Name: Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure Saccharomyces cerevisiae (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Découvrez une méthode de microscopie à fluorescence pour surveiller la mitophagie dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Ce protocole utilise le biosenseur Mt Rosea pour visualiser la dégradation mitochondriale en temps réel.

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Ce travail a été soutenu par l&#39;Australian Research Council DP0986937 Grant.

Sélection de souches de levures appropriées de contrôle Le dosage repose sur la expérimentateur visuellement l'évaluation de l'accumulation de la fluorescence rouge dans la vacuole de levure. En tant que tel, le dosage est subjective et repose sur la sélection de souches de contrôle appropriés et les conditions de croissance. Un contrôle de type sauvage est utilisé pour indiquer les niveaux de l'autophagie normalement prévu. Comme témoin négatif un null souche pour l'expression de l'un des gènes autophagie base (par exemple, ATG3) est adapté, de telles souches ne peut pas livrer le matériel (par exemple, les mitochondries, noyau) vers la vacuole 1. Transformation de cellules de levure avec de l'ADN plasmidique Les cellules de levure peuvent être facilement rendues compétentes pour la transformation par traitement avec LiAcetate. Les kits commerciaux peuvent être achetés (par exemple, EasyComp, Invitrogen) et les protocoles publiés sont disponibles 13. Dans ce protocole, nous utilisons sauvage BY4741 souche type (MAT atg3) qui en découlent, chaque expression d'un manque différente gène non essentiel La bibliothèque souche suppression représente un outil précieux pour étudier l'autophagie en utilisant Rosella à base de sondes. Le journaliste a utilisé dans ce protocole est mt-Rosella des mitochondries (figure 2A), codée par pAS1NB: mt-Rosella 12. Les étapes suivantes sont basées sur l'utilisation de cellules rendues compétentes en utilisant le kit de transformation EasyComp et conservés congelés à -80 ° C pour une utilisation pratique. <ol><li> Equilibrer Solution III (EasyComp Transformation Kit) à la température ambiante pendant 30 minutes avant d'ajouter les cellules de levure. </li><li> Ajouter 2 à 2,5 ul (~ 100 ng / ul) de l'ADN plasmidique codant pour le journaliste (pAS1NB: mt-Rosella) à une solution stérile de 1,7 ml snap-cap microtube plastique. </li><li> Ajouter 5 &amp; mu, L de suspension fraîchement décongelé des cellules de levure compétentes et mélanger par pipetage doux. </li><li> Ajouter 50 ul de la solution III (EasyComp Transformation Kit) et vortex pour mélanger. 1,5) Incuber les réactions de transformation de 1 heure à 28-30 ° C avec un mélange vigoureux toutes les 15 minutes à l'aide d'un mélangeur à vortex ou manuellement par agitation du tube avec le doigt. </li><li> Transférer soigneusement le mélange de transformation sur une plaque de gélose unique YMM croissance supplémenté en histidine, la méthionine et l'uracile, et lentement distribuer les cellules autour de la surface de la gélose avec une spatule en verre stérile. Les cellules de levure sont fragiles à ce stade et une manipulation en douceur peut augmenter le rendement des transformants. </li><li> Incuber les plaques de croissance de 2 à 4 jours à 28-30 ° C ou jusqu'à ce que les colonies apparaissent environ 2-3 mm de diamètre. </li></ol> 2. Confirmant l'expression de Rosella dans des cellules de levure Avant de se lancer dans des expériences détaillées de la localisation correcte et efficace expression de Rosella doit être confirmée. <ol><li> En utilisant des cure-dents stériles sélectionner pour chaque 5 déformation des colonies isolées de la plaque de transformation et de remettre les cellules dans 50 ul d'eau stérile à 1,7 ml stériles distinctes composant logiciel enfichable bouchon microtube plastique. </li><li> Placer 10 ul de chaque suspension cellulaire sur différents étiquetés lames de microscope (76 x 26 mm) et couvrent la suspension cellulaire avec une lamelle carré (22 x 22 mm). </li><li> Immédiatement examiner les cellules de l'émission de fluorescence en utilisant un microscope à fluorescence (par exemple, Olympus Fluoview FV500). Rechercher fluorescence verte et rouge fort et d'étiquetage typique de localisation mitochondriale (Fig. 2B et 2C). </li><li> Le reste de chaque colonie a examiné pour la fluorescence de cette manière doit être inoculé sur une plaque de croissance YMM frais. </li><li> Incuber les boîtes à 28-30 ° C pendant 2 jours jusqu'à colonie sont environ 2-3 mm de diamètre. </li></ol> 3. La croissance cellulaire etl'induction de l'autophagie Autophagie peut être induite en utilisant un certain nombre de différentes conditions expérimentales, dont l'entrée en phase stationnaire, le changement de source de carbone, de l'administration de rapamycine, ou d'azote famine. Nous utilisons régulièrement la famine comme méthode d'azote pour induire mitophagy. <ol><li> Inoculer une colonie isolée dans 10 ml de milieu de culture contenant de l'éthanol et les suppléments auxotrophes appropriés. </li><li> Incuber les cultures de levures à 28-30 ° C avec agitation orbitale (200 rpm) pendant environ 48 heures. Les cellules doivent être en phase de croissance semi-logarithmique. </li><li> Sédimenter les cellules du double des échantillons de 1 ml de la culture dans 1,7 ml stériles snap-cap tubes à centrifuger en plastique par centrifugation à 2000 xg pendant 2 minutes à température ambiante. Retirez délicatement et jeter le surnageant sans perturber le culot cellulaire. </li><li> Laver les cellules trois fois avec 1 ml d'eau distillée stérile par remise en suspension suivie d'une centrifugation pour éliminer m résiduelleoyen. </li><li> Après le troisième lavage remettre en suspension les cellules dans 100 ml de milieu de croissance ou de l'azote famine milieu. </li><li> Re-ensemencer les cellules remises en suspension dans 10 ml de milieu de croissance frais ou 10 ml azote famine moyenne. Incuber sous agitation orbitale pendant 6-12 heures pour permettre l'induction de mitophagy. Après la famine préparer des cellules pour la visualisation par microscopie à fluorescence. </li></ol> Remarque: l'étiquetage de la vacuole avec CMAC-Arg Lors de la première place du test, il est utile pour confirmer la livraison sous microscope à fluorescence de Rosella à la vacuole. Bien que la vacuole de la levure est un organite grande dont la localisation peut souvent être facilement déterminée par référence à des images transmises lumière, dans certaines souches de levure et sous certaines conditions de croissance de la vacuole peut être fragmentée et difficile à localiser. La vacuole peut être facilement marquée en utilisant un colorant à base de coumarine tels que vacuole CMAC-Arg (7-amino-4-chloromethylcoumarin, la L-arginine amide). L'action des protéases vacuolaires sur les résultats de colorant dans l'étiquetage de fluorescence bleu vif de la vacuole. L'émission bleue peuvent être facilement distingués des émissions rouge et verte de Rosella 11. Le marquage avec CMAC-Arg n'a pas besoin d'être réalisée en routine, mais il est recommandé pour ceux qui ne sont pas familiers avec l'emplacement et l'apparence de la vacuole dans la levure. 4. L'étiquetage de la vacuole avec CMAC-Arg <ol><li> Ajouter le CMAC-Arg (100 mM de concentration finale) pour les cellules en croissance ou en manque d'azote avant l'imagerie. La solution CMAC-Arg peut être préparé à l'avance, mais que la solution est sensible à la lumière dont il a besoin d'être protégé contre l'exposition à la lumière. </li><li> Incuber à 28-30 ° C avec agitation orbitale (200 rpm) pendant 30 minutes. </li><li> Sédimenter les cellules par centrifugation à 2000 xg pendant 2 minutes à température ambiante. </li><li> Jeter le surnageant. </li><li> Laver les cellules trois fois avec distillée stérilepar remise en suspension de l'eau suivie d'une centrifugation pour enlever des résidus du fluide et de l'excès CMAC-Arg colorant. </li><li> Monter les cellules pour l'imagerie tel que décrit ci-dessous. </li></ol> 5. Montage des cellules de levure vivantes pour la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) <ol><li> Fondre 2 mg de l'agarose bas point de fusion distincts en aliquots de 1 ml de milieu de croissance et de l'azote famine support par incubation à 70 ° C. L'agarose fondu est maintenue à 70 ° C. </li><li> Délicatement les cellules de granulés aliquotes de 1 ml de chaque culture cellulaire par centrifugation à 2000 xg pendant 2 minutes à température ambiante et jeter le surnageant. </li><li> Laver les cellules trois fois avec 1 ml d'eau distillée stérile par remise en suspension et centrifugation comme à l'étape 5.2. </li><li> Remettre en suspension les cellules lavées dans 100 ul d'eau distillée stérile. </li><li> Pour monter l'endroit cellules 20 pl d'agarose fondu sur une lame de microscope en verre marquée (76 x 26 mm). </li><li> Détecter immédiatement 10 pi de l'lavé cell suspension sur le lit d'agarose. </li><li> Couvrir le lit d'agarose avec une lamelle (22 x 22 mm). Les cellules seront répartis sur la surface d'agarose sous la lamelle. </li><li> Pour prévenir la déshydratation et le mouvement de la lamelle lors de l'imagerie soin de sceller les bords de la lamelle d'une fine pellicule de vernis à ongles. </li><li> Lorsque le vernis est complètement sec (10 min), la diapositive est prêt à afficher par microscopie de fluorescence Attention: vernis à ongles peut causer des dommages aux objectifs de microscope. </li><li> Les cellules montées en utilisant cette technique peut être observée jusqu'à 1 heure après le montage. </li></ol> 6. Autophagie visualiser à l'aide CLSM Le niveau de l'autophagie dans une population de cellules est régulièrement évaluée en déterminant le nombre de cellules présentant une fluorescence rouge vacuolaire avant et après l'induction de l'autophagie. Idéalement, la progression de l'autophagie est surveillé à des moments choisis suivant l'induction de l'autophagie (fig. 3). Le mieux est effectué en visualisant à travers les jumelles microscope. Il est important que les contrôles appropriés sont utilisés (par exemple, Δ atg3 mutant) et que les réglages du microscope restent inchangés entre l'observation des échantillons différents (par exemple, utilisation de filtres de densité neutre, filtre de sélection). Les cellules de levure sont relativement faibles nécessitant un microscope à fluorescence de bonne qualité (par exemple, Olympus Fluoview FV500) équipé d'excitation / émission des filtres appropriés pour la visualisation séparée de la GFP et / ou pHluorin (fluorescence verte d'émission) (filtre FITC) et DsRed.T3 (rouge émission de fluorescence) (TRITC filtre). <ol><li> L'utilisation d'un point de vue objectif 60x eau non affamés cellules de type sauvage en utilisant alternativement les filtres FITC et TRITC. Cellules de type sauvage doit présenter une distribution cellulaire typique des mitochondries à la périphérie des cellules qui montrent une fluorescence rouge et vert. Noter que cette répartition des mitochondries dépend de la Pinhole réglage du microscope confocal. On utilise généralement une valeur inférieure à sténopé de 125 um, qui permet seulement les mitochondries à être observé comme une série de points localisés à la périphérie de la cellule (Fig. 2C), de sorte que la vacuole est non masquée 12. Si une valeur élevée de trou d'épingle (200 um) est utilisé, il permet au réseau filamenteux typique mitochondrial distribués dans toute la cellule (et les changements qu'elle subit) à observer 11. Pas d'autres structures dans la cellule doit être marqué par fluorescence. </li><li> Voir successivement les cellules pour chacun des points dans le temps après le transfert à moyen famine. Visualiser en alternance à l'aide des filtres d'émission verte et rouge. À la 6 famine h heure du point de fluorescence rouge, mais pas d'émission correspondant verte doit être perceptible dans la vacuole. Localisation vacuolaire peut être confirmé en utilisant séparément CMAC-Arg (Fig. 2C). Voir ~ 200 cellules et compter le nombre qui montrent que la fluorescence rouge dans levacuole (c.-à-absorption vacuolaire des mitochondries). </li><li> Comptez accumulation vacuolaire pour tous les points de temps d'observation&gt; 200 cellules, puis de pourcentage parcelle de cellules présentant une accumulation vacuolaire. </li><li> Examiner les cellules de contrôle autophagie négatives exprimant mt-Rosella avant la famine et la faim après 6 h. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: Ici, nous montrons des résultats typiques obtenus en utilisant mt-Rosella, exprimée en type sauvage et Δatg3 cellules mutantes. Dans des conditions de culture avec de l'éthanol comme source de carbone, à la fois sauvage et Δatg3 cellules mutantes présentent une distribution cellulaire de fluorescence (rouge et vert) typique des mitochondries dans les cellules de levure. Rouge et verte fluorescence d'émission n'est pas détecté dans la vacuole (Fig. 2B et 2C). Lorsqu'il est soumis à la famine azote pendant 6 heures et au-delà, puis, en plus de la fluorescence rouge et verte correspondant à des mitochondries, cellules de type sauvage aussi expol'accumulation des bits rouge, mais pas de fluorescence verte dans la lumière vacuolaire (Fig. 2B;. Fig 3). Cependant, dans Δatg3 cellules mutantes ni rouge, ni verte fluorescence s'accumule dans la lumière vacuolaire (Fig. 2C;. Fig 3). <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Haut, le régime des organites et des compartiments dans une cellule de levure. Fond, une vue vacuole centrée sur une cellule de levure est présenté indiquant la dégradation autophagique de différents organites et les compartiments. Certaines des différences entre les divers organites spécifiques types d'autophagie (par exemple, mitophagy, nucleophagy) comprennent la spécificité (sélection fret) du contenu englouti, divers besoins intracellulaires et extracellulaires indices (par exemple, la famine, les dommages), des signaux spécifiques, ATG gènes et en fonction du temps. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2a.jpg" alt="Figure 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2a"><img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2b.jpg" alt="Figure 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2b"> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2c.jpg" alt="Figure 2c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2c"> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2d.jpg" alt="Figure 2d" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2d"> Figure 2. Représentation schématique (A) du mt-Rosella. La séquence leader mitochondrial (dans ce cas, de la citrate synthase) est utilisé pour cibler le biocapteur Rosella à la matrice mitochondriale. Excitation et d'émission pour les deux maxima protéine fluorescente rouge (DsRed.T3) et la protéine fluorescente verte (pHluorin) sont indiqués. A un pH élevé (pH ~ 8,2 mitochondrial) le biocapteur fluorescent rouge et vert, cependant, à un pH bas (pH vacuolaire ~ 5,5), il émet une fluorescence rouge seulement. (B) Représentation schématique des résultats escomptés de type sauvage et Δ atg3 cellules mutantes exprimant mt-Rosella. (C) Les résultats réels obtenus par CLSM pour les cellules de type sauvage et des conditions de plus en plus sous azote famine. De gauche à droite: DIC (difrence de contraste), DP (DsRed.T3) d'émission de fluorescence, la GFP (pHluorin) d'émission de fluorescence, CMAC-Arg fluorescence et de l'image de fusion. (D) Les résultats réels obtenus par microscopie à fluorescence pour Datg3 cellules mutantes moins de croissance et des conditions de famine azote. De gauche à droite: DIC (différence de contraste), DP (DsRed.T3) d'émission de fluorescence, la GFP (pHluorin) d'émission de fluorescence, CMAC-Arg fluorescence et de l'image de fusion. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Le pourcentage de type sauvage et Δ atg3 cellules mutantes, exprimant mt-Rosella et cultivés dans la famine azote, montrant une fluorescence rouge dans la vacuole au cours d'une évolution dans le temps de 48 heures. Le pourcentage de cellules présentant une accumulation de fluorescence rouge dans la vacuole a été enregistrée à 0, 6, 12, 24 et 48 heures après le début de la famine azote.

<ol><li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+the+pathogenesis+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy in the pathogenesis of disease.</a> Cell. 132, 27-42 (2008).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+mechanisms+and+signaling+pathways+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy.</a> Annu. Rev. Genet. 43, 67-93 (2009).</li>
<li>Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+the+integrated+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy and the integrated stress response.</a> Mol Cell. 40, 280-293 (2010).</li>
<li>Camougrand, N., Kissová, I., Salin, B., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+mitophagy+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Monitoring mitophagy in yeast.</a> Methods Enzymol. 451, 89-107 (2008).</li>
<li>Yen, W. L., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+live+long+and+prosper%3A+autophagy%2C+mitochondria%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">How to live long and prosper: autophagy, mitochondria, and aging.</a> Physiology (Bethesda). 23, 248-262 (2008).</li>
<li>Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitophagy.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1793, 1508-1515 (2009).</li>
<li>Bhatia-Kissová, I., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+in+yeast%3A+actors+and+physiological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Mitophagy in yeast: actors and physiological roles.</a> FEMS Yeast Res. 10, 1023-1034 (2010).</li>
<li>Kanki, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+of+mitochondria+autophagy+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism of mitochondria autophagy in yeast.</a> Mol. Microbiol. 75, 795-800 (2010).</li>
<li>Nowikovsky, K., Reipert, S., Devenish, R. J., Schweyen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm38+protein+depletion+causes+loss+of+mitochondrial+K%2B%2FH%2B+exchange+activity%2C+osmotic+swelling+and+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Mdm38 protein depletion causes loss of mitochondrial K+/H+ exchange activity, osmotic swelling and mitophagy.</a> Cell Death Differ. 14, 1647-1656 (2007).</li>
<li>Devenish, R. J., Prescott, M., Turcic, K., Mijaljica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+organelle+turnover+in+yeast+using+fluorescent+protein+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Monitoring organelle turnover in yeast using fluorescent protein tags.</a> Methods Enzymol. 451, 109-131 (2008).</li>
<li>Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosella%3A+a+fluorescent+pH-biosensor+for+reporting+vacuolar+turnover+of+cytosol+and+organelles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast.</a> Autophagy. 4, 205-213 (2008).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li>
</ol>

Dans les images représentatives présentés dans la figure. 2B et 2C, on peut voir clairement que l&#39;utilisation des organites spécifiques rapporteurs fluorescents et microscopie de fluorescence fournit la preuve de la localisation mitochondriale / distribution à la fois dans la croissance et de l&#39;azote cellules privées, et permet mitophagy à visualiser. Il est à souligner que cette méthode n&#39;est pas limitée à mitophagy suivante. L&#39;autophagie des autres composants cellulaires ou des organelles (par exemple, les ribosomes, des gouttelettes lipidiques, les peroxysomes, réticulum endoplasmique et le noyau) peut être surveillée par un étiquetage approprié. Les détails de la construction biocapteur Rosella, conditions de culture cellulaire et des résultats typiques de chiffre d&#39;affaires du noyau (nucleophagy) ont été signalés 11,12 illustrant l&#39;application plus large de la méthode. Utilisez des organites spécifiques rapporteurs fluorescents pour l&#39;autophagie surveillance nécessite plusieurs considerations de la conception de construction à garder à l&#39;esprit. Il s&#39;agit notamment de: (1) la sélection et la fusion au signal de ciblage appropriée pour atteindre organite spécifique ciblage, (2) la sélection d&#39;une protéine fluorescent approprié (s), (3) une forte émission de fluorescence, (4) la localisation correcte des organites et / ou la distribution à l&#39;intérieur de la cellule. Une fois que le journaliste organite spécifique a été exprimé avec succès chez la levure hôte choisi la souche d&#39;un deuxième groupe de considérations deviennent: (1) les conditions de croissance de levures, (2) la préparation d&#39;échantillons de cellules, (3) les paramètres d&#39;imagerie car il est important que les paramètres choisis pour CLSM (par exemple, l&#39;intensité du laser, la vitesse de balayage et le mode, la valeur sténopé, valeur de zoom, les objectifs utilisés ou d&#39;exposition pour caméra CCD) sont maintenues pendant toute une expérience en sorte que des comparaisons peuvent être faites entre le contrôle (cellules en croissance) et des échantillons affamés; ( 3) l&#39;induction autophagie et la livraison réussie du journaliste dans la vacuole. Dans l&#39;ensemble, cette méthode microscopie à fluorescence il&#39;application est facile, relativement rapide, et dispose d&#39;un potentiel de criblage à haut débit pour de nouveaux médicaments qui favorisent ou inhibent l&#39;autophagie, et aussi pour les gènes qui régulent ou modulent l&#39;autophagie.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif / équipement </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Saccharomyces cerevisiae EasyComp Transformation Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K5050-01 </td></tr><tr><td> Yeast nitrogen base sans acides aminés et de sulfate d&#39;ammonium </td><td> BD Difco </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Bas point de fusion d&#39;agarose </td><td> Progen Biosciences </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Lames de microscope (76 x 26 mm) </td><td> Menzel-Gläser </td><td></td></tr><tr><td> Des lamelles de microscope (22 x 22 mm) </td><td> Menzel-Gläser </td><td> BB022022A1 </td></tr><tr><td> Laser microscope confocal à balayage Fluoview FV500 </td><td> Olympe </td><td></td></tr><tr><td> CMAC-Arg </td><td> Moleular Sondes-Invitrogen </td><td> Y-7531 </td></tr></tbody></table> Toutes les concentrations donnée arew / v, sauf indication contraire. Milieu de levure minimale (YMM): 0,67% de base azotée de levure sans acides aminés, glucose 2%, agar-agar 1,5% (seulement ajouter pour les milieux solides) et les suppléments nécessaires auxotrophes (0,01%)]. Sels de Saccharomyces (SS): (NH 4) 2 S0 4, 0,12%; KH 2 PO 4, 0,10%; MGC1 2 .6 H 2 O, 0,07%; NaC1, 0,05%; CaCl2, 0,01%; FEC1 3, 0,0005%. Un milieu de croissance: SS et 2% d&#39;éthanol (v / v) et des suppléments auxotrophes appropriés. De l&#39;azote famine moyen: 0,17% de base azotée de levure sans acides aminés et de sulfate d&#39;ammonium (Difco), 2% d&#39;éthanol (v / v).

un test microscopie de fluorescence pour mitophagy surveillance dans la levure<em&gt; saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

L&#39;autophagie est important de chiffre d&#39;affaires des composants cellulaires dans un éventail de conditions différentes. Il remplit une fonction essentielle homéostatique ainsi que d&#39;un mécanisme de contrôle de la qualité qui peuvent cibler sélectivement et dégradent la matière cellulaire, y compris organelles1-4. Par exemple, endommagées ou redondantes mitochondries (Fig. 1), ne sont pas éliminés par autophagie, peut représenter une menace pour l&#39;homéostasie cellulaire et la survie cellulaire. Chez la levure, Saccharomyces cerevisiae, une carence en nutriments (par exemple, la famine azote) ou des dommages peuvent favoriser chiffre d&#39;affaires sélective des mitochondries par autophagie dans un processus appelé mitophagy 5-9. Nous décrivons une approche microscopie de fluorescence simples pour évaluer l&#39;autophagie. Pour plus de clarté, nous limitons notre description ici de montrer comment l&#39;approche peut être utilisée pour surveiller mitophagy dans des cellules de levure. Le dosage fait appel à un rapporteur fluorescent, Rosella, qui est un biocapteur à double émission comprenant un rélativement pH stable de protéine rouge fluorescente liée à un pH-sensible protéine fluorescente verte. Le fonctionnement de ce journaliste s&#39;appuie sur les différences de pH entre la vacuole (pH ~ 5,0 à 5,5) et les mitochondries (pH ~ 8,2) dans les cellules vivantes. Dans des conditions de culture, les cellules de type sauvage présentent à la fois une fluorescence rouge et verte distribuée d&#39;une manière caractéristique des mitochondries. Émission de fluorescence n&#39;est pas associé à la vacuole. Lorsqu&#39;il est soumis à la famine d&#39;azote, une condition qui induit mitophagy, en plus de la fluorescence verte et rouge étiquetage les mitochondries, les cellules présentent une accumulation de rouge, mais pas de fluorescence verte, la lumière en acides vacuolaires représentant la distribution des mitochondries de la vacuole. Marquer les cellules avec du rouge, vert, mais pas vacuoles fluorescentes peuvent être utilisées en tant que mesure de l&#39;activité dans les cellules mitophagic 5,10-12.

Une approche robuste pour surveiller la prestation des organites à la lumière acide de la vacuole de la levure pour la dégradation et le recyclage est décrite. La méthode repose sur le marquage spécifique des organites cibles avec un codées génétiquement double-émission de fluorescence pH-biocapteur, et la visualisation des cellules individuelles en utilisant la microscopie à fluorescence.

Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure<em&gt; Saccharomyces cerevisiae

L'autophagie est importante pour le renouvellement des composants cellulaires sous diverses conditions. Elle remplit une fonction homéostatique essentielle ainsi qu'une ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer l'absorption des mitochondries par les vésicules autophagiques (vae) afin d'étudier l'autophagie des mitochondries, un processus connu sous le nom de mitophagie. Cela est réalisé en exprimant dans des cellules de levure un biosenseur de pH fluorescent, génétiquement codé et ciblant spécifiquement les mitochondries, émettant une fluorescence double (rouge et verte), nommé Mt Rosea, qui marque les mitochondries par fluorescence rouge et verte. Dans un deuxième temps, les cellules de levure sont soumises à une privation d'azote afin d'induire l'autophagie.Ensuite, nous observons les cellules par microscopie à fluorescence ou par microscopie confocale à balayage laser afin de visualiser l'absorption des mitochondries par les vacuoles autophagiques. Les résultats obtenus montrent une accumulation de fluorescence rouge, mais non de fluorescence verte, dans les vacuoles autophagiques des cellules privées d'azote. Cet indicateur d'autophagie, obtenu par comptage des cellules dans une population, permet de déterminer le degré de mitophagie.Utiliser rosea pour surveiller l'absorption des mitochondries dans la vacuole des cellules de levure peut fournir des informations mécanistiques sur le processus de mii. L'approche peut être adaptée pour surveiller l'autophagie d'autres compartiments cellulaires tels que le noyau, démontrant ainsi la procédure réalisée par dalibor alica, chercheur postdoctoral de notre laboratoire. Dans ce protocole, nous utilisons la souche de type sauvage BY 4 7 41 et une souche mutante de délétion delta A TG trois, dérivée du même fond génétique, afin de visualiser la localisation des mitochondries.Dans ces souches, ils sont marqués avec un indicateur fluorescent. Rosea Rosea est un biosenseur à émission de deux couleurs composé d'une protéine fluorescente rouge relativement stable au pH et d'une protéine fluorescente verte sensible au pH. La séquence cible mitochondriale est utilisée pour diriger le biosenseur Rosea vers la matrice mitochondriale.Ce capteur a été nommé Mt.Rosea car à pH élevé, le biocapteur émet une fluorescence rouge et verte. Toutefois, à pH bas, il émet uniquement une fluorescence rouge. La souche de type sauvage sert de témoin pour indiquer les niveaux d'autophagie normalement attendus en tant que contrôle négatif.Une souche nulle pour l'expression d'un gène essentiel de l'autophagie est appropriée. Étant donné qu'une telle souche ne peut pas acheminer les mitochondries vers la vacuole, des procédures standard sont utilisées pour transformer les souches de levure avec le plasmide portant le rapporteur rosala ciblant les mitochondries. Les plaques de croissance sont incubées de deux à quatre jours à 28 à 30 degrés Celsius jusqu'à l'apparition de colonies d'environ deux à trois millimètres de diamètre. Pour cultiver les cellules en vue de l'induction de l'autophagie, inoculer, pour chaque souche, une colonie unique de levure dans 10 millilitres de milieu de croissance contenant une source de carbone non fermentescible.Dans ce cas, de l'éthanol et les suppléments anaboliques appropriés. Des cultures en double sont réalisées pour chaque souche, ce qui donne un total de quatre cultures. Incuber les cultures de levure pendant environ 48 heures à une température de 28 à 30 degrés Celsius avec agitation orbitale, de sorte que les cultures atteignent la phase exponentielle moyenne de croissance.À la fin de la période d'incubation, transférez deux échantillons d'un millilitre de chaque culture dans des tubes en plastique de 1,7 millilitre à bouchon vissé. Faites déposer délicatement les cellules en culot par centrifugation à basse vitesse. Après la centrifugation, retirez soigneusement et jetez le surnageant de chaque tube sans perturber le culot cellulaire.Laver les cellules avec un millilitre d’eau distillée stérile par resuspension, suivie d’une centrifugation. Répéter le lavage deux fois supplémentaires pour éliminer le milieu résiduel. Après le troisième lavage, resuspendre les cellules dans 100 microlitres de milieu de croissance ou de privation d’azote.Le milieu pauvre en azote contient la source de carbone éthanol, mais ne contient pas de suppléments azotés et induira l'autophagie dans les cellules. Ensuite, re-inoculer les cellules resuspendues dans 10 millilitres de milieu de croissance frais ou dans 10 millilitres de milieu de privation d'azote.Incuber les cultures avec agitation orbitale pendant six à douze heures après l'induction de l'autophagie. Il est utile de confirmer la livraison de Mt Rosea dans les vae au microscope à fluorescence. Les vae peuvent être localisés par marquage à l'aide d'un colorant fluorescent bleu dérivé de la cumarine, tel que le sept amino quatre chloro méthyl cumarine, L arginine mi cmac arg pour faire court.L'étiquetage avec le CMAC ARG n'a pas besoin d'être effectué systématiquement, mais il est recommandé pour les personnes non familières avec l'emplacement et l'apparence du vacuole chez la levure. Pour commencer la procédure d'étiquetage du vacuole, transférer des échantillons d'un millilitre de chaque culture dans des tubes en plastique de centrifugation de 1,7 millilitre avec bouchon à vis. Ensuite, ajouter le CMAC ARG à chaque tube.Incuber les tubes à 28 à 30 degrés Celsius avec agitation orbitale pendant 30 minutes. Après 30 minutes, récupérer les cellules par centrifugation, éliminer le surnageant, puis laver les cellules avec un millilitre d'eau distillée stérile par suspension, suivie d'une centrifugation. Laver les cellules deux fois supplémentaires avec de l'eau distillée stérile.Cette étape élimine le milieu résiduel et l'excès de cmac arg die. Après le troisième lavage, resuspendre les cellules dans 100 microlitres d'eau distillée stérile. Les cellules sont désormais prêtes à être montées pour l'imagerie par microscopie de fluorescence.Lors de la réalisation de ce protocole, il est très important d'utiliser des cultures de levures fraîchement transformées afin de s'assurer d'obtenir des cellules T possédant des mitochondries hautement fluorescentes. Pour préparer des cellules de levures vivantes en vue de leur observation par microscopie fluorescente, faites d'abord fondre deux milligrammes d'agarose à bas point de fusion dans des aliquots séparés d'un millilitre de milieu de croissance et de milieu de privation en azote en incubant à 70 degrés Celsius pendant une heure ; l'agarose fondue est maintenue à 70 degrés Celsius. Pour monter les cellules, déposez 20 microlitres d'agarose fondue sur une lame de microscope en verre étiquetée de dimensions 76 par 26 millimètres.Déposez immédiatement 10 microlitres de la suspension cellulaire lavée sur le lit d'agros. Recouvrez le lit d'agros avec une lame couvre-objet en verre de 22 par 22 millimètres. Les cellules s'étaleront à la surface de l'agros sous la lame couvre-objet.Ensuite, scellez soigneusement les bords de la lame couvre-objet avec un fin film de vernis à ongles. Cela empêchera la déshydratation et le déplacement de la lame couvre-objet pendant l'observation au microscope à fluorescence, une fois que le vernis est complètement sec. Les préparations sont alors prêtes à être observées. À l’aide de cette technique, les cellules peuvent être observées jusqu’à une heure après leur montage, sans effets néfastes apparents.Étant donné que les cellules de levure sont relativement petites, vous aurez besoin d'un microscope à fluorescence de bonne qualité équipé de filtres d'excitation et d'émission adaptés à la visualisation séparée de l'émission de la GFP et de l'émission de la RFP, ainsi que d'un objectif à immersion dans l'eau de 60 x possédant une ouverture numérique de 1,2. Les résultats typiques obtenus à l'aide de MT Rosea exprimée dans des cellules de type sauvage et à l'aide d'une microscopie confocale à balayage laser sont présentés ici dans des conditions non privées de nutriments, avec de l'éthanol comme source de carbone, tandis que les cellules de type sauvage présentent une distribution mitochondriale cellulaire typique en périphérie des cellules de levure, qui montrent une fluorescence rouge et verte.On ne détecte pas de fluorescence rouge et verte dans la vacuole. Lorsque des cellules sauvages exprimant MT.Rosea sont soumises à une privation d'azote pendant six heures ou plus, elles présentent, en plus de la fluorescence rouge et verte correspondant aux mitochondries, une accumulation de fluorescence rouge, mais pas verte, dans la va.Ce signal ulaire est indicatif de l'autophagie. La prise en charge autophagique des mitochondries est ulaire. La localisation de rosea peut être confirmée séparément à l'aide de l'arg CMAC.En revanche, les cellules contrôles négatives pour la mitophagie exprimant MT.Rosea observées avant la privation et après six heures ou plus de privation ne montrent aucune accumulation de fluorescence rouge dans la vacuole. Bien que l'étiquetage mitochondrial reste marqué pour évaluer le niveau d'autophagie dans les souches de type sauvage et mutantes A TG trois, plus de 200 cellules par souche ont été observées afin de détecter l'accumulation de fluorescence rouge dans l'olé avant l'induction de l'autophagie et à des points temporels choisis après l'induction de l'autophagie. Le tracé de la proportion de cellules présentant une accumulation vacuolaire révèle que le degré d'absorption vacuolaire augmente avec le temps dans les cellules de type sauvage, mais pas dans les cellules mutantes delta ATG trois incapables de transporter les mitochondries vers la vacuole après leur développement. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs du domaine de l'autophagie pour explorer le transport des mitochondries et d'autres organites tels que le noyau vers la VA, ainsi que les diverses conditions de croissance dans ces cellules.

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