Criblage à haut débit et de biodétection avec fluorescent C. elegans Souches

Cette vidéo présente une méthode de culture et de distribution de souches fluorescentes de CL gans pour le criblage à haut débit de bibliothèques chimiques ou la détection de contaminants environnementaux afin d’évaluer l’effet d’agents chimiques ou environnementaux sur l’activité protéique spécifique. Dans le CL elgan, les cultures bactériennes sont d’abord préparées comme nourriture pour les vers et les transgéniques GFP. Les vers synchronisés sont cultivés.

0,5 à 2 millions de vers sont ensuite collectés, lavés et distribués dans 3 84. Des plaques de microtitration, puis de petites molécules d’une chimiothèque ou d’échantillons de test tels que de l’eau, de la nourriture ou du sol sont ajoutés aux vers. Enfin, la fluorescence des vers est mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaques.

L’analyse des données d’intensité de fluorescence révèle de petites molécules qui modulent les voies transcriptionnelles inductibles ou permettent de détecter des contaminants environnementaux. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les essais in vitro et basés sur la culture cellulaire, est qu’elle ne perdra pas de temps sur des composés toxiques ou inactifs in vivo. Cette méthode à haut débit peut aider à identifier de petites molécules qui modulent diverses voies inductibles.

Bien que nous ayons développé cette méthode pour le criblage à haut débit de banques de petites molécules, elle peut également être appliquée à la biodétection de contaminants dans des échantillons alimentaires et environnementaux. Andrew Dine, technicien pour mon laboratoire, et Q, postdoctorant pour mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Préparez de la nourriture pour vers bactériens à l’avance.

Commencez par inoculer 500 millilitres de bouillon formidable, complété par 50 microgrammes par millilitre de streptomycine avec cinq millilitres d’e coli saturé. OP 50. Placez la culture sur un shaker et cultivez toute la nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, divisez la culture en 10 tubes de 50 millilitres. Placez ensuite les tubes dans une centrifugeuse réfrigérée et faites-les tourner à 2 500 RCF pendant 20 minutes. Après le spin Resus, suspendre chaque pastille bactérienne dans 10 millilitres de milieu de croissance de nématode liquide ou NGM.

Secouez les suspensions horizontalement. Un agitateur de sol pendant 15 minutes pour remettre les bactéries en suspension. Ensuite, centrifugez la culture bactérienne à 2 500 RCF à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.

Décantez le NGM et pesez la pastille bactérienne. Ajoutez ensuite un volume égal de tampon NGM et remettez les granulés en suspension par vortex. Enfin, aliquote trois millilitres de la culture bactérienne remise en suspension dans des tubes de 15 millilitres et stockez-les à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires.

Dans cette démonstration, l’effet du prêt Xeno Duke induisant le stress sur le facteur de transcription Sskn one sera mesuré à titre d’exemple. Sskn one est connu pour activer les gènes cytoprotecteurs lors du stress oxydatif et xénobi. Une culture à grande échelle de la lignée de cellules Trenchgenic VP 5 96, qui comporte deux constructions fluorescentes, est préparée.

VP 5 96 les vers expriment à la fois le promoteur GST quatre qui pilote la GFP, qui est utilisée pour surveiller l’activité du facteur de transcription. Sskn un et le promoteur DOP trois conduite. L’appel d’offres est utilisé comme norme pour la normalisation du nombre de vers.

La troisième DOP est le promoteur d’un récepteur de la dopamine et est exprimée de manière constitutive dans les neurones de tout le corps. Dans l’exemple, étant donné que le xenobi lon active fortement sskn un et augmente la quantité de GFP exprimée par le promoteur GS T quatre pour préparer les cultures commencer par combiner 150 millilitres de tampon N NGM, 1,5 millilitres de LB 150, des microlitres d’une molaire de cholestérol et 75 microlitres de 100 milligrammes par millilitre. Streptomycine. L’ajout du LB aide à empêcher les vers de coller à la verrerie et à la plastique, mais cette quantité n’est pas suffisante pour favoriser la croissance bactérienne.

Filtrez pour stériliser le mélange, puis transférez-le dans une fiole stérile d’un litre et mettez la fiole de côté pour libérer les œufs des vers adultes GR. Lavez les bactéries des vers en les centrifugeant et en replaçant le milieu NGM jusqu’à ce que la supinate soit claire. Lavez les vers une deuxième fois à l’aide d’un résu, en les suspendant à nouveau dans une centrifugeuse à eau stérile après l’essorage.

Retirez le supinate et remplissez le tube de 3,75 millilitres d’eau stérile. Ajoutez un millilitre d’eau de Javel domestique et 250 microlitres de 10 hydroxyde de sodium normaux mélangés immédiatement par inversion cinq à six fois. Placez le tube dans un rotateur après que les vers aient été exposés à l’eau de Javel pendant quatre minutes.

Placez le tube sous un stéréomicroscope. La plupart des adultes devraient être des mensonges. Secouez vigoureusement le tube 15 à 20 fois pour aider à trouver les vers adultes restants après la lyse pendant cinq minutes au total, ajoutez de l’eau stérile jusqu’à ce que le tube soit plein.

Mélangez par inversion cinq à six fois pour recueillir les œufs. Centrifugez le tube pendant une minute à 500 RCF. Lavez les œufs trois fois à l’aide d’un Resus, en les pliant dans 10 millilitres d’eau stérile, en les essorant et en enlevant le supinate.

Ensuite, diluez 100 fois un échantillon de 100 microlitres d’œufs en ajoutant 10 millilitres de tampon NGM. Ensuite, pipetez trois aliquotes de cinq microlitres sur un couvercle de boîte de Pétri sous un microscope. Comptez le nombre d’œufs dans trois aliquotes distinctes de cinq microlitres.

Pour estimer le nombre total d’œufs. Ajoutez 200 000 à 2 millions d’œufs dans le ballon avec le tampon NGM et secouez la culture à 100 tr/min à 20 degrés Celsius. Au moins 16 heures après l’ajout des œufs dans le flacon, utiliser une pipette sérologique stérile pour prélever environ 0,5 millilitre de culture de vers en suspension.

Pipette trois gouttes de cinq microlitres sur le couvercle stérile d’une boîte de Pétri. Placez le couvercle dans un congélateur à moins 20 degrés pendant une à deux minutes pour paralyser les vers une fois qu’ils ont été paralysés. Comptez le nombre moyen de vers vivants éclos par cinq microlitres à l’aide d’un stéréomicroscope pour estimer le nombre total.

Décongelez la culture bactérienne OP 50 congelée préparée précédemment en la plaçant sur un banc pendant quelques minutes. Ajoutez ensuite trois millilitres de 50 % OP 50 pour 500 000 vers éclos. Agitez le ballon de 100 tr/min à 20 degrés Celsius.

Les vers se développeront en quatre stades larves et jeunes adultes en 51 heures environ. Surveiller la quantité de bactéries tout au long de l’incubation par inspection visuelle. Ajoutez plus de bactéries si le milieu devient clair.

À l’aide d’une pipette sérologique stérile, transférez environ 0,5 millilitre de la culture de vers en suspension dans une plaque de gélose NGM standard. Observez les vers avec un stéréomicroscope pour vous assurer que la plupart sont des larves L quatre et les jeunes adultes sous microscopie à fond clair, L quatre larves auront une tache ventrale claire au milieu du corps. Les jeunes adultes seront légèrement plus grands et n’auront pas d’endroit dégagé.

Ensuite, tirez la culture de vers dans des tubes stériles de 50 millilitres. Placez les tubes dans un support à éprouvette dans la hotte et laissez-les déposer des œufs non éclos ou des vers qui ne se développent pas. S’installer plus lentement que les vers développés.

Après 10 minutes, retirez le supinate, qui contient des vers non éclos et non développés, par aspiration à environ 10 millilitres de tampon NGM à chaque pastille et suspendez les vers en faisant doucement tourner les tubes. Rassemblez tous les vers dans un seul tube de 50 millilitres. Faites tourner la centrifugeuse à godets oscillants à 500 RCF pendant 30 secondes.

Ensuite, remettez les vers en suspension dans 50 millilitres de NGM avec 1 % lb pour les laver. Répétez cette opération, lavez trois à quatre fois pour éliminer les bactéries après le lavage. Remplissez le tube avec le tampon NGM plus LB à 50 millilitres.

Versez-le dans une fiole de distribution de vers de terre personnalisée au niveau d’un bar à agitation et placez-le sur une plaque à mélanger. Un minimum d’environ 20 millilitres ou 60 000 vers est nécessaire pour remplir l’espace mort au niveau du flacon de distribution et de la cassette du distributeur. Comptez le nombre de vers dans trois gouttes de cinq microlitres comme indiqué précédemment.

Après avoir compté à NGM plus LB jusqu’à une concentration de 12 à 15 vers par goutte de cinq microlitres, chaque plaque de 3 à 84 puits nécessite environ 35 000 vers ou 11,5 millilitres de vers en suspension. Chargez une cassette de distribution de 10 microlitres dans le distributeur et stérilisez-la par amorçage avec de l’éthanol à 70 %. Rincez l’éthanol en l’amorçant avec de l’eau stérile.

Insérez l’extrémité de la cassette de distribution dans le ballon de manière à ce qu’elle se trouve juste au-dessus du barreau d’agitation sans perturber son mouvement. Assurez-vous que les vers restent en suspension tout au long de la fiole. Programmez le distributeur pour distribuer des vers à basse vitesse avec deux pré-impulsions amorcer et exécuter Au moins 10 millilitres de vis sans fin en suspension.

Remplissez rapidement les plaques de microtitration, qui doivent déjà contenir les composés d’essai, pour éviter que les vers ne se déposent dans le tube. Ici, la pâte d’essai préalablement chargée sur la plaque de microtitration est due. Lueur. Scellez les plaques avec du ruban adhésif respirant pour empêcher la poussière de s’accumuler dans les puits.

Placez les plaques sur une plate-forme agitante dans un incubateur à la température appropriée pour le dosage. N’empilez pas les plaques car cela peut restreindre le flux d’air. Placez la plaque cible dans un lecteur de microplaques pour mesurer l’intensité de fluorescence de chaque puits avec les longueurs d’onde d’émission et d’excitation appropriées ici.

Les filtres utilisés pour la GFP sont l’excitation à 4 85 et l’émission à 5 28. Les filtres pour l’appel d’offres sont l’excitation à cinq 40 et l’émission à cinq 90. Après avoir lu la plaque, calculez le rapport entre la GFP et la RFP et normalisez avec les lectures des puits de contrôle, qui ne contiennent pas le composé activateur, afin de déterminer la différence de pli exacte de l’intensité de fluorescence dérivée des traitements individuels.

Le test SSKN montré ici utilise un double rapport chromosomiquement intégré, une souche lorsque les vers ont été comptés manuellement avec un stéréomicroscope. Le nombre de vers était corrélé au volume distribué avec une valeur R au carré de 0,94 et une valeur p inférieure à 0,0001. Cela indique que le nombre de vers distribués dans chaque puits peut être contrôlé en ajustant le volume distribué.

La fluorescence GFP totale par puits indiquée à gauche et la fluorescence RFP par puits indiquée à droite sont hautement reproductibles d’un puits à l’autre sur une plaque de 3 à 84 puits dans ces figures. XS indique la fluorescence relative mesurée dans chaque puits. Les lignes continues indiquent les moyennes et les lignes brisées indiquent trois écarts-types au-dessus ou en dessous de la fluorescence moyenne de tous les puits avaient un coefficient de variation inférieur à 9 %Comme le montre cette figure, la fluorescence GFP du promoteur GST quatre est linéairement corrélée à la fluorescence RFP du promoteur DOP trois à travers 3 84 puits avec une valeur R carré de 0,62 et une valeur p inférieure à 0,0001.

Par conséquent, le rapporteur RFP non inductible peut être utilisé pour normaliser l’inductible. Journaliste GFP. Lorsqu’elle exprime un rapport de GFP sur RFP, la fluorescence devient hautement reproductible d’un puits à l’autre sur une plaque de 3 à 84 puits.

Le calcul du rapport GFP/RFP a réduit le coefficient de variation à moins de 6 %, démontrant la capacité du rapporteur RFP à trois promoteurs DOP à réduire la variabilité, comme le montre ici. L’induction de la GFP par rapport à la RFP avec un xénobiotique activateur SK N one est robuste et hautement reproductible sur une plaque de 3 à 84 puits, les rapports de fluorescence relatifs moyens de tous les puits témoins et GLO dus sont marqués par des lignes continues. Trois écarts-types au-dessus de la moyenne de contrôle et au-dessous de la moyenne dlo sont marqués par des lignes pointillées.

Une fois maîtrisé, le démarrage d’une culture de vers peut être fait environ une heure le premier jour, puis la collecte et la distribution. Un vers peut être fait environ deux heures s’il est fait correctement. Bien qu’il soit important de se rappeler de commencer avec au moins 60 000 vers et de les maintenir en suspension pendant la distribution, après cette procédure, des écrans avec d’autres, par exemple, des chaînes de rapport pour d’autres voies inductibles peuvent être effectuées afin de développer des modulateurs pour d’autres voies Après son développement.

Cette technique peut ouvrir la voie aux chercheurs dans les domaines du criblage à haut débit et de la biodétection pour identifier rapidement les modulateurs de voie des petites molécules ou détecter les contaminants environnementaux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver, de distribuer et de mesurer les souches fluorescentes d’elegan pour le criblage à haut débit si les voies transcriptionnelles inductibles ou l’analyse de plusieurs échantillons pour les contaminants environnementaux.