Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure Saccharomyces cerevisiae

L’objectif général de l’expérience suivante est de suivre l’absorption des mitochondries dans les vae comme moyen d’étudier l’autophagie des mitochondries, un processus connu sous le nom de mitophagie. Ceci est réalisé en exprimant dans des cellules de levure, un biocapteur de pH à double émission de fluorescence génétiquement codé et ciblé par les mitochondries, nommé Mt Rosea, qui marque les mitochondries avec une fluorescence rouge et verte. Dans un deuxième temps, les cellules de levure sont soumises à une privation d’azote afin d’induire l’autophagie.

Ensuite, nous observons les cellules par microscopie à fluorescence ou microscopie confocale à balayage laser afin de visualiser l’absorption des mitochondries dans le va. On obtient des résultats qui montrent une accumulation de fluorescence rouge mais pas verte dans les VA des cellules privées d’azote. L’indication de l’autophagie des cellules d’une population permet de déterminer le degré de mitophagie.

L’utilisation de rosea pour surveiller l’absorption des mitochondries dans la vacuole des cellules de levure peut fournir des informations mécanistes sur le processus de mii. L’approche peut être adaptée pour surveiller l’autophagie d’autres compartiments cellulaires tels que le noyau, démontrant que la procédure sera dalibor alica, un chercheur postdoctoral de notre laboratoire. Dans ce protocole, nous utilisons la souche de type sauvage BY 4 7 41, et une souche mutante de délétion delta A TG trois, dérivée du même patrimoine génétique pour visualiser la localisation des mitochondries.

Dans ces souches, ils sont marqués avec un rapporteur fluorescent. Rosea Rosea est un biocapteur d’émission bicolore composé d’une protéine fluorescente rouge au pH relativement stable et d’une protéine fluorescente verte sensible au pH. La séquence cible mitochondriale est utilisée pour cibler le biocapteur Rosea sur la matrice mitochondriale.

Ce reporter a été nommé Mt.Rosea, à pH élevé, le biocapteur émet une fluorescence à la fois rouge et verte. Cependant, à faible pH, il n’émet que du rouge fluorescent. La souche de type sauvage est un contrôle pour indiquer les niveaux d’autophagie normalement attendus en tant que contrôle négatif.

Une souche nulle pour l’expression d’un gène essentiel de l’autophagie convient. Étant donné qu’une telle souche ne peut pas livrer les mitochondries à la vacuole, des procédures standard sont utilisées pour transformer les souches de levure avec le plasmide portant le rosala rapporteur mitochondrial ciblé Les plaques de croissance sont incubées pendant deux à quatre jours à 28 à 30 degrés Celsius jusqu’à l’apparition de colonies d’environ deux à trois millimètres de diamètre pour cultiver des cellules pour l’induction de l’autophagie, inoculer pour chaque souche, une seule colonie de levure dans 10 millilitres de croissance. Milieu contenant une source de carbone non fermentescible.

Dans ce cas, de l’éthanol et les suppléments atrophiques de bœuf appropriés. Des cultures en double sont cultivées pour chaque souche, ce qui donne un total de quatre cultures. Incuber les cultures de levure pendant environ 48 heures à 28 à 30 degrés Celsius avec agitation orbitale, moment auquel les cultures devraient être en phase de croissance médiane.

À la fin de la période d’incubation, transférez deux échantillons d’un millilitre de chaque culture dans des échantillons de 1,7 millilitre. Les tubes à centrifuger en plastique à pression granulent doucement les cellules par centrifugation à basse vitesse. Après la centrifugation, retirez et jetez soigneusement le surnageant de chaque tube sans déranger la pastille cellulaire.

Laver les cellules avec un millilitre d’eau distillée stérile par remise en suspension, suivie d’une centrifugation. Répétez le lavage deux fois de plus pour éliminer le fluide résiduel. Après le troisième lavage, remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de croissance, en milieu ou en privation d’azote.

Le milieu de carence en azote moyen contient de l’éthanol, source de carbone, mais manque de suppléments d’azote et induira l’autophagie dans les cellules. Ensuite, réinoculez les cellules remises en suspension dans 10 millilitres de croissance fraîche. Milieu ou 10 millilitres de privation d’azote. Douleur moyenne.

Incuber les cultures avec agitation orbitaire pendant six à 12 heures après l’induction de l’autophagie. Il est utile de confirmer la livraison de Mt Rosea à la vae sous microscope à fluorescence. Les vae peuvent être localisés par marquage à l’aide d’un colorant fluorescent bleu à base de cumerine, tel que sept amino quatre chloro méthyl cumerin, L arginine mi cmac arg en abrégé.

Il n’est pas nécessaire d’effectuer systématiquement l’étiquetage avec cmac ARG, mais il est recommandé pour ceux qui ne sont pas familiers avec l’emplacement et l’apparence de la vacuole chez la levure. Pour commencer la procédure d’étiquetage de la vacuole, transférez des échantillons d’un millilitre de chaque culture dans des tubes à centrifuger en plastique séparés de 1,7 millilitre. Ajoutez ensuite cmac arg à chaque tube.

Incuber les tubes à 28 à 30 degrés Celsius avec une secousse orbitale pendant 30 minutes. Après 30 minutes, granulez les cellules par centrifugation, jetez le surnageant, lavez les cellules avec un millilitre d’eau distillée stérile en suspension, suivie d’une centrifugation. Lavez les cellules deux fois de plus avec de l’eau distillée stérile.

Cette étape élimine le milieu résiduel et l’excès de matrice d’arg cmac. Après le troisième lavage, les cellules sont suspendues dans 100 microlitres d’eau distillée stérile. Les cellules sont maintenant prêtes à être montées pour l’imagerie par microscopie à fluorescence.

Lors de la mise en œuvre de ce protocole, il est très important d’utiliser des cultures de levure fraîchement transformées pour vous assurer d’obtenir des lymphocytes T avec des mitochondries hautement fluorescentes. Pour préparer les cellules de levure vivantes pour l’imagerie par microscopie fluorescente, faites d’abord fondre deux milligrammes d’aéros à bas point de fusion dans des aliquotes séparées d’un millilitre de milieu de croissance et de milieu de privation d’azote en incubant à 70 degrés Celsius pendant une heure, l’aros fondu est maintenu à 70 degrés Celsius. Pour monter les cellules, repérez 20 microlitres d’aros fondus sur un microscope en verre de 76 x 26 millimètres étiqueté.

Faites glisser immédiatement 10 microlitres de suspension de cellules lavées sur le lit d’aros. Couvrez le lit aros avec une gaine en verre de 22 x 22 millimètres. Les cellules se répandront sur la surface de l’agros sous la lamelle.

Scellez ensuite soigneusement les bords de la lamelle avec une fine pellicule de vernis à ongles. Cela empêchera la déshydratation et le mouvement de la lamelle Lors de l’imagerie, lorsque le vernis à ongles est complètement sec, les lames sont prêtes à être visualisées par des cellules de microscopie à fluorescence montées. L’utilisation de cette technique peut être observée jusqu’à une heure après le montage sans aucun effet indésirable apparent sur les cellules.

Étant donné que les cellules de levure sont relativement petites, vous aurez besoin d’un microscope à fluorescence de bonne qualité équipé de filtres d’émission d’excitation adaptés à la visualisation séparée de l’émission GFP et de l’émission RFP et d’un objectif à immersion dans l’eau 60x avec une ouverture numérique de 1,2. Résultats typiques obtenus en utilisant MT Rosea exprimée dans des cellules de type sauvage et en utilisant le balayage laser confocal. La microscopie est montrée ici dans des conditions de non-famine avec de l’éthanol comme source de carbone, tandis que les cellules types présentent une distribution cellulaire typique des mitochondries à la périphérie des cellules de levure qui montrent à la fois une fluorescence rouge et verte.

L’émission de fluorescence rouge et verte n’est pas détectée dans la vacuole. Lorsque MT. Les cellules de type sauvage exprimant Rosea sont soumises à une privation d’azote pendant six heures et plus. Ils présentent, en plus de la fluorescence rouge et verte correspondant aux mitochondries, l’accumulation de fluorescence rouge mais pas verte dans le va.

Ce signal oculaire est révélateur d’une autophagie. L’absorption autophagique des mitochondries ulaires. La localisation de rosea peut être confirmée séparément à l’aide de CMAC arg.

En revanche, les cellules témoins négatives de la mitophagie exprimant MT. Les rosea observées avant la famine et après six heures et au-delà de la famine ne montrent aucune accumulation de fluorescence rouge dans la vacuole. Bien que le marquage mitochondrial reste fort pour évaluer le niveau d’autophagie dans le type sauvage et les souches mutantes A TG trois, plus de 200 cellules par souche ont été observées pour l’accumulation de fluorescence rouge dans l’ole avant l’induction de l’autophagie et à des moments choisis Après l’induction de l’autophagie Le tracé de la proportion de cellules montrant une accumulation ulaire révèle que le degré d’absorption ulaire augmente avec le temps dans les cellules de type sauvage, mais pas dans delta ATG trois cellules mutantes qui ne peuvent pas délivrer de mitochondries à la vacuole Après son développement. Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine de l’autophagie d’explorer la livraison des mitochondries et d’autres organites tels que le noyau à l’AV et les différentes conditions de croissance dans ces cellules.