Name: Criblage à haut débit et de biodétection avec fluorescent C. elegans Souches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Découvrez un protocole de criblage à haut débit utilisant des souches fluorescentes de C. elegans pour détecter des contaminants environnementaux et moduler des voies transcriptionnelles inductibles. Cette méthode permet une quantification robuste de l'expression génique in vivo.

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C. elegans transgènes ont été fournis par le Centre de Génétique Caenorhabditis (Université du Minnesota, Minneapolis, MN). Ce travail a été soutenu par le NIH R21 octroi NS0667678-01 à KS. Tous les auteurs ont participé à la collecte, l&#39;analyse et l&#39;interprétation des données. CKL, KS, et KPC participé à la rédaction et la révision du manuscrit.

1. Préparation de la nourriture vers bactérienne Jour 1 <ol><li> Ajouter 5 ml d'eau saturée E. coli OP50 bouillon de culture bactérienne ml à 500 Terrific complété avec 50 pg / ml de streptomycine et de grandir dans un incubateur agitateur (225 rpm) pendant la nuit à 37 ° C. </li></ol> Jour 2 <ol start="2"><li> Séparer la culture de la nuit bactérienne en dix tubes de 50 ml et les bactéries par centrifugation dans une centrifugeuse réfrigérée à 2.500 rcf pendant 20 minutes. </li><li> Décanter bouillon LB et resuspendre chaque culot bactérien dans 10 ml de liquide milieux de croissance des nématodes (NGM). Secouer horizontalement dans un shaker de plancher pendant 15 minutes pour remettre en suspension les bactéries. Pour faire tampon NGM, ajouter 3 g de NaCl à 1 L d'eau déminéralisée et autoclave. Laisser refroidir à 55 ° C et ajouter dans l'ordre les solutions suivantes stérile: 1 ml de 1 M CaCl 2, 1 ml de 1 M MgSO 4, et 25 ml de phosphate de potassium 1 M, pH 6,0. </li><li> Centrifuger la culture bactérienne dans une centrifugeuse réfrigérée à 2.500 rcf pendant 20 minutes. </li><li> Décanter tampon NGM et peser le culot bactérien. </li><li> Ajouter un volume égal de tampon NGM pour remettre les boulettes, partie aliquote de 3 ml de bactéries se concentrer dans des tubes de 15 ml et conserver à -20 ° C. </li></ol> 2. À grande échelle C. elegans culture liquide Nous utilisons une lignée transgénique VP596 (dvIs19 [pAF15 (TPS-4:: GFP:: SNA)]; vsIs33 [dop-3: DP]) transportant deux constructions fluorescentes: Pgst -4:: GFP 14 pour surveiller SKN-1 activité et PDOP-3: DP 17 pour servir de standard pour la normalisation des numéros ver. Jour 1 <ol><li> Mélanger 150 ml de tampon NGM, 1,5 ml de bouillon LB, 150 pi de 5 mg / ml de cholestérol (dans l'éthanol), et 75 ul de 100 mg / ml de streptomycine. Filtre-stériliser le mélange et ajouter à un ballon de 1 litre stérile. REMARQUE: l'ajout de bouillon LB 1% de tampon NGM aide à prévenir les vers de coller à verre et en plastique, mais ce montant n'est pas suffisant pour soutenir la croissance des bactéries. </li><li> Synchroniser les vers à la procédure standard de l'hypochlorite de 18 ans. Jusqu'à 0,5 ml de vers gravides peuvent être traitées dans un seul tube de 15 ml avec 5 ml de solution d'hypochlorite (3,75 ml d'eau stérile, 1 ml de javel, et 250 pi NaOH 10 N). Lavez les oeufs libérés à l'eau stérile et les remettre en suspension dans 10 ml de tampon NGM. </li><li> Diluez un échantillon d'œufs 100 fois NGM tampon (par exemple, 100 ul dans 10 ml) et de compter le nombre d'oeufs séparés en trois aliquotes de 5 pi. Multiples, le nombre moyen de 200.000 (100 x facteur de dilution 2000) pour estimer le nombre total d'œufs. </li><li> Ajouter 200 000 à 2 millions d'œufs à la fiole avec un tampon de NGM et secouer la culture à 100 rpm, à 20 ° C. </li></ol> Jour 2 <ol start="5"><li> Au moins 16 h après l'ajout d'oeufs dans le ballon, utiliser une pipette stérile sérologique pour enlever environ 0,5 ml de la culture ver suspendu. Pipeter 5 gouttes trois ul sur le couvercle stérile d'une boîte de Pétri. Placez le couvercle dans un congélateur à -20 ° C pendant 1-2 minutes pour paralyser les vers. Comptez le nombre moyen de vers vivants éclos par 5 ul puis plusieurs par 30 000 (150 ml / 5 pl) pour estimer le nombre total de vers éclos. </li><li> Dégeler un tube de gelée OP50 culture bactérienne (protocole 1.6) et ajouter 3 ml de 50% dans la culture OP50 ver par 500 000 vers éclos. Agiter le flacon à 100 rpm à 20 ° C. Worms se développer en larves L4 et les jeunes adultes dans environ 51 heures. La DO600 de bactéries devrait être d'environ 2.200 au début. Surveiller la quantité de bactéries par absorption et d'ajouter de plus si la DO 600 tombe en dessous de 0,900. </li></ol> 3. La collecte et la distribution de Worm Jour 4 <ol><li> Utiliser une pipette stérile sérologique au transfert d'environ 0,5 ml de la culture ver suspendu à une plaque de gélose NGM standard. Afficher les vers avec un stéréomicroscope pour s'assurer que la plupart sont des larves L4 ou de jeunes adultes. Larves L4 aura un spot ventrale claire dans le milieu du corps. Les jeunes adultes seront légèrement plus grand et ne sera pas une tache claire. </li><li> Verser la culture ver dans des tubes de 50 ml stériles et placer les tubes dans un portoir sur la paillasse. Autoriser les vers de se contenter de 10 minutes environ. Eliminer le surnageant par aspiration ou pipetage. REMARQUE: Cette étape peut être important d'enlever les œufs non éclos ou des vers qui ne se développent pas car ils se déposent plus lentement que les larves L4 et les jeunes adultes. </li><li> Ramassez tous les vers dans un seul tube de 50 ml et laver avec un tampon de NGM avec du bouillon LB 1% (NGM + LB) 3-4 fois pour éliminer les bactéries. NOTE: Ceci est fait de mieux dans une centrifugeuse en collectant des vers à 500 fcr pendant 30 sec et en remplaçant le surnageant avec le NGM frais + tampon LB. </li><li> Après le lavage, remplir le tube avec le NGM + tampon LB à 50 ml et versez dans un flacon à vis sans fin personnalisée de distribution. Ajouter un barreau de petites et remuer pour garder les vers suspendu. Comptez èmee nombre de vers en trois 5 gouttes ul comme indiqué plus haut. Diluer avec le NGM + LB jusqu'à ce que vous obtenez 12 à 15 vers par 5 ul baisse (de 2.5 à 3.0 ~ vers / ul). REMARQUE: Un minimum d'environ 20 ml (60.000 vers) est nécessaire pour combler l'espace mort du flacon de distribution et d'une cassette distributeur. Chaque plaque 384 puits nécessite environ 35 000 vers ou 11,5 ml de vers suspendu. </li><li> Chargez une cassette de 10 ul de distribution et stériliser par amorçage avec de l'éthanol à 70%. Rincer l'éthanol par amorçage à l'eau stérile. </li><li> Insérez l'extrémité de la cassette de distribution dans le ballon de sorte qu'il est juste au-dessus de la barre remuez sans perturber son mouvement. Assurez-vous que les vers restent en suspension dans le flacon entier. Programme du distributeur de se passer à basse vitesse avec 2 pré-impulsions. Premier et exécuter au moins 10 ml de vers suspendu. Remplissez plaques comme nécessaire rapidement pour empêcher les vers de s'installer dans le tube. </li><li> Sceller les plaques avec du ruban adhésif respirant. </li><li> Placez les plaques sur une table d'agitation dans un incubateur à la température appropriée pour votre analyse. Ne pas empiler les assiettes. </li></ol> 4. L'analyse par fluorescence <ol><li> Placer la plaque cible dans un lecteur de microplaques pour mesurer l'intensité de fluorescence de chaque puits avec la longueur d'onde appropriée d'émission et d'excitation (Filtres pour notre analyse: la GFP 485/20ex 528/20em; DP 540/25ex 590/35em). </li><li> Calculer le rapport de la GFP / RFP et normaliser les lectures des puits témoin (sans composé activant) pour déterminer la différence exacte pli de l'intensité de fluorescence provenant des traitements individuels. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Notre SKN-1 essai utilise une souche journaliste de chromosomes double intégrée (VP596). Comme le montre la figure 1, le nombre de vers est bien corrélé au volume distribué. Comme le montrent les figures 2A et 2B, le total des GFP et DP de fluorescence par puits est hautement reproductible d'un puits à travers une plaque de 384 puits. Comme le montre la figure 2C, l'ONU-induite Pgst-4:: fluorescence de la GFP est linéairement corrélée à PDOP-3: DP dans 384 puits. Lorsqu'il est exprimé comme un rapport de la GFP / RFP, la fluorescence devient hautement reproductibles d'un puits à travers une plaque de 384 puits (comparer le coefficient de variation de la figure 2D pour 2A) démontrant la capacité de la PDOP-3:: Un journaliste demande de propositions pour réduire la variabilité. Comme le montre la figure 3, l'induction de la GFP relatives à la DP avec un SKN-1 activation des xénobiotiques (38 juglone uM) est robuste et hautement reproductible à travers une plaque de 384 puits. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Nombre de vers en fonction du volume distribué. Worms ont été dilués à environ 2/μl et distribués dans une plaque à 24 puits pour le comptage manuel avec un stéréomicroscope. N = 8 puits par volume. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Fluorescence totale de vers distribuée dans une plaque 384 puits est reproductible. Worms ont été dilués à environ ul 2.5/μl et 30 a été distribué dans chaque puits d'une plaque de 384 puits. GFP (A) et DP (B) de fluorescence de tous les puits ont un coefficient de variation inférieur à 9%. (C) fluorescence de la GFP est fortement corrélé à la DP fluorescence. (D) Calcul du ratio de la GFP à la DP a réduit le coefficient de variation au-dessous de 6% (A, B et D) Les lignes pleines indiquent les moyens et les lignes brisées indiquent trois déviations standard au-dessus ou en dessous de la moyenne. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> . Figure 3 Activation de Pgst-4:: GFP est robuste et cohérente. Environ 75 L4 vers ont été distribués dans tous les puits d'une plaque de 384 puits et 38 uM juglone a été ajouté dans chaque colonne. GFP et DP fluorescence a été mesurée après 21 h d'incubation. La relative moyenne des ratios de fluorescence de tout contrôle (1,0) et la juglone puits (8,9) sont marqués par des lignes pleines. Trois déviations standard au-dessus du contrôle de la moyenne et inférieure à la moyenne juglone sont marqués par des lignes brisées.

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</ol>

Nous présentons une méthode pour la culture et la distribution de grands nombres de nématodes transgéniques. L&#39;équipement utilisé pour les vers de la culture est la norme pour les laboratoires effectuant le clonage moléculaire et la manipulation de liquides et de l&#39;équipement de fluorescence est standard pour les laboratoires de traitement de grands nombres de microplaques. D&#39;autres méthodes de distribution grand nombre de vivre C. elegans nécessitent des particules onéreux équipement de tri 19...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Bouillon LB </td><td> Recherche International Products Corp </td><td> L24066 </td><td></td></tr><tr><td> Terrific Bouillon </td><td> Recherche International Products Corp </td><td> T15100 </td><td></td></tr><tr><td> Synergy ™ HT multi-mode lecteur de microplaques </td><td> BioTek </td><td></td><td> Filtres: GFP 485/20ex 528/20em; DP 540/25ex 590/35em </td></tr><tr><td> MicroFlo Select Distributeur </td><td> BioTek </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Worm flacon de distribution </td><td> Sud Scientific Inc, Micanopy, Floride </td><td></td><td> Personnalisé assemblés (352) 284-2531 </td></tr><tr><td> 384 microplaques </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 5678-1209 </td><td></td></tr><tr><td> Ruban adhésif respirant </td><td> Nunc </td><td> 241205 </td><td></td></tr><tr><td> (5-hydroxy-p-naphthoqinone) Juglone </td><td> ACROS </td><td> 121640010 </td><td> Juglone est dissoute dans du DMSO </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5879 </td><td></td></tr><tr><td> C. elegans transgéniques souche </td><td> Auteur du laboratoire </td><td> VP596 </td><td> Pgst-4:: GFP et PDOP-3: DP </td></tr></tbody></table>

criblage à haut débit et de biodétection avec fluorescent c. elegans souches

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

Criblage à haut débit (HTS) est une approche puissante pour identifier des modulateurs chimiques des processus biologiques. Toutefois, de nombreux composés identifiés dans les écrans en utilisant des modèles de culture cellulaire sont souvent considérés comme toxiques ou pharmacologiquement inactive in vivo 1-2. Dépistage dans les modèles animaux entiers peuvent aider à éviter ces écueils et de rationaliser la voie du développement de médicaments. C. elegans est un organisme modèle multicellulaire bien adapté pour HTS. Il est de petite taille (&lt;1 mm) et peut être économiquement cultivé et distribué dans les liquides. C. elegans est également l&#39;un des modèles animaux les plus dociles expérimentale permettant une identification rapide et détaillée de la drogue mode d&#39;action 3. Nous décrivons un protocole pour la culture et la distribution des souches fluorescentes de C. elegans pour criblage à haut débit de chimiothèques ou la détection de contaminants environnementaux qui modifient l&#39;expression d&#39;un gène spécifique. Un grand nombre de vers de développement synchronisé sont cultivées en milieu liquide, récoltées, lavées, et suspendu à une densité définie. Worms sont ensuite ajoutés au noir, fond plat, plaques 384 puits en utilisant un distributeur péristaltique liquide. Les petites molécules à partir d&#39;une bibliothèque chimique ou échantillons de test (par exemple, eau, nourriture, ou le sol) peuvent être ajoutés aux puits avec des vers. In vivo, en temps réel l&#39;intensité de fluorescence est mesurée avec un lecteur de microplaques à fluorescence. Cette méthode peut être adapté à n&#39;importe quel gène inductible en C. elegans pour lequel un journaliste convenable est disponible. Beaucoup de stress inductible et de développement des voies de transcription sont bien définis dans C. elegans et les souches transgéniques GFP journaliste existent déjà pour beaucoup d&#39;entre eux 4. Lorsqu&#39;il est combiné avec les journalistes appropriée transgéniques, notre méthode peut être utilisée pour dépister les modulateurs voie ou à développer de solides analyses biocapteur pour les contaminants environnementaux. Nous démontrons notre C. elegans culture et de distribution de protocole avec un test HTS nous avons développé pour surveiller le C. &#39;n&#39; elegans bouchon facteur de transcription cols SKN-1. SKN-1 et son homologue de Nrf2 activer des gènes de mammifères cytoprotecteur durant le stress oxydatif et des xénobiotiques 5-10. Nrf2 protège les mammifères de nombreuses liée à l&#39;âge des troubles tels que le cancer, la neurodégénérescence, et de l&#39;inflammation chronique et est devenue une cible majeure chimiothérapeutiques 11-13. Notre analyse est basée sur une GFP journaliste transgéniques pour le SKN-1 gène cible -4 TPS 14, codant pour une glutathion-S 6 transférase. La TPS est également journaliste de -4 un biocapteur pour les produits chimiques xénobiotiques et oxydatif qui activent SKN-1 et peut être utilisé pour détecter de faibles niveaux de contaminants tels que l&#39;acrylamide et le méthyl-mercure, 15-16.

Une procédure de liquides à base de culture et de la distribution de<em&gt; C. elegans</em&gt; Souches exprimant des protéines rapporteur fluorescent est décrite qui ne nécessite pas d&#39;équipement de tri coûteux. Cette approche peut être appliquée à de nombreux inductible<em&gt; C. elegans</em&gt; Des gènes pour la découverte de médicaments ou de biocapteurs de contaminants.

Criblage à haut débit et de biodétection avec fluorescent C. elegans Souches

Le criblage à haut débit (HTS) est une approche puissante pour identifier des modulateurs chimiques de processus biologiques. Cependant, de nombreux composés identifiés dans...

Ce vidéo montre une méthode pour cultiver et distribuer des souches fluorescentes de CL gans afin de réaliser des criblages à haut débit de bibliothèques chimiques ou de détecter des contaminants environnementaux, dans le but d'évaluer l'effet d'agents chimiques ou environnementaux sur l'activité d'une protéine spécifique. Chez CL elgan, des cultures bactériennes sont d'abord préparées comme nourriture pour les vers et des vers transgéniques exprimant la GFP sont synchronisés puis cultivés.Entre 0,5 et 2 millions de vers sont ensuite collectés, lavés et répartis dans 3 plaques de microtitration à 84 puits, puis des petites molécules provenant d'une bibliothèque chimique ou des échantillons à tester, tels que de l'eau, des aliments ou du sol, sont ajoutés aux vers. Enfin, la fluorescence des vers est mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques.L'analyse des données d'intensité de fluorescence révèle des petites molécules capables de moduler des voies transcriptionnelles induisibles ou permettant la détection de contaminants environnementaux. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les tests in vitro ou basés sur des cultures cellulaires, est qu'aucun temps ne sera perdu à étudier des composés toxiques ou inactifs in vivo. Cette méthode à haut débit peut aider à identifier des petites molécules capables de moduler diverses voies induisibles.Bien que nous ayons développé cette méthode pour le criblage à haut débit de bibliothèques de petites molécules, elle peut également être appliquée à la détection de contaminants dans des échantillons alimentaires et environnementaux. La procédure sera démontrée par Andrew Dine, technicien de mon laboratoire, et Q long, postdoctorant de mon laboratoire. Préparez à l'avance la nourriture bactérienne pour les vers.Commencez par inoculer 500 millilitres de bouillon terrific, supplémenté avec 50 microgrammes par millilitre de streptomycine, avec 5 millilitres d'une culture saturée d'E. coli OP50. Placez la culture sur un agitateur et faites-la croître toute la nuit à 37 degrés Celsius.Le lendemain, répartir la culture dans 10 tubes de 50 millilitres. Placer ensuite les tubes dans une centrifugeuse réfrigérée et centrifuger à 2 500 RCF pendant 20 minutes. Après la centrifugation, resuspendre chaque culot bactérien dans 10 millilitres de milieu de croissance liquide pour nématodes, ou milieu NGM.Agiter horizontalement les suspensions. Utiliser un agitateur rotatif pendant 15 minutes pour resuspendre les bactéries. Ensuite, centrifuger la culture bactérienne à 2 500 RCF à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.Versez délicatement le NGM et pesez le culot bactérien. Ajoutez ensuite un volume égal de tampon NGM et remettez en suspension les culots par vortexage. Enfin, aliquotez trois millilitres de la culture bactérienne remise en suspension dans des tubes de 15 millilitres et conservez-les à moins 20 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation.Dans cette démonstration, l'effet du stress induit par le composé étranger Xeno Duke sur le facteur de transcription Sskn1 sera mesuré à titre d'exemple. On sait que Sskn1 active des gènes cytoprotecteurs lors de stress oxydatif et xénobiotique. Une culture à grande échelle de la lignée transgénique Trenchgenic c gans VP596, portant deux constructions fluorescentes, est préparée.Les vers VP 5 96 expriment à la fois le promoteur GST four qui contrôle la GFP, utilisée pour surveiller l'activité du facteur de transcription Sskn un, et le promoteur DOP three qui contrôle la RFP, utilisée comme référence pour la normalisation du nombre de vers.DOP trois est le promoteur d'un récepteur de la dopamine et est exprimé de manière constitutive dans les neurones de tout le corps. Dans l'exemple, étant donné que le xénobion fortement active sskn un et augmente la quantité de GFP exprimée à partir du promoteur GS T quatre, commencez la préparation des cultures en mélangeant 150 millilitres de tampon N NGM, 1,5 millilitre de LB 150, microlitres de cholestérol un molaire et 75 microlitres de streptomycine à 100 milligrammes par millilitre. L'ajout du LB aide à empêcher les vers de coller au matériel en verre et au matériel plastique, mais cette quantité n'est pas suffisante pour permettre la croissance bactérienne.Filtrez le mélange pour le stériliser, puis transférez-le dans un flacon stérile d'un litre et mettez le flacon de côté pour libérer les œufs des vers adultes GR. Lavez les bactéries présentes sur les vers en les centrifugeant et en remplaçant le milieu NGM jusqu'à ce que le surnageant soit clair. Lavez une deuxième fois les vers en les resuspendant dans de l'eau stérile, puis centrifugez à nouveau après la rotation.Retirer le surnageant et remplir le tube avec 3,75 millilitres d'eau stérile. Ajouter un millilitre d'eau de Javel ménagère et 250 microlitres de soude 10 N, puis mélanger immédiatement par retournement cinq à six fois. Placer le tube dans un rotateur après que les vers aient été exposés à l'eau de Javel pendant quatre minutes.Placer le tube sous un microscope stéréo. La majorité des adultes doivent être morts. Agiter vigoureusement le tube de 15 à 20 fois pour aider à tuer tous les vers adultes restants après la lyse, puis laisser agir pendant cinq minutes au total. Ajouter de l'eau stérile jusqu'à ce que le tube soit plein.Mélanger par retournement cinq à six fois pour recueillir les œufs. Centrifuger le tube pendant une minute à 500 RCF. Laver les œufs trois fois à l’aide de Resus, en les resuspendant dans 10 millilitres d’eau stérile, en centrifugeant et en éliminant le surnageant.Ensuite, diluez un échantillon de 100 microlitres d'œufs 100 fois en ajoutant 10 millilitres de tampon NGM. Puis, pipetez trois aliquotes de cinq microlitres sur le couvercle d'une boîte de Pétri sous un microscope. Comptez le nombre d'œufs dans trois aliquotes distinctes de cinq microlitres.Pour estimer le nombre total d'œufs, ajouter de 200 000 à 2 millions d'œufs dans le flacon contenant du tampon NGM et agiter la culture à 100 tr/min à 20 degrés Celsius. Au moins 16 heures après l'ajout des œufs dans le flacon, utiliser une pipette sérologique stérile pour prélever environ 0,5 millilitre de la culture de vers en suspension.Prélèver trois gouttes de cinq microlitres sur le couvercle stérile d'une boîte de Pétri. Placer le couvercle dans un congélateur à moins 20 degrés pendant une à deux minutes afin de paralyser les vers une fois que ceux-ci sont paralysés. Compter le nombre moyen de vers éclos vivants par cinq microlitres à l'aide d'un microscope stéréo pour estimer le nombre total.Décongeler la culture bactérienne OP 50 congelée préparée précédemment en la laissant reposer sur la paillasse pendant quelques minutes. Ajouter ensuite trois millilitres de OP 50 à 50 % par 500 000 vers éclos. Agiter le flacon à 100 tr/min à 20 degrés Celsius.Les vers atteindront le stade des larves L4 et des jeunes adultes en environ 51 heures. Surveillez la quantité de bactéries tout au long de l'incubation par inspection visuelle. Ajoutez davantage de bactéries si le milieu devient clair.Utilisez une pipette stérile de type sérologique pour transférer environ 0,5 millilitre de la culture de vers en suspension sur une boîte de gélose NGM standard. Observez les vers au microscope stéréoscopique afin de vous assurer que la majorité correspondent à des larves L4 et à de jeunes adultes en microscopie en champ clair ; les larves L4 présenteront une tache claire ventrale au milieu du corps. Les jeunes adultes seront légèrement plus grands et ne présenteront pas de tache claire.Ensuite, aspirez la culture de vers dans des tubes stériles de 50 millilitres. Placez les tubes dans un porte-tubes sous la hotte et laissez-les reposer afin que les œufs non éclos ou les vers qui ne se sont pas développés sédimentent. Ces derniers sédimentent plus lentement que les vers développés.Après 10 minutes, éliminer le surnageant, qui contient les vers non éclos et non développés, par aspiration, en ajoutant environ 10 millilitres de tampon NGM à chaque culot et en resuspendant les vers par agitation douce des tubes. Rassembler tous les vers dans un seul tube de 50 millilitres. Faire centrifuger dans une centrifugeuse à godets oscillants à 500 RCF pendant 30 secondes.Ensuite, resuspendre les vers dans 50 millilitres de NGM avec 1 % de lb pour les laver. Répéter cette étape, effectuer trois à quatre lavages pour éliminer les bactéries après le lavage. Remplir le tube avec du NGM additionné de tampon LB jusqu'à 50 millilitres.Verser ceci dans un flacon distributeur de vers personnalisé contenant un barreau aimanté et le placer sur un agitateur magnétique. Un minimum d'environ 20 millilitres ou 60 000 vers est nécessaire pour remplir l'espace mort du flacon distributeur et de la cassette du distributeur. Compter le nombre de vers dans trois gouttes de cinq microlitres comme indiqué précédemment.Après dénombrement sur NGM plus LB, pour une concentration de 12 à 15 vers par goutte de cinq microlitres, chaque plaque de 84 puits nécessite environ 35 000 vers ou 11,5 millilitres de vers en suspension. Charger une cassette de distribution de 10 microlitres dans le distributeur et la stériliser en amorçant avec de l'éthanol à 70 %. Rincer l'éthanol en amorçant avec de l'eau stérile.Insérez l'extrémité de la cassette de distribution dans le flacon de manière à ce qu'elle se situe juste au-dessus de l'agitateur magnétique sans perturber son mouvement. Veillez à ce que les vers restent en suspension dans tout le flacon. Programmez le distributeur pour délivrer les vers à faible vitesse avec deux impulsions préalables d'amorçage et distribuez au moins 10 millilitres de vers en suspension.Remplissez rapidement les plaques de microtitration, qui doivent déjà contenir les composés à tester, afin d'éviter que les vers ne s'installent dans les tubulures. Ici, le composé à tester précédemment chargé sur la plaque de microtitration est Glow. Scellez les plaques avec un ruban perméable à l'air pour empêcher la poussière de s'accumuler dans les puits.Placer les plaques sur une plateforme agitée dans un incubateur à la température appropriée pour le test. Ne pas empiler les plaques, car cela pourrait restreindre la circulation de l'air. Placer la plaque cible dans un lecteur de microplaque pour mesurer l'intensité de fluorescence de chaque puits aux longueurs d'onde d'émission et d'excitation appropriées ici.Les filtres utilisés pour la GFP sont une excitation à 485 et une émission à 528. Les filtres pour la RFP sont une excitation à 540 et une émission à 590. Après la lecture de la plaque, calculez le rapport entre la GFP et la RFP et normalisez à l’aide des mesures des puits témoins, qui ne contiennent pas le composé activateur, afin de déterminer précisément le facteur d’augmentation de l’intensité de fluorescence issue des différents traitements.Le test SSKN à un seul essai présenté ici utilise un double rapporteur intégré au chromosome, une souche chez laquelle les vers ont été comptés manuellement à l'aide d'un microscope stéréo. Le nombre de vers était corrélé au volume distribué avec une valeur R² de 0,94 et une valeur p inférieure à 0,0001. Cela indique que le nombre de vers distribués dans chaque puits peut être contrôlé en ajustant le volume distribué.La fluorescence totale de la GFP par puits, indiquée à gauche, et la fluorescence de la RFP par puits, indiquée à droite, est hautement reproductible d'un puits à l'autre sur l'ensemble d'une plaque de 3 84 puits dans ces figures. Les XS indiquent la fluorescence relative mesurée dans chaque puits. Les lignes continues représentent les moyennes et les lignes en pointillés indiquent trois écarts-types au-dessus ou en dessous de la moyenne de fluorescence de tous les puits, avec un coefficient de variation inférieur à 9 %. Comme le montre cette figure, la fluorescence de la GFP provenant du promoteur GST four est linéairement corrélée à la fluorescence de la RFP provenant du promoteur DOP three sur l'ensemble des 3 84 puits, avec une valeur R² de 0,62 et une valeur p inférieure à 0,0001.Par conséquent, le rapporteur RFP non inductible peut être utilisé pour normaliser le rapporteur GFP inductible. Lorsqu'il est exprimé, le rapport de la fluorescence GFP sur RFP devient hautement reproductible d'un puits à l'autre sur une plaque de 384 puits.Le calcul du rapport entre GFP et RFP a réduit le coefficient de variation à moins de 6 %, démontrant la capacité du rapporteur DOP à trois promoteurs RFP à réduire la variabilité, comme illustré ici. L'induction de GFP par rapport à RFP avec un xéno-biotique activateur SK N un est robuste et hautement reproductible sur une plaque 3 84 puits ; les rapports moyens de fluorescence relative de tous les puits témoins et des puits dlo sont indiqués par des lignes continues. Trois écarts-types au-dessus de la moyenne du témoin et en dessous de la moyenne dlo sont indiqués par des lignes pointillées.Une fois maîtrisée, la mise en place d'une culture de vers peut être effectuée en environ une heure le premier jour, pour la collecte et la distribution. La manipulation des vers peut être réalisée en environ deux heures si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se souvenir de commencer avec au moins 60 000 vers et de les maintenir en suspension pendant la distribution. Suite à cette procédure, des criblages avec d'autres souches rapporteuses, par exemple pour d'autres voies inducibles, peuvent être réalisés afin de développer des modulateurs pour d'autres voies après leur mise au point.Cette technique peut ouvrir la voie aux chercheurs dans les domaines du criblage à haut débit et de la biosurveillance, leur permettant d'identifier rapidement des modulateurs de voies métaboliques sous forme de petites molécules ou de détecter des contaminants environnementaux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de comprendre correctement comment cultiver, distribuer et mesurer des souches fluorescentes de *C. elegans* dans le cadre de criblages à haut débit visant à étudier des voies transcriptionnelles induisibles ou à tester plusieurs échantillons pour la présence de contaminants environnementaux.

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