Trichuris muris Infection: Un modèle de type 2 Immunité et inflammation de l'intestin

L'objectif général de cette procédure est d'établir et de maintenir un modèle d'infection naturelle par hain. Tout d'abord, des souris sont infectées par voie orale avec des œufs de tra curus mirrors par gavage. Vingt et un jours plus tard, les animaux infectés sont euthanasiés et le sang, les ganglions lymphatiques mésentériques, les granulés fécaux, les côlons et le seeker sont prélevés.

À l’aide de ces échantillons, la réponse immunitaire générée contre les tricks peut être analysée. Les miroirs peuvent être analysés. Les échantillons sériques peuvent être analysés par lysa afin de détecter les anticorps spécifiques de TRA.

Une restimulation in vitro des cellules des ganglions lymphatiques peut être réalisée afin d'analyser les réponses immunitaires cellulaires. Des granulés fécaux peuvent être utilisés pour l'évaluation de la teneur en protéines et une analyse de l'expression génique peut être effectuée par analyse en QPCR du côlon. Enfin, l'extrémité du caecum peut être utilisée pour l'histologie, tandis que le reste du caecum peut servir à déterminer la charge parasitaire chez les souris infectées.

En fin de compte, on peut obtenir des résultats indiquant si une souris est résistante ou sensible à l'infection par les MOUs de trais, et la réponse immunitaire dirigée contre le parasite peut être caractérisée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie, telles que les facteurs contrôlant l'activation des cellules T auxiliaires, ainsi que les protéines nécessaires à la différenciation des cellules TH2. Les œufs des MOUs de Trauss peuvent être propagés chez des souris immunodéficientes ou des souches génétiquement sensibles, comme les KR, 35 jours après l'infection, afin de récolter les œufs à partir de souris euthanasiées.

Exposer la surface ventrale de l'animal et rincer l'abdomen de la souris avec de l'éthanol à l'aide de pinces et de ciseaux stériles. Saisir la peau abdominale et pratiquer une petite incision. Exposer le contenu abdominal, identifier le cæcum et le côlon proximal, puis les retirer.

Transférez les organes dans une boîte de Pétri de 10 centimètres contenant du DMEM supplémenté de pénicilline et de streptomycine. Ensuite, ouvrez le caecum et le colon proximal à l’aide de forceps afin d’exposer la lumière et les vers. Placez les organes ouverts dans un bécher contenant du PBS et agitez doucement pour éliminer les matières fécales.

Une fois le cæcum lavé, transférez-le dans une nouvelle boîte de Pétri et utilisez une pince courbe lisse pour extraire délicatement les vers. Transférez tous les vers provenant de chaque souris dans un puits d'une plaque à six puits contenant cinq millilitres de DMEM enrichi en antibiotiques. Placez la plaque à six puits avec une serviette en papier humide à l'intérieur d'un récipient hermétique et incubez à 37 degrés Celsius pendant quatre heures afin de permettre aux vers de pondre leurs œufs.

Après cette incubation, utilisez une pince pour retirer les vers du puits d'origine et répartissez-les dans deux nouveaux puits contenant du DMEM. Cette répartition des vers permettra de maximiser la récupération des œufs à l’aide d’une pipette. Récupérez le milieu restant contenant l’antigène sécrété et les œufs provenant du puits d’origine et transférez-le dans un tube Falcon de 15 millilitres.

Centrifuger le tube à 3000 tr/min pendant cinq minutes. Ensuite, retirer et conserver le surnageant contenant l'antigène de quatre heures et Reese's bend le culot contenant l'œuf dans de l'eau stérile. Placer la plaque à six puits contenant les vers à 37 degrés Celsius une fois de plus et incuber toute la nuit jusqu'au lendemain matin.

Après avoir éliminé les vers, récoltez le contenu des puits comme indiqué précédemment et centrifugez le surnageant pour isoler les œufs. Conservez le surnageant contenant l'antigène de nuit et remettez les œufs en suspension dans de l'eau. Comme auparavant, mélangez ces œufs avec ceux obtenus à partir de l'incubation de quatre heures.

Filtrez les œufs à l’aide d’un tamis de 70 microns afin d’éliminer les vers éventuellement restants. Ensuite, transférez-les dans un flacon carré de 75 centimètres. Recouvrez le flacon de papier d’aluminium pour le protéger de la lumière et conservez les œufs pendant six semaines à température ambiante.

Cela permettra aux œufs de mûrir et d'éclore après six semaines. Lavez les œufs, ajoutez de l'eau et comptez les œufs viables. Illustré ici.

À titre d'exemple d'un œuf embryonné viable et d'un œuf non viable, Reese plie la concentration d'Exeter à 50 par 50 microlitres. À ce stade, les œufs peuvent être conservés à quatre degrés Celsius avant d'injecter les souris. Veillez à bien resuspendre complètement la solution contenant les œufs.

Transférez la quantité souhaitée d'inoculum dans un tube de 14 millilitres à bouchon vissable et retournez le tube pour mélanger. Aspirez 200 microlitres d'œufs dans une aiguille d'alimentation de taille appropriée adaptée à la taille de l'animal, fixée à une seringue d'un millilitre. Saisissez la souris par la nuque et administrez les œufs par gavage oral.

Replacer la souris infectée dans sa cage et laisser l'infection évoluer pendant 21 jours. Après 21 jours, utiliser une seringue non héparinisée pour prélever le sang des souris infectées par ponction cardiaque. Après l'euthanasie par dioxyde de carbone, les échantillons de sang peuvent être conservés à quatre degrés Celsius.

Pour l'isolement du sérum et l'analyse des IgG et IgE spécifiques de tra par ELISA. Exposer la cavité abdominale de la souris comme décrit précédemment. Puis utiliser une pince pour extraire le cæcum à l’aide de ciseaux ou d’une autre pince.

Pousser l'intestin grêle vers la droite afin d'exposer les ganglions lymphatiques mésentériques. Retirer délicatement les ganglions lymphatiques en prenant soin de ne pas sectionner les intestins, puis les placer dans un tube Falcon de 15 millilitres contenant deux millilitres de milieu. Les cellules des ganglions lymphatiques peuvent ensuite être cultivées in vitro avec le surnageant d'antigène S de quatre heures provenant des cultures de vers, afin d'analyser la réponse immunitaire cellulaire contre le parasite.

Une fois les ganglions lymphatiques prélevés, exciser le cæcum et le côlon comme décrit précédemment, à l’aide de pinces, libérer les granulés fécaux du côlon distal et les placer dans un tube d’oxygène de deux millilitres ; les granulés peuvent être conservés à moins 20 degrés Celsius et analysés quant à leur teneur en protéines par immunotransfert (western blot) à l’aide de ciseaux. Prélever environ un centimètre de côlon proximal et le placer dans un tube contenant de l’ARN. Conserver ultérieurement à quatre degrés Celsius.

Coupez environ cinq millimètres de l'extrémité du cæcum en tenant celle-ci avec une pince. Utilisez une seringue de trois millilitres et une aiguille de calibre 22 pour rincer l'échantillon avec du PBS. Transférez-le ensuite dans un tube conique de cinq millilitres à bouchon vissé contenant du paraldéhyde à 4 %.

L'échantillon de caecum fixé au paraldéhyde peut être conservé à quatre degrés Celsius et utilisé pour une analyse histologique. Placer le reste du caecum dans une boîte de Pétri et le congeler à moins vingt degrés Celsius afin d'éliminer les vers. Pour faciliter le dénombrement des vers, décongeler le caecum et le placer dans une boîte de Pétri contenant environ cinq millilitres d'eau à l'aide de ciseaux.

Ouvrir le caecum pour exposer la lumière et secouer afin de recueillir les matières fécales dans une boîte. Placer le caecum propre dans une nouvelle boîte de Pétri contenant de l'eau et utiliser des pinces courbes lisses pour prélever les cellules épithéliales intestinales. Transférer le caecum dans une autre boîte de Pétri contenant de l'eau et déchirer le tissu en petits morceaux.

Observer les fèces, les cellules épithéliales intestinales et le tissu du caecum au microscope stéréoscopique, dénombrer les vers, les retirer au fur et à mesure du comptage et les placer dans une nouvelle boîte. Voici à quoi doivent ressembler les vers présents dans le caecum avant et après l'isolement, comme illustré ici. Après infection, les souris tragus mirrors black six parviennent à contrôler les parasites, tandis que les souris KR développent une charge parasitaire accrue.

Des souris A KR tout aussi sensibles développent des taux nettement plus élevés d'IgG spécifique à TRA que les souris black six, comme déterminé par ELISA sérique. Dans cette expérience, une analyse par immunotransfert a révélé que la quantité de la protéine spécifique des cellules caliciformes, realm bêta, était augmentée dans les selles des souris black six, mais pas dans celles des souris A KR, après infection. Une analyse histologique du cæcum distal montre une hyperplasie des cellules caliciformes et une production de mucus chez les souris black six résistantes infectées par TRAs MOUs, mais pas chez les souris A KR sensibles.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment propager les œufs de trichine, infecter des souris expérimentales et prélever les tissus intestinaux, le mésentère, les ganglions lymphatiques entériques et le sang afin d'analyser l'infection chez des souris sensibles ou résistantes.