Criblage à haut débit et de biodétection avec fluorescent C. elegans Souches

Ce vidéo montre une méthode pour cultiver et distribuer des souches fluorescentes de CL gans en vue de criblages à haut débit de bibliothèques chimiques ou de détection de contaminants environnementaux afin d'évaluer l'effet d'agents chimiques ou environnementaux sur l'activité d'une protéine spécifique. Chez CL elgan, des cultures bactériennes sont d'abord préparées comme nourriture pour les vers et des vers transgéniques exprimant la GFP sont cultivés de manière synchronisée.

Entre 0,5 et 2 millions de vers sont ensuite collectés, lavés et répartis dans 3 plaques de microtitration à 84 puits, puis des petites molécules provenant d'une bibliothèque chimique ou des échantillons à tester, tels que de l'eau, des aliments ou du sol, sont ajoutés aux vers. Enfin, la fluorescence des vers est mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques.

L'analyse des données d'intensité de fluorescence révèle des petites molécules capables de moduler des voies transcriptionnelles induisibles ou permettant la détection de contaminants environnementaux. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les tests in vitro ou basés sur des cultures cellulaires, est qu'aucun temps ne sera perdu à tester des composés toxiques ou inactifs in vivo. Cette méthode à haut débit peut aider à identifier des petites molécules capables de moduler diverses voies induisibles.

Bien que nous ayons développé cette méthode pour le criblage à haut débit de bibliothèques de petites molécules, elle peut également être appliquée à la détection de contaminants dans des échantillons alimentaires et environnementaux. La procédure sera démontrée par Andrew Dine, technicien de mon laboratoire, et Q long, postdoctorant de mon laboratoire. Préparez à l’avance la nourriture bactérienne pour les vers.

Commencez par ensemencer 500 millilitres de bouillon excellent, supplémenté avec 50 microgrammes par millilitre de streptomycine, avec cinq millilitres d’e. coli OP50 saturé. Placez la culture sur un agitateur et faites-la croître toute la nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, répartir la culture dans 10 tubes de 50 millilitres. Ensuite, placer les tubes dans une centrifugeuse réfrigérée et centrifuger à 2 500 RCF pendant 20 minutes. Après la centrifugation, resuspendre chaque culot bactérien dans 10 millilitres de milieu de croissance liquide pour nématodes ou milieu NGM.

Agiter horizontalement les suspensions. Utiliser un agitateur rotatif pendant 15 minutes pour resuspendre les bactéries. Ensuite, centrifuger la culture bactérienne à 2 500 RCF à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.

Versez délicatement le NGM et pesez le culot bactérien. Ajoutez ensuite un volume égal de tampon NGM et remettez en suspension les culots par vortexage. Enfin, aliquotez trois millilitres de la culture bactérienne remise en suspension dans des tubes de 15 millilitres et conservez-les à moins 20 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation.

Dans cette démonstration, l'effet du stress induit par le Xeno Duke loan sur le facteur de transcription Sskn one sera mesuré à titre d'exemple. On sait que Sskn one active les gènes cytoprotecteurs lors de stress oxydatif et xénobiotique. Une culture à grande échelle de la lignée Trenchgenic c gans VP 5 96, qui porte deux constructions fluorescentes, est préparée.

Les vers VP 5 96 expriment à la fois le promoteur GST four qui contrôle la GFP, utilisée pour surveiller l'activité du facteur de transcription Sskn un, et le promoteur DOP three qui contrôle la RFP, utilisée comme référence pour la normalisation du nombre de vers.

DOP trois est le promoteur d'un récepteur de la dopamine et est exprimé de manière constitutive dans les neurones de tout le corps. Dans l'exemple, étant donné que le xénobion fortement active sskn un et augmente la quantité de GFP exprimée à partir du promoteur GS T quatre, commencez la préparation des cultures en mélangeant 150 millilitres de tampon N NGM, 1,5 millilitre de LB 150, microlitres de cholestérol un molaire et 75 microlitres de streptomycine à 100 milligrammes par millilitre. L'ajout de LB aide à empêcher les vers de coller au matériel en verre et en plastique, mais cette quantité n'est pas suffisante pour permettre la croissance bactérienne.

Filtrez le mélange pour le stériliser, puis transférez-le dans un flacon stérile d'un litre et mettez le flacon de côté pour libérer les œufs des vers adultes GR. Lavez les bactéries présentes sur les vers par centrifugation et remplacez le milieu NGM jusqu'à ce que le surnageant soit clair. Lavez une deuxième fois les vers en les resuspendant dans de l'eau stérile, puis centrifugez à nouveau après la rotation.

Retirez le surnageant et remplissez le tube avec 3,75 millilitres d'eau stérile. Ajoutez un millilitre d'eau de Javel ménagère et 250 microlitres de soude 10 normale, puis mélangez immédiatement par retournement cinq à six fois. Placez le tube dans un rotateur après que les vers aient été exposés à l'eau de Javel pendant quatre minutes.

Placer le tube sous un microscope stéréo. La majorité des adultes devraient être morts. Agiter vigoureusement le tube de 15 à 20 fois afin de tuer tout ver adulte restant après la lyse. Au bout de cinq minutes, ajouter de l'eau stérile jusqu'à ce que le tube soit plein.

Mélanger par retournement cinq à six fois pour recueillir les œufs. Centrifuger le tube pendant une minute à 500 RCF. Laver les œufs trois fois à l’aide de Resus, en les resuspendant dans 10 millilitres d’eau stérile, en centrifugant et en éliminant le surnageant.

Ensuite, diluez un échantillon de 100 microlitres d'œufs 100 fois en ajoutant 10 millilitres de tampon NGM. Puis, pipetez trois aliquotes de cinq microlitres sur le couvercle d'une boîte de Pétri sous un microscope. Comptez le nombre d'œufs dans trois aliquotes distinctes de cinq microlitres.

Pour estimer le nombre total d'œufs, ajoutez de 200 000 à 2 millions d'œufs dans le flacon contenant du tampon NGM et agitez la culture à 100 tr/min à 20 degrés Celsius. Au moins 16 heures après l'ajout des œufs dans le flacon, utilisez une pipette sérologique stérile pour prélever environ 0,5 millilitre de la culture de vers en suspension.

Prélèvez trois gouttes de cinq microlitres sur le couvercle stérile d'une boîte de Pétri. Placez le couvercle dans un congélateur à moins 20 degrés pendant une à deux minutes afin de paralyser les vers une fois que ceux-ci sont paralysés. Comptez le nombre moyen de vers éclos vivants par cinq microlitres à l’aide d’un microscope stéréo pour estimer le nombre total.

Décongelez la culture bactérienne OP 50 congelée préparée précédemment en la laissant reposer sur le banc pendant quelques minutes. Ajoutez ensuite trois millilitres de OP 50 à 50 % par 500 000 vers éclos. Agitez le flacon à 100 tr/min à 20 degrés Celsius.

Les vers atteindront le stade des larves L4 et des jeunes adultes en environ 51 heures. Surveillez la quantité de bactéries tout au long de l'incubation par inspection visuelle. Ajoutez davantage de bactéries si le milieu devient clair.

Utilisez une pipette stérile de type sérologique pour transférer environ 0,5 millilitre de la culture de vers en suspension sur une boîte de gélose NGM standard. Observez les vers au microscope stéréoscopique afin de vous assurer que la majorité correspondent à des larves L4 et à de jeunes adultes en microscopie en champ clair ; les larves L4 présenteront une tache claire ventrale au milieu du corps. Les jeunes adultes seront légèrement plus grands et ne présenteront pas de tache claire.

Ensuite, aspirez la culture de vers dans des tubes stériles de 50 millilitres. Placez les tubes dans un porte-tubes sous la hotte et laissez-les reposer afin que les œufs non éclosés ou les vers qui ne se développent pas sédimentent. Ces derniers sédimentent plus lentement que les vers développés.

Après 10 minutes, éliminer le surnageant, qui contient les vers non éclos et non développés, par aspiration, en ajoutant environ 10 millilitres de tampon NGM à chaque culot et en resuspendant les vers par un léger mouvement de rotation des tubes. Rassembler tous les vers dans un seul tube de 50 millilitres. Faire centrifuger dans une centrifugeuse à godets tournants à 500 RCF pendant 30 secondes.

Ensuite, resuspendre les vers dans 50 millilitres de NGM contenant 1 % de lb pour les laver. Répéter cette étape, effectuer trois à quatre lavages pour éliminer les bactéries après le lavage. Remplir le tube avec du NGM additionné de tampon LB jusqu'à 50 millilitres.

Verser ceci dans un flacon distributeur de vers personnalisé contenant un barreau aimanté et le placer sur un agitateur magnétique. Un minimum d'environ 20 millilitres ou 60 000 vers est nécessaire pour remplir l'espace mort du flacon distributeur et de la cassette du distributeur. Compter le nombre de vers dans trois gouttes de cinq microlitres comme indiqué précédemment.

Après dénombrement sur NGM plus LB, pour une concentration de 12 à 15 vers par goutte de cinq microlitres, chaque plaque de 84 puits nécessite environ 35 000 vers ou 11,5 millilitres de vers en suspension. Charger une cassette de distribution de 10 microlitres dans le distributeur et la stériliser en amorçant avec de l'éthanol à 70 %. Rincer l'éthanol en amorçant avec de l'eau stérile.

Insérez l'extrémité de la cassette de distribution dans le flacon de manière à ce qu'elle se situe juste au-dessus de l'agitateur magnétique sans perturber son mouvement. Veillez à ce que les vers restent en suspension dans tout le flacon. Programmez le distributeur pour délivrer les vers à faible vitesse avec deux impulsions préalables d'amorçage et distribuez au moins 10 millilitres de vers en suspension.

Remplir rapidement les plaques de microtitration, qui doivent déjà contenir les composés d'essai, afin d'éviter que les vers ne s'installent dans les tubulures. Ici, le composé d'essai précédemment déposé sur la plaque de microtitration est Glow. Sceller les plaques avec du ruban perméable afin d'empêcher la poussière de s'accumuler dans les puits.

Placer les plaques sur une plateforme agitée dans un incubateur à la température appropriée pour le test. Ne pas empiler les plaques, car cela pourrait restreindre la circulation de l'air. Placer la plaque cible dans un lecteur de microplaque pour mesurer l'intensité de fluorescence de chaque puits aux longueurs d'onde d'émission et d'excitation appropriées ici.

Les filtres utilisés pour la GFP sont une excitation à 485 et une émission à 528. Les filtres pour la RFP sont une excitation à 540 et une émission à 590. Après la lecture de la plaque, calculez le rapport entre la GFP et la RFP et normalisez à l’aide des mesures des puits témoins, qui ne contiennent pas le composé activateur, afin de déterminer précisément le facteur d’augmentation de l’intensité de fluorescence issue des différents traitements.

Le test SSKN à un seul essai présenté ici utilise un double rapporteur intégré au chromosome, une souche chez laquelle les vers ont été comptés manuellement à l'aide d'un microscope stéréo. Le nombre de vers était corrélé au volume distribué avec une valeur R² de 0,94 et une valeur p inférieure à 0,0001. Cela indique que le nombre de vers distribués dans chaque puits peut être contrôlé en ajustant le volume distribué.

La fluorescence totale de la GFP par puits, indiquée à gauche, et la fluorescence de la RFP par puits, indiquée à droite, est hautement reproductible d'un puits à l'autre sur l'ensemble d'une plaque de 384 puits dans ces figures. Les croix (XS) indiquent la fluorescence relative mesurée dans chaque puits. Les lignes continues représentent les moyennes, et les lignes en pointillés indiquent trois écarts-types au-dessus ou en dessous de la moyenne de fluorescence de tous les puits, avec un coefficient de variation inférieur à 9 %. Comme le montre cette figure, la fluorescence GFP provenant du promoteur GST quatre est linéairement corrélée à la fluorescence RFP provenant du promoteur DOP trois sur l'ensemble des 384 puits, avec une valeur R² de 0,62 et une valeur p inférieure à 0,0001.

Par conséquent, le rapporteur RFP non inductible peut être utilisé pour normaliser le rapporteur GFP inductible. Lorsqu'on exprime un ratio de la fluorescence GFP sur RFP, celui-ci devient hautement reproductible d'un puits à l'autre sur une plaque de 384 puits.

Le calcul du rapport entre GFP et RFP a réduit le coefficient de variation à moins de 6 %, démontrant la capacité du rapporteur DOP à trois promoteurs RFP à réduire la variabilité, comme illustré ici. L'induction de GFP par rapport à RFP en présence d'un xénobiotique activateur SK N un est robuste et hautement reproductible sur une plaque 3 84 puits ; les rapports moyens de fluorescence relative de tous les puits témoins et des puits dûs à GLO sont indiqués par des lignes continues. Trois écarts-types au-dessus de la moyenne du témoin et en dessous de la moyenne dlo sont indiqués par des lignes pointillées.

Une fois maîtrisée, la mise en place d'une culture de vers peut être réalisée en environ une heure le premier jour, incluant la collecte et la distribution. La manipulation des vers peut être effectuée en environ deux heures si elle est réalisée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de commencer avec au moins 60 000 vers et de les maintenir en suspension pendant la distribution. Après sa mise au point, cette procédure permet d'effectuer des criblages avec d'autres souches rapporteuses, par exemple, pour d'autres voies induisibles, afin de développer des modulateurs ciblant d'autres voies.

Cette technique peut ouvrir la voie aux chercheurs dans les domaines du criblage à haut débit et de la biosensorerie afin d'identifier rapidement des modulateurs de voies métaboliques parmi de petites molécules ou de détecter des contaminants environnementaux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de comprendre correctement comment cultiver, distribuer et mesurer des souches fluorescentes de *C. elegans* dans le cadre de criblages à haut débit visant à étudier des voies transcriptionnelles inducibles ou à tester plusieurs échantillons pour la présence de contaminants environnementaux.