Extraction d'ADN de matériel inclus en paraffine pour les analyses génétiques et épigénétiques

Cette vidéo montrera comment extraire l'ADN de prélèvements tissulaires inclus en paraffine. L'échantillon utilisé dans cette démonstration est un fragment tissulaire de trois millimètres de diamètre et de six millimètres de longueur. Bien qu'un seul fragment soit utilisé ici, des échantillons plus volumineux, de plus de cinq millimètres de diamètre et de 10 millimètres de longueur, ou deux à trois fragments de la taille utilisée ici, peuvent être traités dans une seule réaction.

Cependant, il est important de noter que des ajustements du protocole peuvent être nécessaires afin de garantir l'élimination complète du paraffine et la digestion des tissus. Avant toute manipulation du tissu, la paraffine cireuse qui le préserve doit être dissoute. Ceci est réalisé à l'aide de xylène, étant donné que le xylène et le phénol sont toxiques. Toutes les manipulations avec ces produits chimiques doivent être effectuées sous une hotte aspirante ; ajoutez 800 microlitres de xylène dans le tube contenant votre échantillon.

Ensuite, placer l'échantillon sur un agitateur rotatif pendant 10 minutes avec un léger agitation. Centrifuger l'échantillon à 14 000 tr/min pendant trois minutes afin de faire tomber le culot, puis éliminer le xylène et dissoudre la paraffine du tube. Répéter ces étapes deux ou trois fois jusqu'à ce que la paraffine soit complètement dissoute.

Le tissu doit apparaître humide et mou. Il est important d'éliminer tout le paraffine afin d'augmenter le rendement final en ADN. Par conséquent, des lavages supplémentaires sont nécessaires pour les échantillons de tissu plus volumineux.

À présent que le paraffin a été éliminé de l'échantillon, le tissu doit être réhydraté afin de permettre la digestion tissulaire. Cette étape est réalisée à l’aide d’une série de réhydratation à l’éthanol. Ajoutez d’abord 800 microlitres d’éthanol à 100 % à l’échantillon, vortexez et centrifugez l’échantillon à 14 000 tr/min pendant trois minutes.

Éliminer le surnageant. Répéter ces étapes en utilisant 800 microlitres d'éthanol à 70 %, puis en utilisant de l'éthanol à 50 %. La dernière centrifugation doit durer cinq minutes, car le tissu sera moins compact et nécessitera une force plus importante pour former un culot.

Le tissu doit maintenant être digéré afin de libérer l'ADN contenu dans les cellules. Cette étape est réalisée à l'aide d'un tampon de lyse, une solution composée d'agents dénaturants des protéines, tels que le SDS et la protéinase K, l'enzyme responsable de la dégradation du tissu.

Ajoutez 200 à 500 microlitres de tampon de lyse à l'échantillon. Selon la taille, 400 microlitres constituent un bon volume à utiliser. En effet, les composants du tampon de lyse ainsi que la température d'incubation de 56 degrés Celsius permettent d'optimiser l'activité des protéines.

Étant donné que la protéine ACE K dégrade les tissus pendant une durée limitée, il est nécessaire d'ajouter périodiquement davantage d'enzyme pour poursuivre la réaction. 20 microlitres de protéine ACE K à une concentration de 10 milligrammes par M sont ajoutés à l'échantillon le matin et le soir jusqu'à ce que le tissu soit complètement dissous.

Lorsque vous ne voyez plus de tissu solide, l'ADN doit être extrait du tampon contenant les débris cellulaires. Le phénol saturé est utilisé pour séparer l'échantillon en phases aqueuse et organique. La phase aqueuse contient l'ADN.

Il est important d'utiliser du phénol saturé au tampon, car l'acidité du phénol ordinaire dégrade non seulement votre ADN, mais inverse également la stratification des phases aqueuse et organique. Tenez compte du fait que le phénol saturé au tampon est conservé sous deux phases, le phénol formant la couche inférieure.

Ajouter un volume égal de phénol saturé au tampon à l'échantillon et retourner le tube plusieurs fois. Ensuite, placer l'échantillon dans la centrifugeuse et centrifuger à 14 000 tr/min pendant cinq minutes afin d'induire la séparation des phases.

L'ADN et l'ARN se trouvent dans la phase aqueuse supérieure, tandis que les protéines, les lipides et les polysaccharides se trouvent dans l'interphase et la phase organique inférieure. Retirer soigneusement la couche aqueuse sans perturber l'interphase et la placer dans un nouveau tube. Souvent, après la première centrifugation, l'interface est floue et instable.

Des extractions sont nécessaires en utilisant de petits volumes d'eau. Le protocole pour les extractions inverses est décrit dans le texte accompagnant cette vidéo. Répétez ces étapes jusqu'à ce que l'interface soit claire, ce qui est généralement obtenu après trois à cinq répétitions, puis ajoutez un volume équivalent de phénol-chloroforme, alcool isoamylique à l'échantillon d'ADN.

Ceci remplit la même fonction que le phénol seul, mais affine l'interface afin de maximiser le rendement en ADN. Répétez cette procédure une ou deux fois jusqu'à ce que l'interface soit claire et nette. Maintenant que votre échantillon est débarrassé des protéines, tout ARN contaminant doit être éliminé.

Cela est obtenu grâce aux ARN. Un ARN de dégradation A est ajouté à l'échantillon à une concentration finale de 100 microgrammes par millilitre, et l'échantillon est incubé pendant une heure à 37 degrés Celsius. Maintenant que l'ARN est dégradé, l'enzyme RNAA doit être éliminée.

La procédure de purification de l'ADN est répétée comme précédemment. En utilisant d'abord du phénol saturé au tampon, puis du phénol-chloroforme-alcool isoamylique, moins d'étapes de purification seront nécessaires, car la seule contamination provient désormais de l'enzyme ARN A et de l'ARN dégradé. Maintenant que l'échantillon contient uniquement de l'ADN, l'ADN doit être précipité à partir de la solution : ajouter un dixième du volume d'acétate de sodium et un volume d'isopropanol.

Alternativement, on peut ajouter deux volumes et demi d'éthanol, mais un tube plus grand serait alors nécessaire. Incuber l'échantillon à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes à une heure, ou pendant la nuit si vous travaillez tard. Désormais que vous manipulez de l'ADN, veillez à maintenir l'échantillon sur de la glace afin qu'il ne se dégrade pas.

Faire centrifuger l'échantillon à 14 000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius afin de former un culot d'ADN précipité. Retirer le surnageant avec précaution pour ne pas déloger le culot, afin d'éliminer les sels en excès qui pourraient interférer avec des expériences ultérieures telles que le séquençage. Par exemple, ajouter un millilitre d'éthanol à 70 % refroidi et resuspendre doucement l'échantillon.

Faire centrifuger l'échantillon une fois de plus à 14 000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Retirer soigneusement le surnageant et laisser sécher à l'air tout excès d'éthanol pendant un maximum de cinq minutes. Il est important de ne pas trop dessécher l'échantillon.

Enfin, l'ADN est purifié et est prêt à être mis en suspension dans le tampon de votre choix. Ici, nous utilisons de l'eau distillée stérilisée au autoclave. Ah oui.

Conservez les échantillons d'ADN à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Une fois l'extraction terminée, vous devez évaluer la qualité et la quantité de votre ADN. Cette opération s'effectue par spectrométrie en utilisant le NanoDrop trois 30 nd, en réglant le type de mesure sur acide nucléique, en sélectionnant ADN 50 comme paramètre de calcul, puis en initialisant l'appareil avec 1,5 microlitre d'eau.

Nettoyez le socle et effectuez une mesure de blanc en utilisant 1,5 microlitre de diluant. Dans ce cas, de l'eau distillée. Nettoyez le socle, chargez 1,5 microlitre d'échantillon, puis appuyez sur mesurer. Oui. Parfait.

Un rapport A deux 60 sur deux 80 de 1,8 est idéal à ce stade. Votre ADN est prêt à être utilisé dans des applications en aval, qui incluent, entre autres : puces à ADN, hybridation génomique comparative, immunoprécipitation de l'ADN méthylé et séquençage.

Les liens vers ces protocoles sont indiqués ici, s’ils ne sont pas nécessaires immédiatement. Conservez vos échantillons à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.