce que le fil est rouge. Le fil redressé peut alors être coupé dans la longueur appropriée. Un petit crochet est formé par la flexion du fil d'environ ¼ de pouce de la fin en utilisant deux lames de rasoir. L'autre extrémité est ensuite insérée dans le canon de la plaque de compression plus faible. </li><li> La compression globale. <ol><li> La chambre intérieure est remplie de pré-chauffé en CO 2 indépendante milieu de culture tissulaire (Gibco / BRL, NY). </li><li> Granulats une taille allant de environ 200-300 μ sont positionnés sur la plaque de compression plus faible (figure 4A). Les agrégats sont chargés par l'aspiration d'un agrégat en milieu de culture tissulaire à mi-hauteur de la pointe d'une pipette Pasteur munie d'une ampoule de silicone, le transfert de la pipette à la chambre intérieure, et le positionnement de la pointe de la pipette au-dessus du PAFR. L'agrégat est alors doucement expulsés sur le LCP en pressant doucement l'ampoule. Alternativement, l'agrégat est autorisé à tomber par gravité sur la LCP. </li><li> La plaque de compression supérieur (UCP) est positionné au-dessus du total et a permis de régler, en établissant un pré-compression de base apparente de poids UCP. </li><li> Le LCP est alors soulevé jusqu'à ce que l'agrégat est comprimé contre l'UCP (figure 4B). Réglage de la hauteur de l'âme intérieure de l'appareil sera inférieure de contrôle différents degrés de compression. La compression est contrôlée par l'observation à travers un microscope à dissection équipé d'une caméra vidéo CCD. </li><li> Des images globales sont capturés, numérisés et analysés à l'aide d'ImageJ. Changement de poids apparente UCP est enregistrée en continu sur un enregistreur à bande, la réalisation de l'équilibre de forme étant désigné par le tassement de la production de tension de l'équilibre Cahn. Chaque agrégat est soumis à deux degrés différents de compression. </li></ol></li><li> Calcul de la tension de surface totale. A l'équilibre la forme, la cohésivité d'un agrégat de cellules comprimées entre des plaques parallèles à laquelle il n'adhère pas peut être obtenu à partir de l'équation de Young-Laplace (fig. 5), où σ est cohésivité, F est la force qui agit pour compresser l'agrégat , πr 3 2 est l'aire de la surface de l'agrégat sur ​​lequel s'exerce la force F, et R 2 et R 3 sont, respectivement, le rayon de l'équateur de l'agrégat comprimé et le rayon d'un arc de définir son profil de surface normale à la compression des plaques et s'étendant entre eux (fig. 6). Mesure de la force de compression et de la géométrie à la force et l'équilibre de forme et l'application de ces mesures à l'équation de Young-Laplace génère des valeurs numériques de la tension des tissus de surface apparente. Après avoir atteint l'équilibre et le calcul de σ 1, les agrégats sont décompressées et a permis d'aborder un second équilibre et de σ 2 est calculé comme décrit ci-dessus. </li><li> Confirmation de la liquidité globale. La tension de surface calculée d'un agrégat liquide, lorsqu'il est soumis à deux compressions différents restera constante. Dans ces agrégats du rapport de σ 2 / σ 1 sera égal à 1 et sera inférieur au ratio de la force appliquée à chaque compression successives (F 2 / F 1). En revanche, la tension de surface calculée d'un agrégat élastique obéir à la loi de Hooke et d'augmenter proportionnellement à la force appliquée. Pour les agrégats élastiques le ratio de σ 2 / σ 1 ne sera pas égal à 1, mais sera plutôt l'approche du ratio de F 2 / F 1. La tension de surface d'agrégats liquides sera également indépendant de la taille des agrégats 2,17. Seules des mesures dans laquelle la tension de surface est indépendante de la force appliquée et la taille sont utilisés pour calculer σ moyenne pour chaque lignée cellulaire. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: Voici un tableau des résultats du TCT typique pour des agrégats de fibroblastes prostate de rat (FPR) et le rat des cellules musculaires lisses de la prostate (RPSMC). Comme on peut le voir dans la Fig. 7 des agrégats de cellules du FPR ont une tension superficielle de 22,8 ± 1,1 dynes / cm. Par ailleurs, les valeurs moyennes tension de surface mesurée après compression 1 et 2 après compression étaient statistiquement identiCal lorsque comparés par un t-test apparié. Nous avons également comparé les ratios de σ 2 / σ 1 et F 2 / F 1 pour s'assurer que ces agrégats ne pas obéir à la loi de Hooke, comme ils le feraient si elles se comportaient comme des solides élastiques. Comme l'a démontré dans le tableau 1, le ratio de σ 2 / σ une approche en effet de 1,0. Par ailleurs, le ratio de F 2 / F 1 a été significativement plus importante que σ 2 / σ 1 (t-test apparié, p &lt;0,05), confirmant que ces agrégats ne pas obéir à la loi de Hooke et en fait se comporter comme des liquides. En revanche RPSMCs obéi loi de Hooke. Comme on le voit dans le tableau 1, le ratio de σ 2 / σ 1 est significativement supérieure à 1 et n'était pas statistiquement différente de celle de F 2 / F 1. Pour démontrer davantage de liquide comme le comportement, nous avons exploré la relation entre la tension superficielle (σ) et au volume global. Comme on peut le voir dans la Fig. 8, le volume est indépendant de sigma pour les cellules du FPR (droite de régression rouge, r 2 = 0,002), alors qu'il semble y avoir une certaine dépendance de sigma sur le volume pour RPSMCs (droite de régression bleu, r 2 = 0,146). Ces données confirment en outre que les agrégats du FPR se comporter de manière liquide comme, alors que ceux de RPSMCs semblent se comporter davantage comme des solides élastiques. Seuls ceux obtenus à partir de mensurations agrégats se comporter comme des liquides serait utilisée pour calculer la tension de surface. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Aperçu du tensiomètre surface du tissu. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Une vue plus détaillée de la chambre de tensiomètre (à droite). <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Vue schématique de la chambre de tensiomètre. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Images de non-compressé (A) et compressés (B) des agrégats. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. L'équation de Laplace. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig6.jpg" alt="Figure 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 6"> Figure 6. Schéma d'une gouttelette liquide comprimé entre deux plaques parallèles à laquelle il adhère mal, à l'équilibre forme. R 1 et R 2 sont les deux rayons de courbure principaux, à l'équateur de la goutte et dans un plan passant par son axe de symétrie, respectivement. R 3 est le rayon de la gouttelette zone circulaire de contact avec la plaque de compression soit. H est la distance entre les plaques de compression supérieurs et inférieurs. X est un côté d'un triangle rectangle avec R hypoténuse 2 s'étendant à un point de contact entre la surface de la goutte et la plaque de compression soit. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> σ 1 (dynes / cm ± SEM) </td><td> σ 2 (dynes / cm ± SEM) </td><td> Pσ 1 vs 2 σ </td><td> σ 1,2 (dynes / cm ± SEM) </td><td> σ 2 / σ 1 </td><td> F 2 / F 1 </td><td> Pσ 2 / σ 1 et F 2 F 1 </td></tr><tr><td> FPR </td><td> 22,6 ± 1,7 </td><td> 22,9 ± 1,4 </td><td> &gt; 0,05 * </td><td> 22,8 ± 1,1 </td><td> 1,04 ± 0,04 </td><td> 1,47 ± 0,06 </td><td> &lt;0,05 </td></tr><tr><td> RPSMC </td><td> 15,0 ± 2,8 </td><td> 23,0 ± 3,2 </td><td> 0,039 </td><td> NA </td><td> 1,9 ± 0,3 </td><td> 1,6 ± 0,1 </td><td> 0,16 * </td></tr></tbody></table> Figure 7. Mesures TCT et la confirmation de la liquidité globale pour les agrégats de fibroblastes de la prostate de rat et les cellules musculaires lisses. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig8.jpg" alt="Figure 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 8"> Figure 8. Relation entre sigma et le volume des agrégats du FPR (ligne rouge) et RPSMCs (ligne bleue).

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</ol>

Mesure de la cohésion globale par TST est relativement simple. Il ya, cependant, les principales étapes qui doivent être maîtrisées afin de générer des données utilisables TST; 1) les agrégats doivent être &quot;saine&quot;. Ceci peut être contrôlé en assurant que la formation d&#39;agrégats commence avec les cellules qui sont à confluence optimale avant de détachement. La taille des agrégats et du temps dans la culture doit également être contrôlé pour minimiser le développement d&#39;un noyau nécrotique au sein de l&#...

<ul><li> l&#39;eau du bain / agitateur (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) </li><li> 10 ml ballons à fond rond (Belco, Vineland, NJ) </li></ul>

mesure de la cohésion globale par tensiométrie surface du tissu

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Mesure rigoureuse d&#39;énergie de liaison intercellulaire ne peut être faite en utilisant des méthodes fondées sur des principes thermodynamiques dans les systèmes à l&#39;équilibre. Nous avons développé tensiométrie surface du tissu (TST) spécifiquement pour mesurer l&#39;énergie libre de surface d&#39;interaction entre les cellules. Les concepts sous-jacents biophysiques TCT ont été décrits précédemment dans 1,2 détail. La méthode est basée sur l&#39;observation que les cellules mutuellement cohérente, si elle est maintenue en secouant la culture, sera s&#39;assemblent spontanément en clusters. Au fil du temps, ces grappes rondes jusqu&#39;à former des sphères. Ce comportement rafles imite le comportement caractéristique des systèmes liquide. Intercellulaire énergie de liaison est mesurée par la compression des agrégats sphériques entre les plaques parallèles dans un tensiomètre conçu sur mesure tissu de surface. La même équation mathématique utilisé pour mesurer la tension de surface d&#39;une gouttelette liquide est utilisé pour mesurer la tension de surface de la 3D des tissus tels que des agrégats sphériques. L&#39;équivalent cellulaire de la tension de surface liquide est l&#39;énergie de liaison intercellulaire, ou plus généralement cohésivité tissus,. Des études antérieures de notre laboratoire ont montré que la tension de surface du tissu (1) prédit comment deux groupes de cellules embryonnaires va interagir avec un autre 1-5, (2) peut fortement influencer la capacité des tissus à interagir avec des biomatériaux 6, (3) peut être modifié non seulement par la manipulation directe de la cadhérine-7 basée cohésion intercellulaire, mais aussi par la manipulation de molécules d&#39;ECM clés tels que FN 8-11 et 4) est en corrélation avec le potentiel invasif du cancer du poumon 12, fibrosarcome 13, 14 tumeur au cerveau et tumeur de la prostate lignées cellulaires 15. Dans cet article nous allons décrire l&#39;appareil, le détail les étapes nécessaires pour générer des sphéroïdes, de charger les sphéroïdes dans la chambre de tensiomètre, d&#39;initier une compression globale, et pour analyser et valider les mesures de tension superficielle des tissus générés.

Nous décrivons une méthode de mesure de l&#39;énergie de liaison, exprimable que la tension de surface des tissus, entre les cellules dans les tissus 3D-comme agrégats. Les différences de tension de surface de tissu ont été démontrés à corréler avec envahissement des poumons, les muscles et les tumeurs du cerveau, et sont des déterminants fondamentaux de l&#39;établissement de relations spatiales entre les différents types cellulaires.

Mesure de la cohésion globale par tensiométrie surface du tissu

Une mesure rigoureuse de l'énergie de liaison intercellulaire ne peut être effectuée qu'à l'aide de méthodes fondées sur les principes thermodynamiques dans des systèmes à l'équilibre. Nous...

Cette procédure montre comment mesurer la force de la cohésion intracellulaire dans des tissus tridimensionnels, tels que des agrégats. La première étape consiste à générer des agrégats de forme sphérique et à les transférer dans une boîte de Pétri remplie de milieu de culture tissulaire. Ensuite, des agrégats individuels sont aspirés dans une pipette en forme de spaghetti et chargés dans la plaque inférieure de compression de la chambre du tensiomètre.Ensuite, la plaque de compression supérieure est reliée à un fil de nickel-chrome, qui la connecte à la balance électronique et établit un poids de référence zéro appelé F zéro. L'expérience est lancée en relevant la plaque de compression inférieure jusqu'à ce que l'agrégat soit comprimé entre les plaques de compression inférieure et supérieure, et se termine lorsque les agrégats atteignent un équilibre de forme et de force, ou FEQ. Les étapes finales de la procédure consistent à capturer des images, mesurer la géométrie de l'agrégat et la force de résistance, puis à saisir ces mesures dans l'équation de Young-Laplace.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent des modifications de la cohésion tissulaire et la manière dont celles-ci pourraient influencer la dispersion tumorale ou le positionnement spatial entre différentes populations cellulaires, respectivement par des tests de dispersion d'agrégats ou des tests de tri cellulaire. Ainsi, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie tumorale, du développement embryonnaire et du génie tissulaire. Des questions telles que : Comment la cohésion tumorale influence-t-elle l'invasion maligne, la stratification des couches germinatives pendant la gastrulation ?Ou comment pouvons-nous réellement concevoir une cohésion permettant de générer des structures fonctionnelles analogues à des organes in vitro ? Les manipulations expérimentales impliquant la culture de cellules vivantes doivent être réalisées dans des conditions aseptiques, dans une hotte à flux laminaire dédiée. Des solutions stériles et du matériel de laboratoire stérile doivent être utilisés tout au long de l'expérience. Pour commencer cette expérience, récoltez les cellules adhérentes à 90 % de confluence.Commencez par aspirer le milieu de culture et rincez la couche cellulaire deux fois avec du PBS. Ensuite, aspirez le PBS et ajoutez deux millilitres de trips à 0,05 % dans une solution d’EDTA sur la monocouche. Placez la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et incubez jusqu’au détachement des cellules.Ensuite, retirez la plaque de l’incubateur et arrêtez la ization en ajoutant deux millilitres de milieu complet. Utilisez la pipette de cinq millilitres pour trier la mixture jusqu’à ce que les cellules soient complètement en suspension. Puis, transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres.Prélvez 40 microlitres d'une solution d'ADN à 10 milligrammes par millilitre et ajoutez-la à la suspension cellulaire. Incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Après l'incubation, vortexez brièvement la suspension cellulaire, puis centrifugez à 200 × g pendant cinq minutes. Une fois la centrifugation terminée, aspirez le surnageant et jetez-le. Ensuite, resuspendez le culot dans un millilitre de milieu complet et répétez la centrifugation pour laver le culot.Suspendez le culot dans un millilitre de milieu complet, puis effectuez un dénombrement cellulaire et, si nécessaire, ajustez la concentration de la suspension cellulaire à 1 × 10⁶ cellules par millilitre à l’aide de milieu complet et d’une pipette. Ajoutez trois millilitres de la suspension cellulaire dans un flacon rond de 10 millilitres et incubez dans un bain-marie agité à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre heures à 120 tours par minute, jusqu’à ce que les cellules se rétablissent après l’ionisation, comme en témoigne leur adhérence mutuelle formant de petits agrégats.Ensuite, transférez les cellules dans un tube à centrifuger en verre à fond rond et centrifugez à 200 fois la gravité pendant quatre minutes afin de former une fine couche après la centrifugation. Desserrez le bouchon du tube pour permettre les échanges gazeux, puis placez le tube dans l’incubateur de culture tissulaire. Incubez pendant 24 heures, au bout desquelles la couche devrait devenir cohérente.Après 24 heures, faites doucement gonfler le tube de centrifugeuse pour détacher la feuille. Versez ensuite le contenu du tube de culture dans une petite boîte de culture tissulaire stérile en verre. Utilisez des lames chirurgicales microchirurgicales pour découper la feuille cellulaire en fragments de tailles variées, puis transférez les fragments dans un flacon rond de 10 millilitres contenant trois millilitres de milieu de culture tissulaire.Incuber les fragments à 37 degrés Celsius dans un bain-marie agité à 120 tours par minute sous 5 % de dioxyde de carbone pendant deux à trois jours, ou jusqu’à ce qu’ils deviennent sphériques. La formation d’agrégats peut également être réalisée selon la méthode de la goutte suspendue. Selon le protocole publié précédemment, le dispositif TENSIOMÈTRE ou TST pour la surface tissulaire se compose de la chambre principale du tensiomètre contenant la cellule de compression, d’un bain d’eau permettant de maintenir la température de la chambre, d’un microscope stéréoscopique équipé d’une caméra CCD, d’une balance électronique pour automobile avec son alimentation électrique, et d’un enregistreur graphique.La cellule de compression du TST est composée de deux chambres, une chambre externe et une chambre interne. La chambre interne contient la plaque supérieure de compression et la plaque inférieure de compression recouvertes de poly(2-hydroxyéthyl méthacrylate). Tout d'abord, régler la pompe de circulation d'eau à 37 degrés Celsius et s'assurer que les tuyaux sont connectés aux orifices de la chambre externe.Ensuite, vissez l'ensemble inférieur, utilisé pour élever l'agrégat afin d'initier la compression dans la base de la chambre intérieure. Préparez ensuite un morceau de fil en nickel-chrome redressé à la flamme en suspendant une longueur de 15 pouces de fil à une potence et en fixant une petite pince à l'une de ses extrémités. Passez ensuite une flamme oxydante et un brûleur le long du fil, de haut en bas, jusqu'à ce que le fil rougisse.Utilisez des pinces coupantes pour couper le fil redressé à la longueur appropriée. Ensuite, utilisez deux lames de rasoir pour courber le fil d’environ un quart de pouce à partir de l’extrémité afin de former un petit crochet. Enfin, remplissez la chambre interne du TST avec un milieu de culture tissulaire indépendant du dioxyde de carbone qui a été dégazé par incubation à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.Utilisez une pipette pour déplacer toutes les bulles d'air qui se seraient formées sur la plaque de compression inférieure. L'appareil de TST est maintenant prêt pour l'expérience de compression de l'agrégat. Utilisez une pipette APA pour aspirer un agrégat cellulaire de 200 à 300 microns à partir de la plaque de culture.Ensuite, expulsez délicatement l'agrégat sur la plaque de compression inférieure située dans la chambre intérieure de l'appareil TST. Positionnez l'agrégat aussi près que possible du centre de la plaque de compression inférieure en le poussant doucement à l’aide d’un tube capillaire muni d’une petite boucle de cheveu. Connectez le fil de nickel-chrome monté sur un ensemble de plaque au bras de balance de la balance électrométrique enregistreuse Can Venton modèle 2000.Réglez la position de la balance jusqu'à ce que les plaques de compression supérieure et inférieure soient parallèles et directement alignées l'une au-dessus de l'autre. Laissez la plaque supérieure se stabiliser. Ensuite, mettez à zéro l'enregistreur graphique par rapport au poids de la ligne de base établie.Utilisez le microscope stéréoscopique équipé d'une caméra CCD pour capturer une image de l'agrégat non comprimé. Ensuite, ajustez la hauteur de l'appareil du noyau interne pour contrôler le degré de compression souhaité, puis relevez la plaque de compression inférieure jusqu'à ce que l'agrégat soit comprimé contre la plaque de compression supérieure. Utilisez le microscope stéréoscopique équipé d'une caméra CCD pour surveiller la compression et capturer des images de l'agrégat, comme celle présentée ici.Enregistrer en continu l'évolution apparente du poids de la plaque supérieure de compression sur un enregistreur graphique tout au long de la compression, jusqu'à l'obtention de la forme souhaitée. L'équilibre est indiqué par l'aplatissement de la sortie en tension du capteur de masse des boîtes. Utiliser à nouveau le microscope stéréoscopique équipé d'une caméra CCD pour capturer une image de l'agrégat comprimé.Cette image servira à mesurer la géométrie de l'agrégat. Après avoir capturé l'image, abaissez la plaque de compression pour décomprimer l'agrégat et mesurer la force de compression à l'équilibre. Lisez l'enregistrement du traçographe comme la différence entre la force mesurée juste avant la décompression de l'agrégat et la ligne de base nulle établie. Répétez le processus en utilisant un degré différent de compression pour déterminer cette fois l'équilibre de force.Mesurez la force de compression et la géométrie à l'équilibre de force, puis appliquez ces mesures conjointement aux mesures d'équilibre de forme à l'équation de Young-Laplace afin de déterminer des valeurs numériques de la tension superficielle apparente du tissu. Conformément aux instructions du protocole écrit, ce tableau présente les mesures de tension superficielle tissulaire et la confirmation de la fluidité des agrégats pour des agrégats de prostate de rat, de fibroblastes et de cellules musculaires lisses. Les agrégats de cellules de fibroblastes de la prostate de rat présentent une tension superficielle de 22,8 ± 1,1 dynes par centimètre.De plus, les valeurs moyennes de tension superficielle mesurées après la première compression et après la deuxième compression étaient statistiquement identiques lorsqu'elles ont été comparées à l'aide d'un test T apparié. Nous avons également comparé les rapports de sigma deux sur sigma un et de F deux sur F1 afin de s'assurer que ces agrégats ne suivaient pas la loi de Hooke, comme ce serait le cas s'ils se comportaient comme des solides élastiques, comme le montre le tableau un. Le rapport de sigma deux sur sigma un s'approche effectivement de un.De plus, le rapport de F deux sur F1 était significativement supérieur à celui de sigma deux sur sigma. Ceci confirme davantage que ces agrégats ne suivent pas la loi de Hooke et se comportent en réalité comme des liquides. En revanche, comme indiqué dans le tableau un, le rapport de sigma deux sur sigma un des cellules musculaires lisses de la prostate de rat est significativement supérieur à un et ne diffère pas statistiquement de celui de F deux sur F1. Pour démontrer davantage ce comportement de type liquide, nous avons exploré la relation entre la tension superficielle et le volume des agrégats, comme illustré ici. Le volume est indépendant de sigma pour les cellules RPF, comme le montre la droite de régression rouge, tandis qu'une certaine dépendance de sigma par rapport au volume apparaît pour les cellules musculaires lisses de la prostate de rat, comme le montre la droite de régression bleue.Ces données confirment davantage que les agrégats de fibroblastes de la prostate du rat se comportent de manière similaire à un liquide, tandis que ceux des cellules musculaires lisses de la prostate du rat semblent se comporter plutôt comme des solides élastiques. Ainsi, après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines du développement embryonnaire, de l'invasion maligne et du génie tissulaire pour explorer le rôle de la cohésion tissulaire dans l'établissement de compartiments et de limites entre différents types cellulaires durant le développement des feuillets germinatifs embryonnaires, durant l'interaction entre cellules tumorales et stromales, et lors de la réorganisation des cellules des îlots pancréatiques, dans plusieurs modèles animaux différents incluant des amphibiens, des téléostéens, des oiseaux et des modèles humains.

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