Name: PCR multiplex et de test dhybridation inverse Ligne Blot (MPCR / RLB) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Découvrez la méthode mPCR/RLB pour la détection simultanée de multiples pathogènes à partir d'échantillons cliniques. Cette technique économique et à haut débit permet le criblage de 43 cibles moléculaires sans équipement spécialisé.

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Matthew O&#39;Sullivan et Fei Zhou sont bénéficiaires de l&#39;Australian National Santé et du Medical Research Council Bourses d&#39;études supérieures de la recherche médicale.

Une attention particulière doit être accordée à l'apprêt et la conception de la sonde. Toutes les séquences disponibles des objectifs d'intérêt à partir des bases de données telles que GenBank devraient être utilisées pour identifier les domaines conservés qui sont des cibles appropriées. Si un grand nombre de cibles sont amplifiées dans un essai MPCR unique, chaque séquence doit être amplifié de longueur similaire, et ne doit pas dépasser 300 paires de base pour éviter la concurrence. Une autre application de la méthode est d'amplifier une cible de plus en utilisant des amorces contre les régions conservées et d'utiliser des sondes multiples pour identifier des variations de séquence dans l'amplicon. Dans ce cas, le produit amplifié par PCR peut être plus long. Températures de recuit Primer devraient tous être semblables, avec des conditions de PCR ajusté en conséquence. Amorces qui forme forte structure secondaire ou dimère primaire doit être évitée. Le Sigma Aldrich ADN calculatrice ( <a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp</a> ) peut être utilisé pour prédire de façon fiable ces caractéristiques. Des sondes d'ADN devraient être conçus pour avoir recuit des températures proches de 60 ° C. Afin de maximiser la spécificité, deux sondes pour chaque cible d'intérêt peuvent être inclus dans le test, une hybridation à l'avant du brin d'ADN adjacent au site amorce reverse contraignant, et l'autre pour le volet arrière à côté du site amorce sens contraignant. Dans ce cas, les deux amorces avant et arrière doivent être modifiés à la biotine. Si une seule sonde par cible amplifiée est utilisée, alors seulement une amorce besoin biotine modifiée. Lors de la conception des amorces et des sondes pour l'analyse MPCR / RLB, il est fortement conseillé d'utiliser des méthodes in silico pour prédire les produits de PCR et hybridation de sonde la corrélation avec les résultats in vitro. Idéalement cela est fait à partir d'isolats dont la séquence du génome entier est disponible. Des logiciels tels que FastPCR (disponible à http://primerdigital.com/fastpcr.html) peuvent être utilisés à cette fin. Signal de la sonde faible ou absent peut être prédit, où l'analyse in silico indique inadéquation de paires de bases résultant de la température de sonde recuit à basse. Techniques d'extraction d'ADN varie selon les échantillons testés, et les conditions de PCR sera dépendante de conception d'amorce. Les lecteurs sont priés de publications sur des dosages individuels pour plus d'informations concernant l'extraction d'ADN et de réactifs de PCR et les conditions de 1-19. Chaque test est exécuté avec des contrôles appropriés pour fournir au moins un signal positif et négatif pour une sonde de chaque sonde sur la membrane, ainsi que d'un ADN sans contrôle. Par ailleurs, il est avantageux d'inclure une sonde dans la partie supérieure de la membrane qui devrait être positif pour tous les échantillons (ex.: une espèce ou un genre de sonde spécifiques dans le cas d'un micro-organisme). Cela sert d'une sonde contrôle positif, mais elle permet aussi une orientation facile des résultats. 1. Préparation de la membrane <ol><li> Préparer les solutions suivantes: <ul><li> 100ml NaHCO3 0,5 M (pH 8,4) </li><li> 100 ml de NaHCO 3 0,5 M </li><li> 20 ml EDAC 16% </li><li> 250 ml NaOH 0,1 M </li><li> 250 ml 2xSSPE </li><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - lieu en bain-marie à 60 ° C </li><li> 250 ml EDTA 20 mM. </li></ul></li><li> Préchauffer le four à 60 ° C. </li><li> Nettoyez le Miniblotter Immunetics avec de l'éthanol à 70%. </li><li> Diluer les sondes oligonucléotidiques dans 0,5 M de NaHCO 3 à une concentration finale de 2 pmol / ul et un volume de 200 pl. </li><li> Couper une membrane de nylon BiodyneC à 15x15 cm. En utilisant un crayon et une règle, la règle hors d'un espace de 0,5 cm à travers le dessus de la membrane et donner les détails ici. </li><li> Sceau de membrane dans un sac plastique avec 20 ml solution fraîchement préparée EDAC 16% et de rock à la température ambiante pendant 10 minutes. </li><li> Laver la membrane dans de l'eau déminéralisée pendant 30 secondes. </li><li> Placer dans la membrane miniblotter avec chaînes courir à travers la membrane (parallèle à la ligne de crayon). Mettez coussin de soutien en place et à proximité buvard. Aspirer le fluide de canaux. </li><li> Remplissez les lignes 1 et 45 avec 150 pl 0,5 M de NaHCO 3. Utilisez 150 ul de chaque solution de sonde pour remplir voies 2-44 de la séquence, en faisant attention à éviter les bulles d'air. Si une bulle d'air apparaît dans le canal, en gardant la pipette en place, rapidement aspirer la solution pour permettre à la bulle d'air de flotter au sommet de la pipette, puis réessayez. Incuber à température ambiante pendant 5 minutes. </li><li> Aspirer des solutions de sonde, retirez la membrane et se laver dans 250 ml de NaOH 0,1 M à température ambiante pendant 9 minutes. </li><li> Laver la membrane dans 250 ml 2xSSPE pendant 30 secondes. </li><li> Laver la membrane dans 250 ml pré-chauffé 2xSSPE/0.1% SDS dans un four à 60 ° C pendant 5 minutes. </li><li> Si ce n'est pas être utilisées pour l'hybridation immédiatement, se laver la membrane dans 240 ml d'EDTA 20 mM à température ambiante pendant 20 minutes (réserver 10 ml restants), puis sceller la membrane dans un sac en plastique avec 10 ml d'EDTA reste 20 mM et de stockagee au réfrigérateur à 4 ° C. </li><li> Lavez miniblotter avec Pyroneg détergent et une brosse. Rincer et laisser sécher. </li></ol> 2. Hybridation et détection <ol><li> Préparer les solutions suivantes: <ul><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - magasin au bain-marie à 60 ° C. </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - magasin au bain-marie à 60 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - un magasin dans le four à 42 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE - conserver à température ambiante </li><li> 500 ml SDS à 1% - un magasin au bain-marie à 60 ° C au départ (pour l'étape 3) </li><li> 250 ml EDTA 20 mM - stocker à température ambiante (pour l'étape 3). </li></ul></li><li> Tourner sur un four à 60 ° C et un four à 42 ° C. Porter l'eau à bouillir dans un grand bécher sur une plaque chauffante. </li><li> Nettoyer Immunetics Miniblotter à l'éthanol 70%. </li><li> Aliquote de 10 ml de 2xSSPE/0.1% SDS dans un petit récipient. Ajouter 20 ul de chaque produit de PCR à 150 ul 2xSSPE/0.1% de SDS dans des tubes numérotés. </li><li> Faire bouillir les produits de PCR pendant 10 min à 100 ° C en utilisant les détenteurs de styromousse. Placez-le sur la glace immédiatement pendant au moins 5 minutes. </li><li> Lavez la membrane en restant 240 ml 2xSSPE/0.1% SDS à 60 ° C au four pendant 5 minutes. </li><li> Placer dans la membrane miniblotter avec coussin d'appui. Orientez donc canaux courir verticalement (perpendiculaire à la ligne de crayon). </li><li> L'excès de liquide d'aspiration des canaux miniblotter. </li><li> Ajouter le reste 150 ul 2xSSPE/0.1% de SDS à des canaux et prénom. Ajouter bouillie produits de PCR à des canaux restants (2-44) dans la séquence, en prenant soin d'éviter les bulles d'air. </li><li> Miniblotter Placer à plat dans le four à 60 ° C pendant 1 heure pour permettre l'hybridation ait lieu. </li><li> Aspirer liquides à partir de chaque canal puis retirer la membrane du miniblotter. </li><li> Laver deux fois dans préchauffée SDS 250 ml 2xSSPE/0.5% à 60 ° C au four pendant 10 minutes. </li><li> Humidifiez filet de nylon séparant par 2xSSPE/0.5% SDS à 42 ° C et l'utiliser pour rouler la membrane. </li><li> Placez retroussé membrane dans le tube d'enroulement, et se déploient pour assurer la membrane bute contre la surface intérieure. Ajouter 3 pi conjugué streptavidine-peroxydase (Roche Applied Science) à 15 ml 2xSSPE/0.5% SDS à 42 ° C et ajouter à tube d'enroulement. Bouchon sur hermétiquement et laisser incuber dans un four à rouleaux à 42 ° C pendant 60 minutes. Assurer la direction du rouleau est telle que la membrane ne pas serrer. Vérifiez périodiquement s'il ya des fuites. </li><li> Lavez miniblotter dans Pyroneg eau et du détergent, rincer et laisser sécher. </li><li> Retirer la membrane du tube d'enroulement. Laver deux fois en restant 2xSSPE/0.5% SDS à 42 ° C pendant 10 minutes. </li><li> Laver deux fois dans 2xSSPE à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Éteindre le four à 80 ° C et le lieu de 500ml 1% de SDS dans le four à préchauffer. </li><li> Maquillage 15 ml Amersham solution de détection ECL (7,5 ml de solution A et 7,5 ml de solution B). Jeter 2xSSPE et ajouter la solution de détection. Rocher doucement par la main pendant 2 minutes en assurant une couverture complète de la membrane avec une solution. Jeter la solution chimiluminescente. </li><li> Couper deux feuilles de matière plastique transparente pour s'adapter cartouche d'exposition. Placez la membrane entre les deux feuilles et le placer dans la cartouche d'exposition. </li><li> Procéder à la chambre noire. Sous une lumière rouge, ajoutez du film de détection ECL à la cartouche et exposer pendant 5 minutes. Chien-oreille coin inférieur droit d'un film lors de l'enlèvement afin de permettre une orientation correcte lors de la visualisation. </li><li> Développer film avec développeur automatisé ou bains chimiques selon les directives du fabricant. </li><li> Répétez l'exposition avec des temps d'exposition plus longs ou plus courts, si nécessaire. </li></ol> 3. Régénération des membranes <ol><li> Laver la membrane dans 250 ml à 1% de SDS à 80 ° C pendant 30 minutes deux fois. </li><li> Laver la membrane dans 240 ml d'EDTA 20 mM à température ambiante pendant 15 minutes. </li><li> Sceau de membrane dans un sac plastique avec 10 ml d'EDTA 20 mM et réfrigérer à 4 ° C pour une réutilisation future. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Les résultats sont meilleurs vu en plaçant le film sur une grille imprimée, ou bien la numérisation de l'image et l'importer dans un logiciel tel que BioNumerics (Mathématiques appliquées, Sint-Martens-Latem, Belgique). Chaque résultat de la sonde doit être interprété en référence à des sondes de contrôle positif et négatif. Les résultats sont meilleurs classés comme négatifs, faible ou positif. Les résultats positifs sont là où le signal est plus fort ou plus fort que celui de la sonde contrôle positif. Les résultats négatifs sont là où le signal est absent ou égal au contrôle négatif (dans le cas du signal de fond). Faibles résultats sont là où le signal est plus faible que la sonde contrôle positif, mais plus fort que le contrôle négatif. La faiblesse des résultats peut être le résultat de mutations ponctuelles conduisant à la fixation de sonde faible, ou pour cause de non-spécifiques signaux de la formation de dimères d'amorces. L'utilisation de deux sondes par cible d'intérêt peut améliorer la spécificité, où un seul résultat faible peut sans risque être interprété comme signal non spécifique. Si un doute subsiste, une seule réaction complexes PCR peut être effectuée avec du gel à base de détection et le séquençage de n'importe quel amplilified produit pour déterminer si le résultat est vraiment positif. Un résultat représentatif est montré dans la figure 2. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Les principes MPCR / RLB (P1) Étape 1.9. Amine sondes modifiées sont liés de manière covalente à une membrane de nylon. (P2) Étape 2,10. Biotine modifiés produits de PCR sont hybridés aux sondes. (P3) Étape 2,14. Streptavidine marquée à la peroxydase, est incubé avec la membrane et se lie à la biotine. (P4) étapes 2.19 à 2.21. Peroxydase catalyse une réaction dans les réactifs de détection ECL, produire de la lumière à laquelle la lumière pellicule sensible est exposée. La membrane est ensuite lavée pour la réutilisation. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Représentant MPCR / RLB résultat. Des échantillons de 1 à 6 représentent les contrôles positifs - entre eux, il ya au moins un signal de la sonde positive pour chacun des 43 sondes. Chaque séquence cible (de A à U) est détectée avec deux sondes différentes pour optimiser la spécificité. Sondes A1 et A2 représentent des espèces sondes spécifiques qui devraient être positifs pour chaque échantillon et d'aider à orienter le film. Sonde A1 est répété au bas de la membrane. Les échantillons 7 et 8 sont des contrôles négatifs. Notez que Q1 sondes, T2, T1 et T2 ont signal dans les contrôles négatifs, indiquant probablement une liaison non spécifique des amorces ou un produit dimère d'amorces. Re-conception de ces sondes ou d'amorces serait nécessaire. Sondes C1, D1 et F1 montrent des stries à travers la membrane probablement dû à une certaine absorption non spécifique du conjugué streptavidine-peroxydase ou substrat chimioluminescent, mais cela est facilement distingués des vrais signaux de la sonde positive. Sondes D1 et D2 ont signal relativement faible par rapport à d'autres sondes, cela peut être dû à de plus grands amplicons conduisant à une amplification moins efficace. Sonde J2 est négative est de plusieurs échantillons (1, 3, 4, 6, 39) où la sonde J1 est positif. Il est fort probable représente une mutation dans le site J2 contraignantes pour ces échantillons.

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode MPCR / RLB permet la détection simultanée d&#39;un grand nombre d&#39;amplicons de PCR. En raison de la grande sensibilité de chimioluminescence basé sur les sondes de détection, un seul multiplex PCR avec un grand nombre de paires d&#39;amorces peuvent être utilisées pour amplifier l&#39;ADN matrice. Si aucun signal de la sonde sont obtenues avec un ou plusieurs échantillons, effectuer l&#39;électrophorèse sur gel avec tout produit restant PCR peut aider à distinguer si le problème est avec l&#39;amplification PCR ou l&#39;hybridation de la sonde. Lorsque tous les signaux de la sonde sur la membrane sont faibles ou inexistantes, mais l&#39;électrophorèse sur gel indique réussie amplification par PCR, des possibilités incluent des problèmes avec l&#39;étiquetage de la membrane, la régénération incorrecte de la membrane après l&#39;utilisation antérieure, des températures incorrectes lors de l&#39;incubation d&#39;hybridation ou de la streptavidine, ou défectueux streptavidine- conjugué à la peroxydase ou de réactif de détection. Si les échantillons de contrôle indiquent que les sondes individuelles peuvent produire de faux signaux négatifs, seule PCR avec un gel à base de détection et de séquençage ultérieur peut être effectué pour vérifier l&#39;amplification du produit de PCR et de chercher des variations de séquence sur le site de la sonde contraignant. Signal de la sonde faible ou absent peut être dû à la taille de l&#39;amplicon grande: si possible tous les amplicons doivent être de longueur similaire et moins de 300 pb. Structures d&#39;ADN secondaire d&#39;amplicons peuvent également produire contraignante sonde pauvres, et peut nécessiter une nouvelle conception d&#39;amorces. Apprêt individuels ou les concentrations de sonde peut également être modifiée afin d&#39;optimiser la puissance du signal. Faux signaux positifs en raison de la sonde contraignante d&#39;amorces nonamplified ou une amorce-dimère produit peut être étudié en effectuant seule PCR avec un gel à base de détection et de séquençage ultérieur. Si cela se produit, la refonte des sondes peut être nécessaire. Des mutations ponctuelles dans les sites de la sonde de liaison peuvent conduire à des signaux faibles ou absents. Permettre deux sondes pour chaque produit amplifié rend cela facile à détecter. Cette caractéristique peut être exploitée avec un apprêt et une conception rigoureuses sonde pour détecter des variations de séquence d&#39;ADN cible dans les petites. En résumé, alors qu&#39;il existe de nombreuses méthodes de détection des produits réactions suivantes PCR multiplex disponibles, MPCR / RLB a l&#39;avantage d&#39;être à haut débit et peu coûteuse avec de faibles coûts de configuration-. La souplesse de la méthode permet son utilisation dans une large gamme d&#39;applications.

<table border="1"><tbody><tr><th> Réactifs </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> 5 &#39;amine C6 modifiés sondes oligonucléotidiques </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-8875 </td><td> Solution 0,5 M fait jusqu&#39;à un pH de 8,4 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td> 0,1 M solution de </td></tr><tr><td> 20xSSPE tampon </td><td> Amresco </td><td> 0810-4L </td><td></td></tr><tr><td> Dodécylsulfate de sodium (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L-4390 </td><td> Maquillage solution stock à 10%, ne autoclave, devraient être conservés pendant une semaine maximum avant utilisation </td></tr><tr><td> Éthylènediaminetétraacétique (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td> Maquillage solution 0,5 M ajusté à pH 8,0 et autoclaver </td></tr><tr><td> N-(3-diméthylaminopropyl)-N &#39;-éthylcarbodiimide (ACDE) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7750 </td><td> Préparez une solution de 20 ml de 16% juste avant l&#39;utilisation en utilisant 3,2 g EDAC et 18 ml d&#39;eau Millipore </td></tr><tr><td> BiodyneC 0,45 cm à membrane en nylon um 20x20 </td><td> Pall Life Sciences </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Déminéralisée, eau purifiée </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Détergent liquide Pyroneg </td><td> Johnson Diversey </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidine-peroxydase </td><td> Roche </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL réactifs de détection </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL réactifs de détection </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Transparence du film OHP </td><td> Corporate Express </td><td> EXP 504 OHP </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL hyperfilm haute performance des films chimiluminescents 18x24 cm </td><td> GE Healthcare </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> Glace </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Consommables utilisés dans l&#39;essai MPCR / RLB. <table border="1"><tbody><tr><th> Équipement </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Fours Shake&#39;n&#39;Stack Hybaid (2) bouteilles de laminage et de filet de nylon séparant </td><td> Thermo Scientific </td><td> HBSNSRS220 </td><td> Cette méthode peut être réalisée avec un seul four tant qu&#39;il y est facilité pour la maintenance de solutions à 42 ° C et 60 ° C avant utilisation </td></tr><tr><td> La plate-forme à bascule Belly Dancer </td><td> Stovall sciences de la vie </td><td> Euro BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> Mn100-45 </td><td></td></tr><tr><td> Bain-marie </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aspiration </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plaque de cuisson </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cartouche d&#39;exposition </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z36 ,009-0 </td><td></td></tr><tr><td> Développeur du film X-ray </td><td></td><td></td><td> Pouvez également utiliser révélateur, fixateur et eau dans des plateaux dans une pièce sombre au lieu d&#39;automatiquedéveloppeur. Lumino-imageur peut également être utilisé à la place du film Xray </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Matériel nécessaire pour le dosage MPCR / RLB.

pcr multiplex et de test d&#39;hybridation inverse ligne blot (mpcr / rlb)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

PCR multiplex / test d&#39;hybridation inverse Ligne Blot permet la détection de jusqu&#39;à 43 cibles moléculaires dans 43 échantillons en utilisant une PCR multiplex de réaction suivie par hybridation de sonde sur une membrane de nylon, qui est ré-utilisable. Les sondes sont 5 &#39;amine modifiée pour permettre la fixation à la membrane. Les amorces sont 5 &#39;biotine modifiée qui permet la détection de produits de PCR utilisant hybridées streptavidine-peroxydase et un substrat chimiluminescent via un film photosensible. Avec une configuration faible et les coûts de consommables, cette technique est peu coûteuse (environ 2 $ US par échantillon), à haut débit (plusieurs membranes peuvent être traitées simultanément) et dispose d&#39;un délai court (environ 10 heures). La technique peut être utilisée dans un certain nombre de façons. Plusieurs sondes peuvent être conçus pour détecter des variations de séquence dans un seul produit amplifié, ou plusieurs produits peuvent être amplifiés simultanément, avec un (ou plusieurs) des sondes utilisées pour la détection ultérieure. Une combinaison des deux approches peuvent aussi être utilisés dans un seul test. La possibilité d&#39;inclure plusieurs sondes pour une séquence cible unique permet le dosage très précis. Les applications publiées du MPCR / RLB comprennent la détection des gènes de résistance aux antibiotiques 1,2, tapant du Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline 3-5 et Salmonella sp 6, sérotypage moléculaire de Streptococcus pneumoniae 7,8, 9 et Streptococcus agalactiae entérovirus 10,11, l&#39;identification de Mycobacterium sp 12, la détection des organes génitaux 13-15 et 16 voies respiratoires et d&#39;autres 17 agents pathogènes et de détection et d&#39;identification des mollicutes 18. Toutefois, la polyvalence de la technique des moyens les applications sont quasiment illimitées et ne se limite pas à l&#39;analyse moléculaire des micro-organismes. Les cinq étapes de MPCR / RLB sont un Primer) et la conception de la sonde, b) l&#39;extraction d&#39;ADN et la PCR d&#39;amplification c) Préparation de la membrane, d) Hybridation et détection, et e) La régénération de la membrane.

Un peu coûteuse, la méthode à haut débit pour la détection simultanée de jusqu&#39;à 43 cibles moléculaires est décrit. Applications de MPCR / RLB comprennent tapant microbienne et la détection de pathogènes multiples à partir d&#39;échantillons cliniques.

PCR multiplex et de test d&#39;hybridation inverse Ligne Blot (MPCR / RLB)

Le dosage par PCR multiplexe et hybridation par reverse line blot permet la détection jusqu'à 43 cibles moléculaires dans 43 échantillons à l'aide d'une seule réaction de PCR multiplexe...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer la présence ou l'absence d'un panel de séquences d'acides nucléiques spécifiques préalablement amplifiées lors d'une réaction de PCR multiplexe. Cette détection est réalisée en fixant d'abord des sondes d'ADN marquées par un groupe amine sur une membrane de nylon réutilisable. Les produits de PCR marqués par la biotine sont ensuite hybridés aux sondes liées à la membrane, puis révélés par la streptavidine conjuguée à la peroxydase.Le conjugué est ajouté aux produits PCR liés. Ensuite, les produits PCR liés sont détectés en ajoutant des réactifs de détection chimiluminescents et en exposant la membrane à un film radiographique à haute sensibilité. Enfin, la membrane est lavée pour éliminer les produits PCR hybridés, ce qui permet de la réutiliser pour des analyses ultérieures.En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant l'hybridation des produits de PCR aux sondes liées à la membrane, visibles sur un film radiographique. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la PCR multiplex associée à l'électrophorèse sur gel, la PCR en temps réel ou la puces à ADN, sont sa capacité de traitement élevé, sa rapidité relative, son absence de besoin d'équipement spécialisé, et surtout son faible coût. Avant de commencer, préparez les solutions suivantes conformément à la partie écrite de ce protocole.Pour préparer la membrane, préchauffez le four à 60 degrés Celsius. Nettoyez le mini-blocher avec de l'éthanol à 70 %, diluez les sondes d'oligonucléotides dans du bicarbonate de sodium 0,5 molaire jusqu'à une concentration finale de deux picomoles par microlitre et un volume de 200 microlitres. Découpez la membrane en nylon en mesurant 15 sur 15 centimètres, puis utilisez un crayon et une règle pour délimiter un espace de 0,5 centimètre en haut de la membrane, où vous noterez les détails de l'expérience.Sceller la membrane dans un sac en plastique avec 20 millilitres de solution fraîchement préparée d'EDAC 16 % et agiter à température ambiante pendant 10 minutes. Laver la membrane à l'eau déionisée pendant 30 secondes. Ensuite, placer la membrane dans un mini-blocher avec des canaux traversant la membrane.Ensuite, mettre en place le coussin de support et fermer le bloqueur. Aspirer soigneusement tout liquide des canaux. Remplir les pistes 1 et 45 avec 150 microlitres de bicarbonate de sodium 0,5 molaire.Utilisez 150 microlitres de chaque solution de sonde pour remplir les canaux de deux à 44 en séquence, en prenant soin d'éviter les bulles d'air. Si une bulle d'air apparaît dans le canal, maintenez la pipette en place et aspirez rapidement la solution afin que la bulle d'air remonte au sommet de la pointe de la pipette, puis recommencez. Incubez à température ambiante pendant cinq minutes.Aspirez les solutions de sonde. Retirez la membrane et rincez-la dans 250 millilitres de soude 0,1 molaire à température ambiante pendant neuf minutes. Lavez la membrane dans 250 millilitres de SSPE 2 fois pendant 30 secondes.Ensuite, laver dans 250 millilitres de SSPE 2× préchauffé contenant 0,1 % de SDS, au four à 60 degrés Celsius pendant cinq minutes, si le lavage n'est pas immédiatement suivi par une hybridation. Laver la membrane dans 240 millilitres de EDTA 20 millimolaire à température ambiante pendant 20 minutes. Puis conserver la membrane dans un sac en plastique avec les 10 millilitres restants de EDTA 20 millimolaire et stocker à quatre degrés Celsius.Enfin, lavez le mini-blosseur avec du détergent pyro neck et une brosse, rincez-le et laissez-le sécher en multiplex. L'amplification par PCR des cibles d'intérêt n'est pas décrite dans cette démonstration, mais doit être réalisée avant l'hybridation. Avant de commencer la procédure d'hybridation, préparez les solutions suivantes conformément à la partie écrite de ce protocole.Allumez un four et réglez-le à 60 degrés Celsius, et un autre four à 42 degrés Celsius. Portez l'eau à ébullition dans un grand bécher sur un agitateur chauffant. Nettoyez le mini-bloqueur avec de l'éthanol à 70 %.Prélevez ensuite 10 millilitres de SSPE 2× 0,1 % SDS dans un petit récipient. Ajoutez alors 20 microlitres de chaque produit PCR à 150 microlitres de SSPE 2× 0,1 % SDS dans des tubes numérotés. Portez les produits PCR à ébullition pendant 10 minutes à 100 degrés Celsius à l’aide de supports en polystyrène, puis placez-les immédiatement sur de la glace pendant au moins cinq minutes.Lavez la membrane dans les 240 millilitres restants de SSPE 2 fois à 0,1 % de SDS dans l’étuve à 60 degrés Celsius pendant cinq minutes. Placez la membrane dans le mini blotter avec le coussin de soutien. Orientez-la de manière que les canaux soient disposés verticalement.Aspirez le liquide excédentaire des canaux du mini-blocher. Ajoutez les 150 microlitres restants de SSPE 2 fois 0,1 % SDS dans les premier et dernier canaux. Ajoutez les produits PCR bouillis dans les canaux deux à 44 en séquence, en prenant soin d'éviter les bulles d'air.Placer le miniblocher à plat dans l’étuve à 60 degrés Celsius pendant une heure afin de permettre l’hybridation. Pulvériser le liquide de chaque canal. Ensuite, retirer la membrane du miniblocher.Laver deux fois dans 250 millilitres d’SSPE 2×, 0,5 % de SDS préalablement réchauffés, au four à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes. Humidifier le support en nylon avec du SSPE 2×, 0,5 % de SDS à 42 degrés Celsius et l’utiliser pour enrouler la membrane. Placer la membrane enroulée dans un tube rotatif et faire rouler afin de s’assurer que la membrane adhère à la surface intérieure.Ajouter trois microlitres de strept AD en conjugué avec la peroxydase à 15 millilitres de SSPE deux fois, 0,5 % SDS à 42 degrés Celsius et verser dans le tube. Visser le bouchon fermement et incuber dans l'étuve rotative à 42 degrés Celsius pendant 60 minutes. Veiller à ce que le sens de rotation soit tel que la membrane ne se tende pas.Vérifiez périodiquement les fuites. Lavez le mini-blocher avec un détergent pour flacon pyrogène, rincez à l’eau et laissez sécher. Retirez la membrane du tube à rouleau et effectuez deux lavages dans le tampon SSPE 0,5 % SDS restant à 42 degrés Celsius pendant 10 minutes.Ensuite, laver deux fois dans deux volumes de SSPE à température ambiante pendant cinq minutes. Régler les deux fours à 80 degrés Celsius et placer 500 millilitres de SDS à 1 % dans l'un des fours pour le préchauffer. Préparer la solution ECL et incuber la membrane dans la solution de détection ECL pendant deux minutes.Ensuite, exposez la membrane sur un film et révélez-le. Répétez l'exposition avec des durées plus longues ou plus courtes si nécessaire pour régénérer la membrane. Lavez-la deux fois pendant 30 minutes dans 250 millilitres de SDS 1 % à 80 degrés Celsius.Ensuite, laver avec 240 millilitres d'EDTA 20 millimolaire à température ambiante pendant 15 minutes. Sceller la membrane dans un sac en plastique contenant 10 millilitres d'EDTA 20 millimolaire et la conserver au réfrigérateur à quatre degrés Celsius pour une réutilisation ultérieure. Cette figure montre les résultats d'un test d'hybridation par transfert sur membrane inversé après PCR multiplex. Les échantillons un à six représentent des contrôles positifs entre eux.Il y a au moins un signal positif de sonde pour chacune des 43 sondes. Chaque séquence cible, de A à U, est détectée à l'aide de deux sondes différentes afin de maximiser la spécificité des sondes. Les sondes a un et a deux représentent des sondes spécifiques à l'espèce, dont on s'attend à ce qu'elles soient positives pour chaque échantillon et qui aident à orienter la membrane à sondes.Un est répété en bas de la membrane. Les échantillons sept et huit sont des contrôles négatifs. Remarquez que les sondes Q1, Q2, T un et T deux présentent un signal dans les contrôles négatifs, ce qui indique une liaison probablement non spécifique des amorces ou la formation de dimères d'amorces.Une nouvelle conception de ces sondes ou amorces serait nécessaire, car les sondes C un, D un et F1 présentent des traînées sur la membrane, probablement dues à une absorption non spécifique de la strept TD dans la peroxydase, le conjugué ou le substrat chimiluminescent. Toutefois, cela se distingue facilement des signaux positifs réels. Les signaux des sondes D un et D deux sont relativement faibles par rapport aux autres sondes.Cela peut être dû à des amplicons plus longs entraînant une amplification moins efficace. Enfin, la sonde J deux est négative dans plusieurs échantillons où la sonde J un est positive. Cela représente très probablement une mutation au niveau du site de liaison de J deux pour ces échantillons.Une fois maîtrisée, cette technique, de l'extraction de l'ADN jusqu'à l'hybridation PCR Pro, l'interprétation des résultats et la régénération de la membrane, peut être réalisée en moins de 10 heures.

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