Name: Criblage à haut débit et de biodétection avec fluorescent C. elegans Souches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Découvrez un protocole de criblage à haut débit utilisant des souches fluorescentes de C. elegans pour détecter des contaminants environnementaux et moduler des voies transcriptionnelles inductibles. Cette méthode permet une quantification robuste de l'expression génique in vivo.

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C. elegans transgènes ont été fournis par le Centre de Génétique Caenorhabditis (Université du Minnesota, Minneapolis, MN). Ce travail a été soutenu par le NIH R21 octroi NS0667678-01 à KS. Tous les auteurs ont participé à la collecte, l&#39;analyse et l&#39;interprétation des données. CKL, KS, et KPC participé à la rédaction et la révision du manuscrit.

1. Préparation de la nourriture vers bactérienne Jour 1 <ol><li> Ajouter 5 ml d'eau saturée E. coli OP50 bouillon de culture bactérienne ml à 500 Terrific complété avec 50 pg / ml de streptomycine et de grandir dans un incubateur agitateur (225 rpm) pendant la nuit à 37 ° C. </li></ol> Jour 2 <ol start="2"><li> Séparer la culture de la nuit bactérienne en dix tubes de 50 ml et les bactéries par centrifugation dans une centrifugeuse réfrigérée à 2.500 rcf pendant 20 minutes. </li><li> Décanter bouillon LB et resuspendre chaque culot bactérien dans 10 ml de liquide milieux de croissance des nématodes (NGM). Secouer horizontalement dans un shaker de plancher pendant 15 minutes pour remettre en suspension les bactéries. Pour faire tampon NGM, ajouter 3 g de NaCl à 1 L d'eau déminéralisée et autoclave. Laisser refroidir à 55 ° C et ajouter dans l'ordre les solutions suivantes stérile: 1 ml de 1 M CaCl 2, 1 ml de 1 M MgSO 4, et 25 ml de phosphate de potassium 1 M, pH 6,0. </li><li> Centrifuger la culture bactérienne dans une centrifugeuse réfrigérée à 2.500 rcf pendant 20 minutes. </li><li> Décanter tampon NGM et peser le culot bactérien. </li><li> Ajouter un volume égal de tampon NGM pour remettre les boulettes, partie aliquote de 3 ml de bactéries se concentrer dans des tubes de 15 ml et conserver à -20 ° C. </li></ol> 2. À grande échelle C. elegans culture liquide Nous utilisons une lignée transgénique VP596 (dvIs19 [pAF15 (TPS-4:: GFP:: SNA)]; vsIs33 [dop-3: DP]) transportant deux constructions fluorescentes: Pgst -4:: GFP 14 pour surveiller SKN-1 activité et PDOP-3: DP 17 pour servir de standard pour la normalisation des numéros ver. Jour 1 <ol><li> Mélanger 150 ml de tampon NGM, 1,5 ml de bouillon LB, 150 pi de 5 mg / ml de cholestérol (dans l'éthanol), et 75 ul de 100 mg / ml de streptomycine. Filtre-stériliser le mélange et ajouter à un ballon de 1 litre stérile. REMARQUE: l'ajout de bouillon LB 1% de tampon NGM aide à prévenir les vers de coller à verre et en plastique, mais ce montant n'est pas suffisant pour soutenir la croissance des bactéries. </li><li> Synchroniser les vers à la procédure standard de l'hypochlorite de 18 ans. Jusqu'à 0,5 ml de vers gravides peuvent être traitées dans un seul tube de 15 ml avec 5 ml de solution d'hypochlorite (3,75 ml d'eau stérile, 1 ml de javel, et 250 pi NaOH 10 N). Lavez les oeufs libérés à l'eau stérile et les remettre en suspension dans 10 ml de tampon NGM. </li><li> Diluez un échantillon d'œufs 100 fois NGM tampon (par exemple, 100 ul dans 10 ml) et de compter le nombre d'oeufs séparés en trois aliquotes de 5 pi. Multiples, le nombre moyen de 200.000 (100 x facteur de dilution 2000) pour estimer le nombre total d'œufs. </li><li> Ajouter 200 000 à 2 millions d'œufs à la fiole avec un tampon de NGM et secouer la culture à 100 rpm, à 20 ° C. </li></ol> Jour 2 <ol start="5"><li> Au moins 16 h après l'ajout d'oeufs dans le ballon, utiliser une pipette stérile sérologique pour enlever environ 0,5 ml de la culture ver suspendu. Pipeter 5 gouttes trois ul sur le couvercle stérile d'une boîte de Pétri. Placez le couvercle dans un congélateur à -20 ° C pendant 1-2 minutes pour paralyser les vers. Comptez le nombre moyen de vers vivants éclos par 5 ul puis plusieurs par 30 000 (150 ml / 5 pl) pour estimer le nombre total de vers éclos. </li><li> Dégeler un tube de gelée OP50 culture bactérienne (protocole 1.6) et ajouter 3 ml de 50% dans la culture OP50 ver par 500 000 vers éclos. Agiter le flacon à 100 rpm à 20 ° C. Worms se développer en larves L4 et les jeunes adultes dans environ 51 heures. La DO600 de bactéries devrait être d'environ 2.200 au début. Surveiller la quantité de bactéries par absorption et d'ajouter de plus si la DO 600 tombe en dessous de 0,900. </li></ol> 3. La collecte et la distribution de Worm Jour 4 <ol><li> Utiliser une pipette stérile sérologique au transfert d'environ 0,5 ml de la culture ver suspendu à une plaque de gélose NGM standard. Afficher les vers avec un stéréomicroscope pour s'assurer que la plupart sont des larves L4 ou de jeunes adultes. Larves L4 aura un spot ventrale claire dans le milieu du corps. Les jeunes adultes seront légèrement plus grand et ne sera pas une tache claire. </li><li> Verser la culture ver dans des tubes de 50 ml stériles et placer les tubes dans un portoir sur la paillasse. Autoriser les vers de se contenter de 10 minutes environ. Eliminer le surnageant par aspiration ou pipetage. REMARQUE: Cette étape peut être important d'enlever les œufs non éclos ou des vers qui ne se développent pas car ils se déposent plus lentement que les larves L4 et les jeunes adultes. </li><li> Ramassez tous les vers dans un seul tube de 50 ml et laver avec un tampon de NGM avec du bouillon LB 1% (NGM + LB) 3-4 fois pour éliminer les bactéries. NOTE: Ceci est fait de mieux dans une centrifugeuse en collectant des vers à 500 fcr pendant 30 sec et en remplaçant le surnageant avec le NGM frais + tampon LB. </li><li> Après le lavage, remplir le tube avec le NGM + tampon LB à 50 ml et versez dans un flacon à vis sans fin personnalisée de distribution. Ajouter un barreau de petites et remuer pour garder les vers suspendu. Comptez èmee nombre de vers en trois 5 gouttes ul comme indiqué plus haut. Diluer avec le NGM + LB jusqu'à ce que vous obtenez 12 à 15 vers par 5 ul baisse (de 2.5 à 3.0 ~ vers / ul). REMARQUE: Un minimum d'environ 20 ml (60.000 vers) est nécessaire pour combler l'espace mort du flacon de distribution et d'une cassette distributeur. Chaque plaque 384 puits nécessite environ 35 000 vers ou 11,5 ml de vers suspendu. </li><li> Chargez une cassette de 10 ul de distribution et stériliser par amorçage avec de l'éthanol à 70%. Rincer l'éthanol par amorçage à l'eau stérile. </li><li> Insérez l'extrémité de la cassette de distribution dans le ballon de sorte qu'il est juste au-dessus de la barre remuez sans perturber son mouvement. Assurez-vous que les vers restent en suspension dans le flacon entier. Programme du distributeur de se passer à basse vitesse avec 2 pré-impulsions. Premier et exécuter au moins 10 ml de vers suspendu. Remplissez plaques comme nécessaire rapidement pour empêcher les vers de s'installer dans le tube. </li><li> Sceller les plaques avec du ruban adhésif respirant. </li><li> Placez les plaques sur une table d'agitation dans un incubateur à la température appropriée pour votre analyse. Ne pas empiler les assiettes. </li></ol> 4. L'analyse par fluorescence <ol><li> Placer la plaque cible dans un lecteur de microplaques pour mesurer l'intensité de fluorescence de chaque puits avec la longueur d'onde appropriée d'émission et d'excitation (Filtres pour notre analyse: la GFP 485/20ex 528/20em; DP 540/25ex 590/35em). </li><li> Calculer le rapport de la GFP / RFP et normaliser les lectures des puits témoin (sans composé activant) pour déterminer la différence exacte pli de l'intensité de fluorescence provenant des traitements individuels. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Notre SKN-1 essai utilise une souche journaliste de chromosomes double intégrée (VP596). Comme le montre la figure 1, le nombre de vers est bien corrélé au volume distribué. Comme le montrent les figures 2A et 2B, le total des GFP et DP de fluorescence par puits est hautement reproductible d'un puits à travers une plaque de 384 puits. Comme le montre la figure 2C, l'ONU-induite Pgst-4:: fluorescence de la GFP est linéairement corrélée à PDOP-3: DP dans 384 puits. Lorsqu'il est exprimé comme un rapport de la GFP / RFP, la fluorescence devient hautement reproductibles d'un puits à travers une plaque de 384 puits (comparer le coefficient de variation de la figure 2D pour 2A) démontrant la capacité de la PDOP-3:: Un journaliste demande de propositions pour réduire la variabilité. Comme le montre la figure 3, l'induction de la GFP relatives à la DP avec un SKN-1 activation des xénobiotiques (38 juglone uM) est robuste et hautement reproductible à travers une plaque de 384 puits. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Nombre de vers en fonction du volume distribué. Worms ont été dilués à environ 2/μl et distribués dans une plaque à 24 puits pour le comptage manuel avec un stéréomicroscope. N = 8 puits par volume. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Fluorescence totale de vers distribuée dans une plaque 384 puits est reproductible. Worms ont été dilués à environ ul 2.5/μl et 30 a été distribué dans chaque puits d'une plaque de 384 puits. GFP (A) et DP (B) de fluorescence de tous les puits ont un coefficient de variation inférieur à 9%. (C) fluorescence de la GFP est fortement corrélé à la DP fluorescence. (D) Calcul du ratio de la GFP à la DP a réduit le coefficient de variation au-dessous de 6% (A, B et D) Les lignes pleines indiquent les moyens et les lignes brisées indiquent trois déviations standard au-dessus ou en dessous de la moyenne. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> . Figure 3 Activation de Pgst-4:: GFP est robuste et cohérente. Environ 75 L4 vers ont été distribués dans tous les puits d'une plaque de 384 puits et 38 uM juglone a été ajouté dans chaque colonne. GFP et DP fluorescence a été mesurée après 21 h d'incubation. La relative moyenne des ratios de fluorescence de tout contrôle (1,0) et la juglone puits (8,9) sont marqués par des lignes pleines. Trois déviations standard au-dessus du contrôle de la moyenne et inférieure à la moyenne juglone sont marqués par des lignes brisées.

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</ol>

Nous présentons une méthode pour la culture et la distribution de grands nombres de nématodes transgéniques. L&#39;équipement utilisé pour les vers de la culture est la norme pour les laboratoires effectuant le clonage moléculaire et la manipulation de liquides et de l&#39;équipement de fluorescence est standard pour les laboratoires de traitement de grands nombres de microplaques. D&#39;autres méthodes de distribution grand nombre de vivre C. elegans nécessitent des particules onéreux équipement de tri 19...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Bouillon LB </td><td> Recherche International Products Corp </td><td> L24066 </td><td></td></tr><tr><td> Terrific Bouillon </td><td> Recherche International Products Corp </td><td> T15100 </td><td></td></tr><tr><td> Synergy ™ HT multi-mode lecteur de microplaques </td><td> BioTek </td><td></td><td> Filtres: GFP 485/20ex 528/20em; DP 540/25ex 590/35em </td></tr><tr><td> MicroFlo Select Distributeur </td><td> BioTek </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Worm flacon de distribution </td><td> Sud Scientific Inc, Micanopy, Floride </td><td></td><td> Personnalisé assemblés (352) 284-2531 </td></tr><tr><td> 384 microplaques </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 5678-1209 </td><td></td></tr><tr><td> Ruban adhésif respirant </td><td> Nunc </td><td> 241205 </td><td></td></tr><tr><td> (5-hydroxy-p-naphthoqinone) Juglone </td><td> ACROS </td><td> 121640010 </td><td> Juglone est dissoute dans du DMSO </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5879 </td><td></td></tr><tr><td> C. elegans transgéniques souche </td><td> Auteur du laboratoire </td><td> VP596 </td><td> Pgst-4:: GFP et PDOP-3: DP </td></tr></tbody></table>

criblage à haut débit et de biodétection avec fluorescent c. elegans souches

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

Criblage à haut débit (HTS) est une approche puissante pour identifier des modulateurs chimiques des processus biologiques. Toutefois, de nombreux composés identifiés dans les écrans en utilisant des modèles de culture cellulaire sont souvent considérés comme toxiques ou pharmacologiquement inactive in vivo 1-2. Dépistage dans les modèles animaux entiers peuvent aider à éviter ces écueils et de rationaliser la voie du développement de médicaments. C. elegans est un organisme modèle multicellulaire bien adapté pour HTS. Il est de petite taille (&lt;1 mm) et peut être économiquement cultivé et distribué dans les liquides. C. elegans est également l&#39;un des modèles animaux les plus dociles expérimentale permettant une identification rapide et détaillée de la drogue mode d&#39;action 3. Nous décrivons un protocole pour la culture et la distribution des souches fluorescentes de C. elegans pour criblage à haut débit de chimiothèques ou la détection de contaminants environnementaux qui modifient l&#39;expression d&#39;un gène spécifique. Un grand nombre de vers de développement synchronisé sont cultivées en milieu liquide, récoltées, lavées, et suspendu à une densité définie. Worms sont ensuite ajoutés au noir, fond plat, plaques 384 puits en utilisant un distributeur péristaltique liquide. Les petites molécules à partir d&#39;une bibliothèque chimique ou échantillons de test (par exemple, eau, nourriture, ou le sol) peuvent être ajoutés aux puits avec des vers. In vivo, en temps réel l&#39;intensité de fluorescence est mesurée avec un lecteur de microplaques à fluorescence. Cette méthode peut être adapté à n&#39;importe quel gène inductible en C. elegans pour lequel un journaliste convenable est disponible. Beaucoup de stress inductible et de développement des voies de transcription sont bien définis dans C. elegans et les souches transgéniques GFP journaliste existent déjà pour beaucoup d&#39;entre eux 4. Lorsqu&#39;il est combiné avec les journalistes appropriée transgéniques, notre méthode peut être utilisée pour dépister les modulateurs voie ou à développer de solides analyses biocapteur pour les contaminants environnementaux. Nous démontrons notre C. elegans culture et de distribution de protocole avec un test HTS nous avons développé pour surveiller le C. &#39;n&#39; elegans bouchon facteur de transcription cols SKN-1. SKN-1 et son homologue de Nrf2 activer des gènes de mammifères cytoprotecteur durant le stress oxydatif et des xénobiotiques 5-10. Nrf2 protège les mammifères de nombreuses liée à l&#39;âge des troubles tels que le cancer, la neurodégénérescence, et de l&#39;inflammation chronique et est devenue une cible majeure chimiothérapeutiques 11-13. Notre analyse est basée sur une GFP journaliste transgéniques pour le SKN-1 gène cible -4 TPS 14, codant pour une glutathion-S 6 transférase. La TPS est également journaliste de -4 un biocapteur pour les produits chimiques xénobiotiques et oxydatif qui activent SKN-1 et peut être utilisé pour détecter de faibles niveaux de contaminants tels que l&#39;acrylamide et le méthyl-mercure, 15-16.

Une procédure de liquides à base de culture et de la distribution de<em&gt; C. elegans</em&gt; Souches exprimant des protéines rapporteur fluorescent est décrite qui ne nécessite pas d&#39;équipement de tri coûteux. Cette approche peut être appliquée à de nombreux inductible<em&gt; C. elegans</em&gt; Des gènes pour la découverte de médicaments ou de biocapteurs de contaminants.

Criblage à haut débit et de biodétection avec fluorescent C. elegans Souches

Le criblage à haut débit (HTS) est une approche puissante pour identifier des modulateurs chimiques de processus biologiques. Cependant, de nombreux composés identifiés dans...

Ce vidéo montre une méthode pour cultiver et distribuer des souches fluorescentes de CL gans afin de réaliser des criblages à haut débit de bibliothèques chimiques ou de détecter des contaminants environnementaux, dans le but d'évaluer l'effet d'agents chimiques ou environnementaux sur l'activité d'une protéine spécifique. Chez CL elgan, des cultures bactériennes sont d'abord préparées comme nourriture pour les vers et des vers transgéniques exprimant la GFP sont synchronisés puis cultivés.Entre 0,5 et 2 millions de vers sont ensuite collectés, lavés et répartis dans 3 plaques de microtitration à 84 puits, puis des petites molécules provenant d'une bibliothèque chimique ou des échantillons à tester, tels que de l'eau, des aliments ou du sol, sont ajoutés aux vers. Enfin, la fluorescence des vers est mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques.L'analyse des données d'intensité de fluorescence révèle des petites molécules capables de moduler des voies transcriptionnelles induisibles ou permettant la détection de contaminants environnementaux. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les tests in vitro ou basés sur des cultures cellula

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Un protocole est décrit pour la détection in vivo des effets des inhibiteurs mitochondriaux dans l’organisme modèle Caenorhabditis elegans et pour l’identification de composés potentiellement améliorants. Ce protocole peut être utilisé pour cribler les bibliothèques de médicaments à la recherche de composés modulant la fonction mitochondriale.

Un criblables<em&gt; In Vivo</em&gt; Essai de modulateurs mitochondriale utilisant transgénique Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Nous décrivons ici un protocole simple pour produire rapidement des centaines de gélose de croissance nématode de médias, des plaques de 96 puits de culture avec un nombre uniforme de Caenorhhabditis elegans / puits. Ces cultures sont utiles pour le dépistage phénotypique des organismes entiers. Nous nous concentrons ici sur l’utilisation de ces cultures de produits chimiques pour des effets Pro-longévités.

Une méthode Simple pour le criblage à haut débit chimique chez Caenorhabditis Elegans

Nous décrivons ici un protocole qui est un hôte adaptable, entier, outil de dépistage de la forte teneur qui peut être utilisé pour étudier les interactions hôte-pathogène et être utilisé pour la découverte de médicaments.

Un haut débit et haute teneur, liquide à base de c. elegans pathosystème

Ce travail décrit un protocole semi-haut débit qui permet l'imagerie simultanée en time-lapse 3D de l'embryogenèse dans 80-100 embryons d'élegans de C. dans une seule course de nuit. En outre, des outils de traitement d'image et de visualisation sont inclus pour rationaliser l'analyse des données. La combinaison de ces méthodes avec des souches de reporter personnalisées permet une surveillance détaillée de l'embryogenèse.

Une méthode d'imagerie semi-haut débit et une boîte à outils de visualisation de données pour analyser C. elegans Embryonic Development

Les microbes intestinaux peuvent avoir un impact positif ou négatif sur la santé de leur hôte via des mécanismes spécifiques ou conservés. Caenorhabditis elegans est une plate-forme pratique pour dépister de tels microbes. Le présent protocole décrit le dépistage à haut débit de 48 isolats bactériens pour déterminer leur impact sur la résistance au stress des nématodes, utilisés comme indicateur de la santé des vers.

Criblage à haut débit d’isolats microbiens ayant un impact sur la santé de Caenorhabditis elegans

Nous fournissons ici des instructions sur l’utilisation efficace de SegElegans, un système d’apprentissage profond que nous avons développé pour la segmentation automatisée de vers individuels dans des images de microscopie à grand champ, pour une utilisation ultérieure dans des logiciels d’analyse d’images tels qu’ImageJ. Nous fournissons des moyens d’utiliser le système à la fois en ligne et hors ligne.

Analyse automatisée d’images de fluorescence de C. elegans à l’aide de SegElegans

Découvrez un protocole de criblage à haut débit utilisant des souches fluorescentes de C. elegans pour détecter des contaminants environnementaux et moduler des voies transcriptionnelles inductibles. Cette méthode permet une quantification robuste de l'expression génique in vivo.

Criblage à haut débit et de biodétection avec fluorescent C. elegans Souches

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