Name: Vibrodissociation des neurones à partir de tranches de cerveau de rongeurs pour étudier la transmission synaptique et de limage terminaisons présynaptiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Découvrez la vibrodissociation de neurones à partir de tranches de cerveau de rongeurs pour étudier la transmission synaptique et imager les terminaisons présynaptiques. Cette méthode permet un contrôle pharmacologique optimal et l'enregistrement patch-clamp.

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Nous tenons à remercier les Drs. Jun Zhu Ping et Susumu Koyama pour leur aide lors de la configuration initiale de la technique, et le Dr Veronica Alvarez de l&#39;aide pour le formatage du manuscrit. Cette étude a été financée par la Division de la recherche clinique et biomédicale intra-muros des NIAAA.

<ol><li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+potentiates+gabaergic+synaptic+transmission+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Ethanol potentiates gabaergic synaptic transmission in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurophysiol. 96, 433-441 (2006).</li>
<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+endocannabinoid+signaling+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retrograde endocannabinoid signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurosci. 25, 6199-6207 (2005).</li>
<li>Akaike, N., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques%3A+Applications+of+the+nerve-bouton+preparation+in+neuropharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Techniques: Applications of the nerve-bouton preparation in neuropharmacology.</a> Trends Pharmacol Sci. 24, 44-47 (2003).</li>
<li>Akaike, N., Murakami, N., Katsurabayashi, S., Jin, Y. H., Imazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+stimulation+of+single+gabaergic+presynaptic+boutons+on+the+rat+hippocampal+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Focal stimulation of single gabaergic presynaptic boutons on the rat hippocampal neuron.</a> Neurosci Res. 42, 187-195 (2002).</li>
<li>Ye, J. H., Wang, F., Krnjevic, K., Wang, W., Xiong, Z. G., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+glycine+receptors+on+gabaergic+terminals+facilitate+discharge+of+dopaminergic+neurons+in+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic glycine receptors on gabaergic terminals facilitate discharge of dopaminergic neurons in ventral tegmental area.</a> J Neurosci. 24, 8961-8974 (2004).</li>
<li>Koyama, S., Matsumoto, N., Kubo, C., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+5-ht3+receptor-mediated+modulation+of+synaptic+gaba+release+in+the+mechanically+dissociated+rat+amygdala+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic 5-ht3 receptor-mediated modulation of synaptic gaba release in the mechanically dissociated rat amygdala neurons.</a> J Physiol. 529, 373-383 (2000).</li>
<li>Deng, C., Li, K. Y., Zhou, C., Ye, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+enhances+glutamate+transmission+by+retrograde+dopamine+signaling+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+the+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Ethanol enhances glutamate transmission by retrograde dopamine signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from the ventral tegmental area.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1233-1244 (2009).</li>
<li>Murakami, N., Ishibashi, H., Katsurabayashi, S., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+subtypes+on+single+gabaergic+presynaptic+terminal+projecting+to+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium channel subtypes on single gabaergic presynaptic terminal projecting to rat hippocampal neurons.</a> Brain Res. 951, 121-129 (2002).</li>
<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+synaptic+activity+produces+long-lasting+enhancement+of+endocannabinoid+modulation+and+alters+long-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Persistent synaptic activity produces long-lasting enhancement of endocannabinoid modulation and alters long-term synaptic plasticity.</a> J Neurophysiol. 97, 4386-4389 (2007).</li>
<li>Inada, H., Maejima, T., Nakahata, Y., Yamaguchi, J., Nabekura, J., Ishibashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+contribute+to+metabotropic+glutamate+receptor-mediated+inhibition+of+gaba+release+onto+hippocampal+ca3+pyramidal+neurons+in+an+isolated+neuron%2Fbouton+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids contribute to metabotropic glutamate receptor-mediated inhibition of gaba release onto hippocampal ca3 pyramidal neurons in an isolated neuron/bouton preparation.</a> Neuroscience. 165, 1377-1389 (2010).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+recycling+studied+in+transgenic+mice+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptophluorin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6131-6136 (2005).</li>
</ol>

Vibrodissociation réussie exige que les tranches contiennent neurones sains et que les espaces interstitiels sont suffisamment souples pour permettre aux neurones pour sortir de la tranche sans dégâts toxiques. Ainsi, la technique fonctionne de manière optimale au début âges postnataux (P1-21) lors des tranches saines peuvent être faites avec moins de matières gliales / interstiatial que se trouve dans des tranches de cerveau adulte. Dans notre expérience, cependant, l&#39;optimisation de la préparation pour la tranche de la survie neuronale dans la tranche elle-même peut être contre-productif pour la technique vibrodissociation. Alors que nous avons l&#39;habitude de préparer des tranches pour l&#39;enregistrement in situ en utilisant froide aCSF modifié dans lequel le saccharose a été remplacé par une grande partie de la matrice extracellulaire de Na + et Ca 2 +, les tranches préparées pour vibrodissociation peut être préparé (coupure par exemple) dans notre aCSF enregistrement normal. Lors de la préparation des tranches pour l&#39;enregistrement à partir de neurones individuels dans les tranches elles-mêmes, nous aussi placer les tranches de aCSF normale à 35 ° C, juste après la coupe et les laisser pendant 30-60 min à cette température avant de les retourner à la température ambiante. Toutefois, les tranches sont préparées pour vibrodissociation déplacé immédiatement à la température ambiante, juste après le tranchage. Ces procédures fournissent un rendement plus élevé de neurones sains après vibrodissociation, peut-être à cause du manque de tissu interstitiel qui permet cabinet neurones pour être plus facilement détaché de son support de la tranche de lui-même. Nous n&#39;avons pas examiné de manière exhaustive les conditions de préparation de tranches, comme nous avons l&#39;habitude d&#39;obtenir neurones suffisant pour notre enregistrement et des expériences d&#39;imagerie sur un jour donné. Il est possible que des modifications supplémentaires, comme des changements dans l&#39;épaisseur de coupe ou de procédures preincubaton, pourraient être apportées pour accroître le rendement des neurones sains. Très doux traitements protéase ont été essayées dans un effort pour augmenter le rendement des cellules et maîtriser la technique de travailler dans des animaux plus âgés. Toutefois, invariablement, même le traitement de la protéase douce semble pas perturber le fonctionnement des synapses. Ainsi, alors que la combinaison de la protéase et la dissociation mécanique peut encore être trouvée pour le travail qu&#39;il n&#39;a pas fait ses preuves dans les neurones du cerveau antérieur à ce jour. Il convient également de noter le rendement relativement faible des neurones sains après vibrodissociation signifie que la technique est principalement utile pour étudier les sous-types neuronaux abondante, principalement les neurones de projection. La disponibilité des souris exprimant la GFP dans lequel de petites sous-populations neuronales peuvent être facilement identifiés augmente la chance d&#39;étudier ces neurones plus rares. Cependant, à moins de rendement neuronale peut être sensiblement améliorée accumulation de données sur ces neurones est susceptible d&#39;être relativement lente. Plusieurs étapes se sont avérées cruciales pour le chargement réussi de neurones avec du calcium-sensing colorants. L&#39;exposition aux PM-estérifiés teinture est réalisée à 37 ° C, et nous n&#39;avons pas réussi à essayer de colorant de charge à basse température. La concentration des colorants devraient être optimisées considérant à la fois le temps de chargement et de la température car il semble que plus la concentration de colorant de chargement diminue la concentration de calcium dans les boutons présynaptiques. Nous avons observé que des concentrations plus élevées de chargement avec une diminution de la fréquence et l&#39;amplitude de sIPSCs. Lors du chargement de calcium-sensing colorants dans les terminaux présynaptiques des neurones vibrodissociated, il faut prendre soin, car la capacité tampon de l&#39;boutons petits présynaptique peut être différente de celle dans le soma et la taille des boutons ne sont pas compatibles. Neuron contenant les plats sont lavées avec tamponné HEPES solution externe suivants colorant de chargement, et le temps de récupération après le lavage est essentiel. En outre, pour faire une bonne étanchéité des cellules entières d&#39;enregistrement, les cellules doivent être soigneusement lavés à se débarrasser de non internalisés molécules de colorant de la membrane cellulaire extérieure. En plus d&#39;utiliser des neurones vibrodissociated d&#39;imagerie cellulaire électrophysiologie et en direct, des techniques immunocytochimiques peuvent également être appliquées à ces cellules 11,12. Les cellules peuvent être facilement fixés et colorés avec une variété d&#39;anticorps, et autres marqueurs cellulaires. L&#39;utilisation de ces cellules permet une préparation propre pour la visualisation de l&#39;expression des protéines dans les terminaisons présynaptiques GABAergique. En utilisant des souris qui expriment des protéines fluorescentes sous le contrôle de promoteurs spécifiques aux neurones GABAergiques permet à l&#39;enquêteur d&#39;identifier individuellement terminaisons synaptiques dans la préparation de la vibrodissociated (figure 1). Marqueurs fluorescents imagerie de ce type peut permettre des mesures morphologiques dans les terminaux utilisant la microscopie à base de laser et de nouvelles techniques comme la STED (Microscopie épuisement stimulation d&#39;émission). Visualisation avec des colorants que le rapport de vélo vésicules synaptiques est également possible avec cette préparation. Akaike et ses collègues ont qualifié terminaux GABAergiques avec le colorant styryle, FM1-43 pour visualiser les terminaux dans les cellules vivantes 4. Il devrait également être possible d&#39;effectuer une seule cellule de la transcriptase inverse PCR pour l&#39;ARN le profil d&#39;expression dans vibrodissociatedneurones. Cette technique est couramment appliquée à enzymatiquement dissocié les neurones et les neurones en culture cellulaire.

<table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Vibrant Slicer tissus </td><td> Leica Microsystems Inc </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Boîte de culture cellulaire (35 mm) </td><td> BD Falcon </td><td> 353001 </td><td></td></tr><tr><td> Plats à fond de verre </td><td> Willco-vaisselle </td><td> GWSB-5040-3522 Ou GWSB </td><td> 0.16 à 0.19 mm d&#39;épaisseur de verre pour l&#39;imagerie </td></tr><tr><td> Manipulateur piézoélectriques </td><td> Exfo-Burleigh </td><td> LSS-3000 </td><td> Pourrait aussi utiliser le relais, etc </td></tr><tr><td> SD9 Place Pulse stimulateur </td><td> Technologies Herbe </td><td> SD9K </td><td> Pour le déclenchement manipulateur piézoélectriques </td></tr><tr><td> Dissection Stéréoscope </td><td> Wild Heerbrugg </td><td> TYP 374 590 </td><td> Pourrait aussi utiliser n&#39;importe quel stéréoscope </td></tr><tr><td> Flaming / Brown micropipette extracteur </td><td> Instrument Sutter </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Paroi mince capillaires en verre </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> TW-150F-4 </td><td> Pour le verre scellées à la flamme micropipette et patch micropipette </td></tr><tr><td> Six systèmes de perfusion Canal Vanne de régulation </td><td> Warner Instruments </td><td> VC-6 ou VC-6M </td><td></td></tr><tr><td> Perfusion rapide Étape </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-77B </td><td></td></tr><tr><td> Microscope inversé avec 20-63x objectifs </td><td> Nikon </td><td> TS200 Diaphot </td><td></td></tr><tr><td> Caméra EMCCD </td><td> ANDOR technologie </td><td> ixon EM + UA-888 </td><td></td></tr><tr><td> Excite Source de lumière à éclairage par fluorescence </td><td> EXFO Solutions Photonics Inc </td><td> X-Cite 120PC </td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4, AM indicateur de calcium </td><td> Molecular Probes </td><td> F14201 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibrodissociation des neurones à partir de tranches de cerveau de rongeurs pour étudier la transmission synaptique et de l&#39;image terminaisons présynaptiques

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Dissociation mécanique des neurones du système nerveux central a l&#39;avantage de boutons présynaptiques restent attachés à la neurone isolé de l&#39;intérêt. Cela permet à l&#39;examen de la transmission synaptique dans des conditions où les environnements extracellulaires et intracellulaires postsynaptique peut être bien contrôlé. Une technique basée sur les vibrations sans l&#39;utilisation de protéases, connu sous le nom vibrodissociation, est la technique la plus populaire pour l&#39;isolation mécanique. D&#39;une micropipette, avec la pointe polie au feu à la forme d&#39;une petite balle, est placé dans une tranche de cerveau fait à partir d&#39;un P1-P21 rongeurs. La micropipette est vibré parallèle à la surface tranche et abaissé grâce à l&#39;épaisseur de coupe résultant de la libération de neurones isolés. Les neurones isolés sont prêts pour des études au sein de quelques minutes de vibrodissociation. Cette technique a des avantages sur l&#39;utilisation de cultures primaires de neurones, des tranches de cerveau et les neurones isolés enzymatiquement, notamment: la production rapide de viabilité, les neurones relativement matures appropriés pour des études électrophysiologiques et d&#39;imagerie, le contrôle supérieur de l&#39;environnement extracellulaire libre de l&#39;influence des cellules voisines; adéquation pour le bien-contrôlé expériences pharmacologiques en utilisant l&#39;application rapide du médicament et de surfusion total de cellules, et l&#39;amélioration espace-clamp dans la cellule entière par rapport à des enregistrements de neurones dans des préparations ou des tranches de culture cellulaire. Cette préparation peut être utilisée pour examiner synaptique physiologie, la pharmacologie, la modulation et la plasticité. Imagerie en temps réel de ces deux éléments pré-et post-synaptiques dans les cellules vivantes et boutons est également possible en utilisant les neurones vibrodissociated. Caractérisation des constituants moléculaires des éléments pré-et post-synaptiques peuvent également être obtenus avec des approches immunologiques et fondés sur l&#39;imagerie.

Ce rapport démontre une technique d&#39;isolation mécanique de neurones individuels viables conservant attachés boutons présynaptiques. Vibrodissociated neurones ont l&#39;avantage d&#39;une production rapide, un excellent contrôle pharmacologique et amélioré l&#39;espace-pince sans influence des cellules voisines. Cette méthode peut être utilisée pour l&#39;imagerie des éléments synaptiques et patch-clamp.

Vibrodissociation des neurones à partir de tranches de cerveau de rongeurs pour étudier la transmission synaptique et de l&#39;image terminaisons présynaptiques

La dissociation mécanique des neurones du système nerveux central présente l'avantage de permettre aux boutons présynaptiques de rester attachés au neurone isolé de...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'isoler des neurones conservant des batonnets synaptiques pincés attachés, permettant un contrôle pharmacologique et un meilleur clampage spatial tout en éliminant l'influence des cellules voisines. Cela est réalisé en préparant des tranches cérébrales aiguës provenant de rats ou de souris âgés de P1 à P21 contenant la région cérébrale d'intérêt, afin d'isoler individuellement les neurones dans une deuxième étape. Les tranches aiguës sont placées dans une boîte et une micropipette en verre scellée à la flamme est vibrée dans la région d'intérêt tout en déplaçant la pointe à travers la tranche, ce qui libère des neurones individuels.On laisse aux neurones le temps de s'attacher au fond de la boîte. Ensuite, la boîte contenant les neurones dissociés à partir de fibroblastes est transférée sous un microscope afin d'étudier la physiologie, la pharmacologie, la modulation et la plasticité synaptiques, ainsi que pour réaliser des acquisitions d'images en temps réel et caractériser les éléments pré- et post-synaptiques dans la cellule vivante. Les résultats obtenus permettent de déterminer les caractéristiques physiologiques et pharmacologiques des réponses synaptiques ainsi que les modifications associées de la fonction du terminal présynaptique, grâce à l'enregistrement en configuration « whole cell » avec scellement étanche et à la microscopie de fluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'enregistrement à partir de tranches cérébrales, de neurones en culture ou de neurones dissociés enzymatiquement, réside dans le fait que le bourgeon synaptique attaché permet un contrôle et une visualisation précis des éléments présynaptiques, tandis que la structure postsynaptique relativement compacte autorise un meilleur contrôle du clampage de tension et un environnement extracellulaire exceptionnellement maîtrisé.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car le rendement en neurones sains peut varier considérablement selon plusieurs paramètres, tels que l'âge de l'animal, les paramètres de vibration et la région d'intérêt dans la coupe. De plus, les enregistrements cellulaires persistent moins longtemps que sur des lames conventionnelles. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de dissociation par vibration sont difficiles à apprendre, étant donné qu'il est ardu de décrire avec précision la distance de déplacement et la progression à travers la coupe. Pour préparer la réalisation des tranches cérébrales, préparez un liquide céphalorachidien artificiel saturé de carbogène (A CSF) pendant 15 minutes.Ensuite, ajoutez du chlorure de calcium à deux millimolaire et du chlorure de magnésium à un millimolaire. Après avoir anesthésié et décapité un animal âgé de P1 à 21 jours postnataux, retirez le cerveau, puis coupez-le dans l'orientation souhaitée afin d'inclure la région d'intérêt. Fixez le cerveau disséqué sur une platine et immergez-le dans une chambre remplie de SFA.Ensuite, monter la chambre sur un coupe-cerveau et sectionner le cerveau en tranches de 250 à 400 micromètres d'épaisseur à l’aide d’une lame vibrante. Placer les tranches dans un liquide CFS et les saturer avec du carbogène dans une chambre de pré-incubation pendant au moins une heure. Pour préparer une micropipette en verre scellée à la flamme, tirer d’abord une micropipette standard pour enregistrement en configuration patch avec un diamètre d’embout de deux micromètres sur un tireur de micropipettes Flaming Brown ou équivalent.Placer la pointe de micropipette dans la flamme d'un bec Bunsen pendant environ deux secondes afin de former une boule fondue de 200 à 300 micromètres de diamètre. Ensuite, placer la micropipette scellée à la flamme sur un support du micromanipulateur qui peut être rapidement vibré latéralement avec une course de 100 à 200 micromètres à l'aide d'un relais bimorphe piézoélectrique ou d'un dispositif équivalent. Préparer une solution saline tamponnée.Régler la solution avec de l'hydroxyde de sodium à un pH de 7,4 et l'osmolarité avec du saccharose à environ 300 milliosmoles. Ensuite, remplir une boîte de culture de 35 millimètres de diamètre avec une abondante quantité de solution saline tamponnée. Placer une tranche dans la boîte de culture, puis l'observer à l'aide d'un stéréomicroscope à une amplification de 250 x à l'aide d'un fil recourbé.Positionnez la tranche contre le fond de la boîte pour dissocier les cellules. Placez la pointe de la micropipette scellée à la flamme sur la surface de la tranche. Activez le micromanipulateur afin que la pointe vibre latéralement entre 10 et 30 hertz avec une amplitude de déplacement d'environ 100 micromètres.Abaisser la pointe de la micropipette dans la coupe à l’aide du micromanipulateur de manière à traverser toute l’épaisseur en moins de 30 secondes. Répéter cette étape selon les besoins afin de maximiser le nombre de neurones isolés. Ensuite, retirer la pointe de la coupe.Prendre la tranche avec des pinces et l'agiter doucement dans la solution. Ensuite, retirer complètement la tranche de la solution. Laisser les cellules se déposer au fond de la boîte pendant au moins 10 minutes.Placer la boîte contenant les neurones sur la platine d'un microscope inversé et les visualiser avec un objectif de 1 x à 63 x. Rechercher les neurones possédant des membranes lisses, sans boursouflures, et des noyaux visibles mais pas trop gros. Si l'on utilise des optiques en contraste de phase, rechercher les neurones en lumière de phase avec une teinte jaunâtre, mais pas trop bleus.Utilisez un tireur de micropipettes à flamme Brown ou équivalent pour préparer une micropipette de patch standard ayant une résistance au niveau de la pointe comprise entre deux et quatre mégaohms. Remplissez la micropipette de patch avec une solution intracellulaire à base de chlorure de césium pour la mesure des réponses synaptiques, ou avec une solution intracellulaire à base de chlorure de potassium pour l'évaluation des propriétés membranaires intrinsèques et des potentiels d'action. Réalisez l'enregistrement en configuration whole cell par la technique de patch clamp en utilisant des méthodes électrophysiologiques classiques.Enregistrez d'abord les courants post-synaptiques spontanés en utilisant un protocole d'acquisition de données en continu. Ensuite, appliquez une solution extracellulaire contenant 200 nan d'animal ou de tétradoxine et/ou à faible teneur en calcium pour enregistrer les courants post-synaptiques unitaires et modifier la composition moléculaire extracellulaire. Les substances d'intérêt sont chargées individuellement dans l'un des compartiments d'un tube en verre carré fusionné à extrémité plate, qui est positionné près du neurone d'intérêt.Un barillet individuel est exposé au neurone à l'aide d'un micromanipulateur motorisé par un moteur pas à pas qui se déplace latéralement pour permettre un échange de solution en 10 à 100 millisecondes. Observer les bn téléchargés en forte amplification avec un objectif à haute ouverture numérique sur un microscope à caméra ou multiphoton. L'image présentée ici montre un neurone et des bn capturés à l'aide d'une caméra à couplage de charge à multiplication électronique.La puissance de la source lumineuse d'excitation a été atténuée à 1,2 % à l’aide d’un filtre de densité neutre de 1,0 et d’un diaphragme réglé à 12 % de la sortie pendant les enregistrements en régime de blocage de tension. Avec une solution intracellulaire à base de chlorure de césium, des courants synaptiques spontanés sont observés afin de visualiser la fusion vésiculaire. Dans les batonnets présynaptiques, nous avons utilisé des souris exprimant la construction synaptique florine sous le contrôle du promoteur TH1.Le florin synaptique est un construit moléculaire dans lequel le florin écliptique, un mutant de la GFP doté d'une sensibilité accrue au pH, est lié à la protéine membranaire associée aux vésicules. Ce motif est exposé à l'environnement extracellulaire plus neutre, entraînant une augmentation de la fluorescence au niveau de points correspondant aux vésicules et aux terminaisons présynaptiques. La dissociation en fibres de neurones hippocampiques provenant de ces souris permet de visualiser des points fluorescents de taille et de localisation compatibles avec celles attendues pour des terminaisons GABAergiques lors de la réalisation de cette procédure.Il est important de se rappeler que, pour obtenir des neurones sains, vous devez vous assurer d'avoir des tranches saines. Par conséquent, la préparation de tranches cérébrales aiguës constitue une étape cruciale de cette procédure. Après cette étape, d'autres méthodes comme l'immunohistochimie ou la RT-PCR unique cellule peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que les protéines et les espèces d'ARNm exprimées dans les boutons synaptiques ou les neurones postsynaptiques.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment obtenir des neurones sains isolés et comment les utiliser pour l'électrophysiologie ainsi que pour l'imagerie en temps réel.

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Préparation du tissu cérébral nouveau-né du rat pour l’analyse morphométrique ultrastructurale de la distribution synaptique des vésicules aux terminaux nerveux

Nous présentons ici un protocole décrivant la transduction virale de régions cérébrales discrètes avec des constructions optogénétiques pour permettre une caractérisation électrophysiologique spécifique des synapses dans des tranches de cerveau de rongeurs aigus.

Ex Vivo Interrogation optogénétique de la transmission synaptique à longue distance et de la plasticité du cortex préfrontal médian au cortex entorhinal latéral

Ce protocole présente une méthode robuste et détaillée pour obtenir des synaptosomes très purs, des vésicules synaptiques et d’autres fractions synaptiques du cerveau de la souris. Cette méthode permet l’évaluation des processus synaptiques, y compris l’analyse biochimique de la localisation et de la fonction des protéines avec une résolution compartimentale.

Fractionnement subcellulaire pour l’isolement des composants synaptiques du cerveau murin

Découvrez la vibrodissociation de neurones à partir de tranches de cerveau de rongeurs pour étudier la transmission synaptique et imager les terminaisons présynaptiques. Cette méthode permet un contrôle pharmacologique optimal et l'enregistrement patch-clamp.

Vibrodissociation des neurones à partir de tranches de cerveau de rongeurs pour étudier la transmission synaptique et de limage terminaisons présynaptiques (Vidéo) | JoVE Journal

Vibrodissociation des neurones à partir de tranches de cerveau de rongeurs pour étudier la transmission synaptique et de l'image terminaisons présynaptiques

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