Isoler les cellules souches nasal olfactif des rongeurs ou des êtres humains

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules souches olfactives nasales à partir de rats ou d'êtres humains afin d'identifier des anomalies moléculaires ou de réparer un cerveau pathologique ou traumatisé. Cette opération s'effectue tout d'abord par la collecte chirurgicale de biopsies de muqueuse olfactive dans la cavité nasale. Ensuite, on élimine l'épithélium olfactif et ses cellules souches épithéliales afin de se concentrer sur les cellules souches mésenchymateuses ecto dans la lame propre sous-jacente, puis on isole ces cellules en dissociant le tissu de rongeur ou en collectant les cellules émigrantes issues d'implants humains cultivés sous des lamelles de verre.

La dernière étape de la procédure consiste à faire croître des sphères de cellules souches en induisant leur différenciation en cellules semblables à des neurones. En fin de compte, l'échantillon de la muqueuse olfactive entière, composé de cellules souches individualisées, permet d'obtenir des sphères flottantes ou des cellules semblables à des neurones qui peuvent être utilisées pour identifier des marqueurs moléculaires dans les maladies cérébrales ou pour réparer les lésions du système nerveux.

Nous décrivons sa méthode d'isolement de cellules souches nasales humaines et de rongeur à partir de la muqueuse olfactive. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que les cellules souches appartiennent à un tissu nerveux, sont facilement accessibles chez tout individu vivant et peuvent être utilisées pour diagnostiquer ou réparer le cerveau pathologique. En tant que chirurgien ORL, j'ai réalisé des centaines de biopsies nasales à des fins d'études cliniques amusantes.

La procédure est sûre et peut être réalisée sous anesthésie locale générale. Je suis un chercheur junior spécialisé dans la culture de cellules souches humaines ou de rongeur, nasales ou facteurs.

Ces cellules présentent un taux élevé de préparation au stade de surface et une propension à se différencier en types cellulaires neuronaux. Elles se sont révélées efficaces dans des modèles animaux d'amnésie et de maladie neurosensorielle. Avant la collecte de la muqueuse, les biopsies sont placées dans des boîtes de Pétri de 35 millimètres contenant 3 mL de milieu de culture DMEM/Ham F12, préparé dans une hotte de culture stérile.

Maintenant, après avoir vérifié par une pincée de la patte que le rat est en anesthésie profonde avec du pentobarbital sodique, euthanasier par décapitation. Isoler la tête et retirer la peau. Retirer la mâchoire inférieure avec des ciseaux et, à l’aide de son propre juron, éliminer les muscles faciaux des deux côtés en partant de l’arrière des incisives.

À l'aide du Ron Jur, retirez l'os recouvrant la cavité nasale un côté à la fois. Les cornets olfactifs apparaissent comme des organes orangés ou bruns situés à l'arrière du nez ; écartez délicatement les cornets à l'aide de pinces.

À l’aide d’une aiguille de calibre 26, isoler la muqueuse olfactive située sur le septum en découpant le tissu selon trois lignes : l’arc de la lame perpendiculaire, la plaque du CRI et le toit de la cavité nasale. Prélever des biopsies des deux côtés et les transférer dans une boîte de Pétri remplie de milieu A-D-M-E-M ham F 12. Cette procédure ne doit pas dépasser 10 minutes à compter du début de l’euthanasie.

Maintenant, afin d'éliminer le mucus, transférez les biopsies deux fois dans des boîtes de Pétri remplies de milieu conformément aux comités locaux d'éthique compétents. Un chirurgien oto-rhino-laryngologiste doit réaliser cette procédure, et chaque patient ambulatoire doit signer un formulaire de consentement éclairé en utilisant un endoscope rigide à zéro degré ou à 30 degrés. Inspectez les deux cavités nasales et évaluez la présence présumée de polypes ou de toute lésion inflammatoire.

Choisissez la meilleure cavité nasale en tenant compte de la déviation du septum. À l’aide d’un applicateur en coton, appliquez un anesthésique local tel que la lidocaïne avec de l’épinéphrine pendant 10 minutes avec une incision complète. À l’aide de pinces ethmoïdales, prélèvez une biopsie de deux millimètres carrés soit à la racine de l’aspect médial du cornet moyen, soit sur le septum dans la région médiale dorsale.

Ici, nous montrons la biopsie prélevée dans la région racinaire. La biopsie olfactive est ensuite transférée à l’aide d’une aiguille stérile dans un tube stérile de deux millilitres contenant un millilitre de DMEM/F12. Retournez le tube pour vous assurer que la biopsie est bien immergée dans le milieu de culture.

Insérez le tube dans un contenant réfrigéré et transportez-le au laboratoire de recherche. À ce stade, la biopsie peut être utilisée telle quelle pour des études moléculaires comparatives axées sur des maladies cérébrales spécifiques ou traitée afin de générer des cellules souches. Lavez les biopsies humaines ou de rat et incubez les biopsies dans une boîte de Pétri remplie d'un millilitre de dis paste dans du DMEM ham F 12.

Deux solutions pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ensuite, l'épithélium olfactif humain ou de rat est prélevé de la lame propre sous-jacente à l’aide d’une spatule microchirurgicale sous un microscope stéréoscopique éclairé par une lumière inversée diffractée. L’épithélium olfactif est translucide sur un fond noir, contrairement à la lame propre, qui présente des stries orangées-brunâtres sur un fond blanc.

L'épithélium apparaît gris et la lame propre brune une fois purifiée ; transférez la lame propre dans une boîte de Pétri remplie de DMEM/F12. Si le tissu provient d'un rongeur, découpez la lame propre en petits morceaux à l'aide de deux aiguilles de calibre 25. Puis, transférez les morceaux dans un tube de 15 millilitres contenant un millilitre de collagénase I A dans le tube, en utilisant une pipette en plastique stérile pour dissocier le tissu.

Incubez ensuite le tube pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Pour arrêter la dissociation, agitez doucement le tube et ajoutez des millilitres de PBS sans calcium et sans magnésium, puis centrifugez à 200 G pendant cinq minutes. Resuspendez le culot cellulaire dans du milieu de culture et mettez-le en culture dans des boîtes de culture en plastique.

À présent, si le tissu est humain, couper le citron en trois ou quatre morceaux appropriés. Insérer chaque lamelle dans un puits propre de deux centimètres de diamètre, dans une plaque à quatre puits, et recouvrir le tissu avec des lamelles de verre stériles de 1,3 centimètre de diamètre.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres de milieu de culture dans chaque boîte de culture, quel que soit le type de tissu. Renouvelez le milieu de culture tous les deux à trois jours. Après cinq à sept jours de culture, les cellules souches commenceront à envahir la boîte de culture.

Et après deux semaines, elles doivent être confluentes. Lorsque la confluence est atteinte, passez les cellules et transférez-les dans des flacons de culture pour générer des sphères de cellules souches.

Re-séminer les cellules à une densité de 16 000 cellules par centimètre carré dans des flacons prétraités tous les deux jours. Alimenter les cellules avec 0,2 millilitre par centimètre carré de milieu supplémenté. Deux à cinq jours plus tard, recueillir les sphères cellulaires en suspension et soit les réensemencer, soit les dissocier avant la greffe.

Un modèle animal de thérapie cellulaire permettant de différencier les cellules souches olfactives en cellules de type neuronal. Cultivez les cellules pendant 21 jours dans un milieu neurobasal contenant du B27, de la pénicilline, de la streptomycine, de la glutamine et du glutamate, puis effectuez un changement de milieu tous les trois jours. Des cellules de type neuronal devraient apparaître après deux à trois semaines, soit cinq à sept jours après le repiquage.

Les cellules souches olfactives humaines nasales ont émergé de l'explant et se sont rapidement multipliées. Une confluence complète pouvait être atteinte en une à deux semaines. Une caractéristique essentielle des cellules souches, à savoir la formation de nids et l'expression, a été évaluée lorsqu'elles étaient cultivées sur de la polylysine dans un milieu de culture sans sérum, enrichi avec EGF et FGF deux. Les cellules souches olfactives formaient des sphéroïdes lorsque ces derniers étaient ensemencés dans un milieu de culture contenant du sérum.

Dans ce milieu, elles ont donné naissance à des populations cellulaires contenant environ 50 % de cellules exprimant GFAP, jusqu’à 15 % de cellules exprimant la tubuline et jusqu’à 5 % de cellules exprimant oh four. Lorsque les cellules issues des sphéroïdes ont été cultivées dans un milieu de culture neurobasal supplémenté, la majorité de la population est devenue des cellules de type neuronal exprimant la tubuline bêta trois. Ces mêmes cellules de type neuronal exprimaient également la map deux.

Ainsi, le destin des cellules souches pourrait être modifié en un semestre. Cette technique permet facilement de générer et de multiplier des millions de cellules souches en moins de quatre semaines, permettant aux cliniciens d'effectuer ultérieurement une transplantation autologue de cellules. Les biopsies réfractaires nasales sont très utiles pour identifier des biomarqueurs et des maladies cérébrales.

Récemment, nous avons réussi à identifier de nouveaux gènes candidats pour l'autisme. Nous avons déjà constitué une banque de cellules souches olfactives provenant de personnes autistes et de sujets témoins, et celle-ci peut être étendue à d'autres troubles cérébraux humains.