Name: Extraction dADN de matériel inclus en paraffine pour les analyses génétiques et épigénétiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Apprenez l'extraction d'ADN à partir d'échantillons de tissus inclus en paraffine pour les analyses génétiques et épigénétiques. Ce protocole détaillé utilise la déparaffinisation au xylène et la digestion à la protéinase K.

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Nous tenons à remercier les membres du laboratoire de Lam pour leur évaluation et les critiques de cette vidéo et de l&#39;article. Ce travail a été soutenu par des fonds des Instituts canadiens de recherche en santé.

<p class="jove_title"&gt; 1. Notes de procédure</p&gt;<ul&gt;<li&gt; Le xylène et le phénol sont des produits chimiques toxiques et doivent être manipulés dans une hotte. Se référer à la fiche de données sécurité (FDS) avant utilisation.</li&gt;<liXylène&gt; dissout certains plastiques, tubes en polypropylène doit être utilisé comme elles tolèrent ces composés.</li&gt;<liConseils&gt; spéciaux peuvent être achetés qui contiennent un bouchon de charbon de bois interne. Ceci empêche le xylène de dissoudre tous les composants en caoutchouc dans la pipette. Alternativement, bouts filtres peuvent être utilisés.</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 2. L&#39;enlèvement de paraffine</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Dans une hotte, ajouter 800 ul de xylène (VWR, CABDH6216-4) au tube étiqueté contenant votre spécimen et le placer sur un rocker en agitant doucement pendant 5 à 15 minutes pour dissoudre la paraffine.</li&gt;<li&gt; Pellet l&#39;échantillon en faisant tourner à la vitesse maximale (14 000 rpm ou 16 000 xg) dans une microcentrifugeuse pendant 3 minutes. Soigneusement retirer le surnageant xylène et d&#39;en disposer dans un tube en polypropylène pour jeter dans les déchets xylène. Attention à ne pas perturber le culot.</li&gt;<li&gt; Répétez les étapes 1 et lavez le xylène paraffine 2until est entièrement dissous. Cela nécessite généralement deux à trois lavages, selon la taille de l&#39;échantillon de tissu. Un échantillon entièrement dissoute apparaîtra doux, et parfois perdre son intégrité structurale. L&#39;intégrité de l&#39;échantillon peut être évaluée avec douceur une pointe de pipette.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 3. Réhydratation éthanol</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Ajouter 800 ul d&#39;éthanol à 100% (v / v) de l&#39;éthanol moléculaires de biologie, vortex, puis tourner pendant 3 minutes à 14000 rpm dans microcentrifugeuse. Retirer le surnageant d&#39;éthanol, en faisant attention à ne pas perturber le culot.</li&gt;<li&gt; Ajouter 800 ul d&#39;éthanol à 70% (100% (v / v) d&#39;éthanol dilué dans l&#39;eau distillée (dH<sub&gt; 2</sub&gt; O)), vortex et spin pour 3 minutes à 14000 rpm. Retirer délicatement le surnageant d&#39;éthanol.</li&gt;<li&gt; Ajouter 800 ul d&#39;éthanol à 50% (100% (v / v) d&#39;éthanol dilué dans l&#39;eau distillée (dH<sub&gt; 2</sub&gt; O)), vortex et spin pour 5 minutes à 14000 rpm. Retirez délicatement comme l&#39;éthanol autant que possible par pipetage. Soyez extrêmement prudent de perturber le culot à ce point que le tissu ne sera pas complètement réhydraté pellets ainsi que les tissus déshydratés.</li&gt;<li&gt; Après avoir retiré le surnageant d&#39;éthanol, sécher à l&#39;air le culot pendant 5 minutes, en faisant attention de ne pas trop sec.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 4. La digestion des tissus</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Ajouter 200 à 500 ul de tampon de lyse (formule ci-dessous). Re-suspendre le culot à l&#39;aide d&#39;une pipette ou d&#39;un vortex. Des efforts supplémentaires à ce stade entièrement re-suspendre les tissus se traduira par une digestion plus complète de l&#39;échantillon et un meilleur rendement de l&#39;ADN.</li&gt;<li&gt; Incuber les échantillons à 56 ° C dans un bain-marie ou bloc de chauffage.</li&gt;<li&gt; Pour des noyaux des tissus, pointe 20 pl de la protéinase K (20 mg / ml de solution concentrée, Invitrogen, AM2548) matin et soir.</li&gt;<li&gt; Répétez les étapes ci-dessus la digestion de 2 à 5 jours jusqu&#39;à ce que le tissu soit complètement dissous.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_step"Lysis Buffer&gt;</p<ul&gt;<li&gt; 10 mM Tris-HCl pH 8,0</li&gt;<li&gt; 100 mM EDTA pH 8,0</li&gt;<li&gt; 50 mM de NaCl</li&gt;<li&gt; 0,5% de SDS</li&gt;<li&gt; 200 pg / ml de protéinase K (ajouter juste avant utilisation)</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 5. L&#39;ADN nettoyer</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Ajouter un volume égal de phénol saturé de tampon (Fisher, BP1750I-400) et mélanger par retournement. Spin pendant au moins 5 minutes à 14000 rpm dans microcentrifugeuse.</li&gt;<li&gt; Transfert de la couche aqueuse dans un nouveau tube. Notez l&#39;interphase: est ce qu&#39;il ya beaucoup de matière blanche?</li&gt;<li&gt; Répétez les étapes 1 et 2 sur la fraction aqueuse jusqu&#39;à ce que l&#39;interphase est clair (en général 3 fois ou plus). Effectuer des extractions de retour * lorsque l&#39;interphase est floue pour augmenter le rendement final.</li&gt;<li&gt; Une fois l&#39;interphase est clair, ajouter un volume égal de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (25/24/1) (Fisher, BP1752I-400) à la fraction aqueuse extraite de votre échantillon. Mélangez pendant 5 minutes, puis tourner pendant 5 minutes à 14000 rpm. Thisreduces résiduelles de phénol et d&#39;autres aiguise l&#39;interphase, ce qui facilite l&#39;extraction de la couche aqueuse</li&gt;<li&gt; Retirer la couche aqueuse dans un nouveau tube et treatwith RNase A à 100 pg / ml pendant 1 heure à 37 ° C.</li&gt;<li&gt; Répétez les étapes 1 à 4 pour supprimer tout reste RNase A et recueillir la fraction aqueuse. Vous ne devriez avoir besoin 1 ou 2 tampons saturés étapes phénol comme il devrait y avoir beaucoup moins de protéines à éliminer que dans le lysat initiale.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_content"&gt; * Pour effectuer des extractions de retour ajoutez 50-100 ul de DH<sub&gt; 2</sub&gt; 0 dans le tube contenant l&#39;échantillon de l&#39;interphase et la fraction organique. Inverser le tube pour mélanger, et le spin de l&#39;échantillon à 14 000 rpm dans une microcentrifugeuse pendant 5 minutes. Recueillir la phase aqueuse et l&#39;ajouter à l&#39;extraction aqueuse précédemment acquis. Continuer jusqu&#39;au retour des extractions de l&#39;interphase est claire.</p&gt;<p class="jove_title"&gt; 6. L&#39;ADN des précipitations</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Estimation du volume de votre couche aqueuse recueillie.</li&gt;<li&gt; Ajouter 1 / 10 du volume de 3 M pH 5,2 acétate de sodium et 1 volume de 100% d&#39;isopropanol (v / v) de qualité de biologie moléculaire (ou 2,5 volumes d&#39;éthanol 100%).</li&gt;<li&gt; Mélangez bien et mettez sur la glace ou dans un congélateur à -20 ° C pendant 30 minutes ou toute la nuit.</li&gt;<liSpin&gt; à la vitesse maximale (14 000 rpm) à 4 ° C dans microcentrifugeuse pendant 10 minutes</li&gt;<li&gt; Jeter le surnageant.</li&gt;<li&gt; Laver le culot avec de l&#39;éthanol à 70% de la glace froide pour éliminer les sels indésirables.</li&gt;<li&gt; Re-suspendre le culot dans le tampon de choix (généralement dH<sub&gt; 2</sub&gt; O).</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 7. Quantification de l&#39;ADN</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Quantifier la concentration de l&#39;ADN. L&#39;A260: A280 ratio devrait être ~ 1,8. Pour des petites quantités d&#39;ADN, mesure à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre NanoDrop est préférable.</li&gt;<liQuantification&gt; Après, l&#39;électrophorèse sur gel devrait être effectué afin de tester la qualité de votre échantillon d&#39;ADN et de déterminer si la contamination ARN a été complètement dégradée.</li&gt;<li&gt; Haute qualité ADN extrait est maintenant adapté aux applications en aval, ou peuvent être conservés à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. Si l&#39;ARN est toujours présent dans votre échantillon, répéter l&#39;ADN de nettoyage et des étapes de précipitation, et re quantifier et qualifier la qualité de vos échantillons.</li&gt;</ol&gt;

<ol><li>Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+genomic+DNA+from+paraffin-embedded+tissue+sections+of+human+fetuses+fixed+and+stored+in+formalin+for+long+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods.</a> Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).</li>
<li>Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+proteinase+K+action+by+denaturing+agents%3A+application+to+the+isolation+of+nucleic+acids+and+the+degradation+of+%27masked%27+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins.</a> Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).</li>
<li>Sambrook, J. oseph, R, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+Joseph+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).</li>
<li>Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+demonstration+of+whole+genome+array+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Thu, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylated+DNA+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methylated DNA immunoprecipitation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2009).</li>
<li>Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+Paraffin-Embedded+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pathology+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues.</a> Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).</li>
</ol>

Tissus biopsiés ou chirurgicalement excisés pour l&#39;analyse et le diagnostic histopathologique sont souvent fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) pour le stockage à long terme. Avec l&#39;intérêt croissant dans la compréhension des bases génétiques de la maladie, la capacité d&#39;extraire l&#39;ADN de ces échantillons représente une source inestimable de matériel de diagnostic qui peut être utilisé pour l&#39;analyse génomique et les études translationnelles. Historiquement échantillons FFPE n&#39;étaient pas considérés comme une source viable pour l&#39;analyse moléculaire des acides nucléiques peuvent être fortement modifiées par la protéine-acide nucléique et des protéines-protéines réticulation 6. Cependant, la découverte que la digestion de protéase communiqués fragmenté acides nucléiques qui sont adaptés pour des analyses en aval, y compris la PCR, CGH array, le séquençage et le profilage de méthylation, permet l&#39;utilisation de ces spécimens précieux pour l&#39;analyse génétique 6. L&#39;extraction d&#39;ADN à partir des tissus inclus en paraffine est une procédure robuste qui s&#39;appuie sur la solubilité différentielle pour purifier l&#39;ADN. La qualité et la quantité d&#39;ADN extrait et le succès de l&#39;amplification d&#39;ADN ultérieures dépend d&#39;un certain nombre de paramètres avant, pendant et après l&#39;extraction. Il s&#39;agit notamment, mais sans s&#39;y limiter: le type et la quantité de tissu, le type de fixateur utilisé pour la conservation des tissus, la durée de fixation, l&#39;âge du bloc de paraffine et les conditions de stockage, ainsi que la longueur du segment d&#39;ADN voulu être amplifiée 1,7. Retrait de la paraffine du tissu est l&#39;étape la plus critique pour l&#39;extraction de succès que la paraffine non dissous conduit à la qualité des échantillons pauvres et l&#39;inhibition de l&#39;amplification par PCR.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Xylène </td><td> VWR </td><td> CABDH6216-4 </td><td> - </td></tr><tr><td> 1,7 ml microtubes Safeseal </td><td> BioScience Sorenson </td><td> 11510 </td><td> - </td></tr><tr><td> Spectrafuge Microcentrifugeuse 16M </td><td> Labnet </td><td> C0160-B </td><td> - </td></tr><tr><td> Lysis Buffer </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, NaCl 50 mM, SDS 0,5%, 200 pg / ml de protéinase K </td></tr><tr><td> Solution de protéinase K Stock </td><td> Invitrogen </td><td> AM2548 </td><td> 20 mg / ml </td></tr><tr><td> Solution de protéinase K Stock </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampon pH saturés Phénol 6.6/7.9 </td><td> Fisher </td><td> BP1750I-400 </td><td> - </td></tr><tr><td> Phénol: chloroforme: alcool isoamylique (25:24:1, pH 6.7/8.0) </td><td> Fisher </td><td> BP1752I-400 </td><td> - </td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td><td> 100mg </td></tr><tr><td> PH 3M acétate de sodium 5,2 </td><td> - </td><td> - </td><td> 40.81g NaOAc dans 80ml Ajuster le pH à 5,2 avec de l&#39;acide acétique glacial Ajouter dH 2 O à 100ml Autoclave </td></tr><tr><td> ND 3300 Spectrophotomètre </td><td> NanoDrop </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table>

extraction d&#39;adn de matériel inclus en paraffine pour les analyses génétiques et épigénétiques

 DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Le développement et la progression de la maladie sont caractérisés par de fréquentes aberrations génétiques et épigénétiques dont les réarrangements chromosomiques, les gains et pertes du nombre de copies et de méthylation de l&#39;ADN. Les progrès de la haut-débit, les technologies de profilage du génome entier, comme les microréseaux, ont considérablement amélioré notre capacité d&#39;identifier et de détecter ces altérations spécifiques. Cependant, comme la technologie continue de s&#39;améliorer, un facteur limitant reste la qualité de l&#39;échantillon et de disponibilité. Par ailleurs, le suivi des informations cliniques et évolution de la maladie sont souvent recueillies ans après le prélèvement de l&#39;échantillon initial. Les spécimens, généralement fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE), sont stockés dans les archives de l&#39;hôpital pour les années à plusieurs décennies. L&#39;ADN peut être efficacement et effectivement récupérés à partir des échantillons inclus en paraffine, si la méthode appropriée d&#39;extraction est appliquée. L&#39;ADN de haute qualité extraite à partir de spécimens bien conservés et stockés peuvent soutenir dosages quantitatifs pour les comparaisons des tissus normaux et malades et la génération de signatures génétiques et épigénétiques 1. Pour extraire l&#39;ADN à partir d&#39;échantillons inclus en paraffine, les carottes de tissus ou de tissus microdisséquées sont soumis à un traitement xylène, qui dissout la paraffine du tissu, puis réhydratée en utilisant une série de lavages éthanol. Protéines et des enzymes nuisibles tels que les nucléases sont ensuite digérées par la protéinase K. L&#39;ajout de tampon de lyse, qui contient des agents dénaturants tels que le dodécylsulfate de sodium (SDS), facilite la digestion 2. Les acides nucléiques sont purifiés à partir du lysat de tissu à l&#39;aide du tampon saturé centrifugation à vitesse élevée de phénol et qui génère une solution biphasique. ADN et ARN restent dans la phase aqueuse supérieure, tandis que les protéines, les lipides et les polysaccharides sont séquestrés dans les inter-et bio-phases, respectivement. Conservation de la phase aqueuse et répétée extractions au phénol génère un échantillon propre. Après extractions au phénol, RNase A est ajouté pour éliminer l&#39;ARN contaminant. D&#39;autres extractions au phénol après incubation avec de la RNase A sont utilisés pour éliminer toute enzyme restante. L&#39;ajout d&#39;acétate de sodium et de l&#39;ADN précipite l&#39;isopropanol, et centrifugation à grande vitesse est utilisé pour agglomérer l&#39;ADN et de faciliter le retrait d&#39;isopropanol. L&#39;excès de sel reportés de précipitations peuvent interférer avec les dosages enzymatiques ultérieures, mais peut être retiré de l&#39;ADN par lavage à l&#39;éthanol à 70%, suivie par une centrifugation de re-pellets l&#39;ADN 3. L&#39;ADN est remis en suspension dans l&#39;eau distillée ou du tampon de choix, quantifiés et conservés à -20 ° C. ADN purifié peut ensuite être utilisé dans des applications en aval qui incluent, mais ne sont pas limités à, PCR, hybridation génomique comparative 4 (CGH array), immunoprécipitation ADN méthylé (MeDIP) et le séquençage, permettant une analyse intégrative des échantillons de tissu / tumeur.

Cette vidéo montre le protocole d&#39;extraction d&#39;ADN à partir du matériel fixé au formol et inclus en paraffine. Ceci est une procédure de plusieurs jours dans lequel des coupes de tissus sont déparaffinées avec du xylène, réhydratée avec de l&#39;éthanol et traités à la protéinase K pour purifier et d&#39;isoler l&#39;ADN pour l&#39;analyse des gènes spécifiques ou du génome à l&#39;échelle suivante.

Extraction d&#39;ADN de matériel inclus en paraffine pour les analyses génétiques et épigénétiques

Le développement et la progression de la maladie sont caractérisés par de fréquentes aberrations génétiques et épigénétiques, notamment des réarrangements chromosomiques, des variations du nombre de copies...

Cette vidéo montrera comment extraire l'ADN de prélèvements tissulaires inclus en paraffine. L'échantillon utilisé dans cette démonstration est un fragment tissulaire de trois millimètres de diamètre et de six millimètres de longueur. Bien qu'un seul fragment soit utilisé ici, des échantillons plus volumineux, de plus de cinq millimètres de diamètre et de 10 millimètres de longueur, ou deux à trois fragments de la taille utilisée ici, peuvent être traités dans une seule réaction.Cependant, il est important de noter que des ajustements du protocole peuvent être nécessaires afin de garantir l'élimination complète du paraffine et la digestion des tissus. Avant toute manipulation du tissu, la paraffine cireuse qui le préserve doit être dissoute. Ceci est réalisé à l'aide de xylène, étant donné que le xylène et le phénol sont toxiques. Toutes les manipulations avec ces produits chimiques doivent être effectuées sous une hotte aspirante ; ajoutez 800 microlitres de xylène dans le tube contenant votre échantillon.Ensuite, placer l'échantillon sur un agitateur rotatif pendant 10 minutes avec un léger agitation. Centrifuger l'échantillon à 14 000 tr/min pendant trois minutes afin de faire tomber le culot, puis éliminer le xylène et dissoudre la paraffine du tube. Répéter ces étapes deux ou trois fois jusqu'à ce que la paraffine soit complètement dissoute.Le tissu doit apparaître humide et mou. Il est important d'éliminer tout le paraffine afin d'augmenter le rendement final en ADN. Par conséquent, des lavages supplémentaires sont nécessaires pour les échantillons de tissu plus volumineux.À présent que le paraffin a été éliminé de l'échantillon, le tissu doit être réhydraté afin de permettre la digestion tissulaire. Cette étape est réalisée à l’aide d’une série de réhydratation à l’éthanol. Ajoutez d’abord 800 microlitres d’éthanol à 100 % à l’échantillon, vortexez et centrifugez l’échantillon à 14 000 tr/min pendant trois minutes.Éliminer le surnageant. Répéter ces étapes en utilisant 800 microlitres d'éthanol à 70 %, puis en utilisant de l'éthanol à 50 %. La dernière centrifugation doit durer cinq minutes, car le tissu sera moins compact et nécessitera une force plus importante pour former un culot.Le tissu doit maintenant être digéré afin de libérer l'ADN contenu dans les cellules. Cette étape est réalisée à l'aide d'un tampon de lyse, une solution composée d'agents dénaturants des protéines, tels que le SDS et la protéinase K, l'enzyme responsable de la dégradation du tissu.Ajoutez 200 à 500 microlitres de tampon de lyse à l'échantillon. Selon la taille, 400 microlitres constituent un bon volume à utiliser. En effet, les composants du tampon de lyse ainsi que la température d'incubation de 56 degrés Celsius permettent d'optimiser l'activité des protéines.Étant donné que la protéine ACE K dégrade les tissus pendant une durée limitée, il est nécessaire d'ajouter périodiquement davantage d'enzyme pour poursuivre la réaction. 20 microlitres de protéine ACE K à une concentration de 10 milligrammes par M sont ajoutés à l'échantillon le matin et le soir jusqu'à ce que le tissu soit complètement dissous.Lorsque vous ne voyez plus de tissu solide, l'ADN doit être extrait du tampon contenant les débris cellulaires. Le phénol saturé est utilisé pour séparer l'échantillon en phases aqueuse et organique. La phase aqueuse contient l'ADN.Il est important d'utiliser du phénol saturé au tampon, car l'acidité du phénol ordinaire dégrade non seulement votre ADN, mais inverse également la stratification des phases aqueuse et organique. Tenez compte du fait que le phénol saturé au tampon est conservé sous deux phases, le phénol formant la couche inférieure.Ajouter un volume égal de phénol saturé au tampon à l'échantillon et retourner le tube plusieurs fois. Ensuite, placer l'échantillon dans la centrifugeuse et centrifuger à 14 000 tr/min pendant cinq minutes afin d'induire la séparation des phases.L'ADN et l'ARN se trouvent dans la phase aqueuse supérieure, tandis que les protéines, les lipides et les polysaccharides se trouvent dans l'interphase et la phase organique inférieure. Retirer soigneusement la couche aqueuse sans perturber l'interphase et la placer dans un nouveau tube. Souvent, après la première centrifugation, l'interface est floue et instable.Des extractions sont nécessaires en utilisant de petits volumes d'eau. Le protocole pour les extractions inverses est décrit dans le texte accompagnant cette vidéo. Répétez ces étapes jusqu'à ce que l'interface soit claire, ce qui est généralement obtenu après trois à cinq répétitions, puis ajoutez un volume équivalent de phénol-chloroforme, alcool isoamylique à l'échantillon d'ADN.Ceci remplit la même fonction que le phénol seul, mais affine l'interface afin de maximiser le rendement en ADN. Répétez cette procédure une ou deux fois jusqu'à ce que l'interface soit claire et nette. Maintenant que votre échantillon est débarrassé des protéines, tout ARN contaminant doit être éliminé.Cela est obtenu grâce aux ARN. Un ARN de dégradation A est ajouté à l'échantillon à une concentration finale de 100 microgrammes par millilitre, et l'échantillon est incubé pendant une heure à 37 degrés Celsius. Maintenant que l'ARN est dégradé, l'enzyme RNAA doit être éliminée.La procédure de purification de l'ADN est répétée comme précédemment. En utilisant d'abord du phénol saturé au tampon, puis du phénol-chloroforme-alcool isoamylique, moins d'étapes de purification seront nécessaires, car la seule contamination provient désormais de l'enzyme ARN A et de l'ARN dégradé. Maintenant que l'échantillon contient uniquement de l'ADN, l'ADN doit être précipité à partir de la solution : ajouter un dixième du volume d'acétate de sodium et un volume d'isopropanol.Alternativement, on peut ajouter deux volumes et demi d'éthanol, mais un tube plus grand serait alors nécessaire. Incuber l'échantillon à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes à une heure, ou pendant la nuit si vous travaillez tard. Désormais que vous manipulez de l'ADN, veillez à maintenir l'échantillon sur de la glace afin qu'il ne se dégrade pas.Faire centrifuger l'échantillon à 14 000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius afin de former un culot d'ADN précipité. Retirer le surnageant avec précaution pour ne pas déloger le culot, afin d'éliminer les sels en excès qui pourraient interférer avec des expériences ultérieures telles que le séquençage. Par exemple, ajouter un millilitre d'éthanol à 70 % refroidi et resuspendre doucement l'échantillon.Faire centrifuger l'échantillon une fois de plus à 14 000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Retirer soigneusement le surnageant et laisser sécher à l'air tout excès d'éthanol pendant un maximum de cinq minutes. Il est important de ne pas trop dessécher l'échantillon.Enfin, l'ADN est purifié et est prêt à être mis en suspension dans le tampon de votre choix. Ici, nous utilisons de l'eau distillée stérilisée au autoclave. Ah oui.Conservez les échantillons d'ADN à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Une fois l'extraction terminée, vous devez évaluer la qualité et la quantité de votre ADN. Cette opération s'effectue par spectrométrie en utilisant le NanoDrop trois 30 nd, en réglant le type de mesure sur acide nucléique, en sélectionnant ADN 50 comme paramètre de calcul, puis en initialisant l'appareil avec 1,5 microlitre d'eau.Nettoyez le socle et effectuez une mesure de blanc en utilisant 1,5 microlitre de diluant. Dans ce cas, de l'eau distillée. Nettoyez le socle, chargez 1,5 microlitre d'échantillon, puis appuyez sur mesurer. Oui. Parfait.Un rapport A deux 60 sur deux 80 de 1,8 est idéal à ce stade. Votre ADN est prêt à être utilisé dans des applications en aval, qui incluent, entre autres : puces à ADN, hybridation génomique comparative, immunoprécipitation de l'ADN méthylé et séquençage.Les liens vers ces protocoles sont indiqués ici, s’ils ne sont pas nécessaires immédiatement. Conservez vos échantillons à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.

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Cette vidéo montre le protocole pour immunoprécipitation ADN méthylé (MeDIP). MeDIP est une procédure de deux jours qui extrait sélectivement des fragments d'ADN méthylé à partir d'un échantillon d'ADN génomique en utilisant des anticorps avec une spécificité pour la 5-méthylcytosine (anti-5 MC).

Immunoprécipitation ADN méthylé

Dans cette vidéo, nous démontrons le traitement de coupes enrobées de FFPE ou de paraffine fixée au formol obtenues à partir de tissu tumoral gastro-intestinal. Les étapes de déparaffinisation et de réhydratation permettent le traitement de l’échantillon de tissu pour des applications analytiques ultérieures.

Déparaffinisation et réhydratation de coupes de tissus : une procédure en deux étapes pour éliminer la cire de paraffine des lames de tissus FFPE suivie d’une réhydratation tissulaire

La cryosphère offre un accès à des organismes préservés qui ont persisté dans des conditions environnementales passées. Un protocole est présenté à recueillir et à décontaminer les carottes de pergélisol des sols et de la glace. L'absence de colonies exogènes et de l'ADN suggèrent que les micro-organismes détectés représentent la matière, plutôt que la contamination par le forage ou le traitement.

Enlèvement des matériaux exogènes de la partie extérieure des surgelés Cores d&#39;enquêter sur l&#39;Ancien Communautés biologiques nourrissais intérieur

Ce protocole d’extraction modifié améliore les rendements en ARN et en ADN à partir de régions d’intérêt plus précisément ciblées dans les blocs de tissus histopathologiques.

Préparation de Cores de tissus enrobés de paraffine fixés au formol pour les ARN et d&#39;extraction d&#39;ADN

Ce protocole donne un aperçu des procédures d’isolement d’ARN pour le profilage de transcriptomique des tissus ganglionnaires de grands animaux, y compris les étapes dans l’identification et l’excision des ganglions lymphatiques du bétail et la faune, échantillonnage des approches pour assurer la cohérence entre plusieurs animaux et des considérations plus des résultats représentatifs pour la préservation de l’après la collecte et le traitement aux fins d’analyse de RNA.

Collecte et traitement des ganglions lymphatiques des animaux de grande taille pour l’analyse de l’ARN : préparation pour l’étude de transcriptomique ganglion des grandes espèces animales

Ce protocole présente une méthode pour augmenter le pourcentage de teneur tumorale des échantillons de tissus incorporés à la paraffine fixée au formol.

Amélioration du contenu tumoral grâce à la macrodissection tumorale

Ce protocole permet une extraction efficace d’histones de divers échantillons cliniques pour une analyse ultérieure des modifications post-traductionnelles par LC-MS/MS. En facilitant la détection robuste des modifications clés des histones, il constitue un outil précieux pour un profilage épigénétique complet dans de grandes cohortes cliniques.

Extraction d’histones à partir d’échantillons cliniques pour le profilage épigénétique par spectrométrie de masse

Nous présentons ici un protocole pour illustrer l’isolement de cellules cancéreuses rares à partir d’un échantillon artificiel contenant du sang total et avec des cellules cancéreuses du poumon. Le protocole utilise une plateforme d’isolation de cellules semi-automatisée et sans étiquette. Les cellules enrichies sont ensuite analysées pour détecter des mutations des récepteurs des facteurs de croissance épidermiques à l’aide de la PCR numérique des gouttelettes.

Profilage des mutations de l’ADN du récepteur du facteur de croissance épidermique dans des cellules rares circulantes à l’aide d’un système d’isolation cellulaire et de la PCR numérique par gouttelettes

Nous décrivons une méthode pour l'extraction d'ADN de haut poids moléculaire, génomique de la biomasse planctonique concentrés sur des filtres de 0,22 um Sterivex, suivie d'une centrifugation en gradient de chlorure de césium de densité pour la purification.

Extraction de l&#39;ADN à partir de 0,22 Filtres Sterivex uM et le césium Centrifugation gradient de chlorure de densité

Une méthodologie pour isoler de haut poids moléculaire et de haute qualité à partir de l'ADN génomique des communautés microbiennes du sol est décrite.

Extraction d&#39;ADN de haut poids moléculaire génomique par les sols et sédiments

Apprenez l'extraction d'ADN à partir d'échantillons de tissus inclus en paraffine pour les analyses génétiques et épigénétiques. Ce protocole détaillé utilise la déparaffinisation au xylène et la digestion à la protéinase K.

Extraction d'ADN de matériel inclus en paraffine pour les analyses génétiques et épigénétiques

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