Name: Génération et détiquetage des murins de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées des nanocristaux Qdot pour les études de suivi (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Découvrez l'étiquetage des cellules dendritiques murines avec des nanocristaux Qdot pour l'imagerie en fluorescence. Cette méthode permet de suivre la migration cellulaire in vivo avec une stabilité supérieure aux marqueurs GFP.

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Ce travail soutenu en partie par le NIH sous Grant R15 CA137499-01 (FB) et un fonds de démarrage de l&#39;Ohio University (FB).

1. Dissection de fémurs et tibias de la souris et la culture de cellules de moelle osseuse <ol><li> Sacrifice 2 souris par le CO 2 asphyxie et soigneusement décortiquer les tibias et les fémurs sans couper les extrémités des os. </li><li> Nettoyez les os de tous les tissus attachés en utilisant du papier de soie. Attention à ne pas briser les os. </li><li> Stériliser les os par immersion dans de l'éthanol à 70% pendant 10 min dans un plat de Pétri de 35 mm. A partir de ce moment, le travail intérieur d'une hotte de biosécurité pour éviter la contamination des cultures cellulaires. </li><li> Récupérer les os de l'éthanol et les laisser sécher à l'air pendant 5 min dans une boîte de Pétri dans l'armoire de biosécurité. </li><li> Couper les fémurs de moitié, et le tibia par sa pointe plus fine. Faire infuser l'intérieur de l'os avec 1 ml de milieu RPMI (sans sérum mais avec des antibiotiques) à l'aide d'une seringue stérile sur une boîte de Pétri stérile. </li><li> La suspension cellulaire est recueilli et lavé 2X dans le milieu RPMI par 10 centrifugation min dans un tube de 15 ml de centrifugeuses à 1100 RPM dans une centrifugeuse réfrigérée (4 ° C) avec un rotor swing. </li><li> Après le dernier lavage, remettre en suspension les cellules dans 2 ml de tampon de lyse ACK et incuber pendant 5 min à température ambiante afin d'éliminer les globules rouges. </li><li> Ajouter 13 ml de RPMI avec 10% de FBS, resuspendre et laver 2X dans ce milieu avec les mêmes paramètres que décrite au point 1.6. </li><li> Compter les cellules, ajuster à 2 x 10 5 cellules / ml avec du RPMI 10% SVF, et ajoutez rm-GM-CSF (20 ng / ml final) 5. </li><li> Ajouter 10 ml de cette suspension à une stérile, la qualité microbiologique, 10 cm boîte de Petri, et la culture dans un incubateur à CO 2 (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Trois jours plus tard, ajouter un autre 10 ml de RPMI 10% SVF à 20 ng / l de rmGM-CSF à chacun des plats préparés. </li><li> Trois jours plus tard, 10 ml de suspension cellulaire sont récupérés à partir de chaque boîte de Pétri, centrifugé comme dans 1.6, remis en suspension dans le même volume de RPMI 10% SVF avec rmGM-CSF et retourné à la boîte de Pétri. Les cellules sont cultivées pendant 2 jours supplémentaires dans l'incubateur CO 2. </li></ol> 2. Collecte et l'étiquetage des PED <ol><li> Après 8 jours de culture des cellules faiblement adhérentes sont récupérées par lavage de la boîte de Pétri avec un milieu frais. Ce protocole rend environ 2-4 x10 8 PED dans nos mains. Les cellules peuvent être analysés pour phénotype DC par cytométrie en flux. </li><li> Cellules prélevées sont ensuite étiquetées avec le Qtracker 655 Kit marquage cellulaire suivant strictement les instructions du fabricant. </li><li> Nous avons obtenu d'excellents résultats étiquetage dérivées de la moelle osseuse de souris avec les PED Qdots à une concentration de 10 nM. Pour ce faire, des aliquotes de composants cellulaires Kit Qtracker Etiquetage A et B sont mélangés dans des volumes égaux, incubé pendant 5 min à température ambiante, et immédiatement après dilution 1 / 100 en milieu frais avec vortex pendant 30 s. </li><li> Pour tache 5 x 10 6 CD, mélanger 5 ul de chaque composants du kit A et B dans un tube Eppendorf et incuber pendant 5 min à température ambiante. Ensuite, ajoutez 1 ml de RPMI FBS incuber 10%, et le vortex pendant 30 secondes. </li><li> Ajouter 0,5 ml de suspension cellulaire contenant 5 x10 6 CD, et incuber à 37 ° C pendant 60 min. </li><li> Ensuite, laver les cellules 2X dans RPMI 10% SVF (1100 RPM). Les cellules peuvent être remises en suspension dans du RPMI pour la culture d'autres ou en PBS pour injection dans des souris expérimentales. </li></ol> 3. Evaluation de DC étiquetés <ol><li> Marquage cellulaire peut être évaluée au moyen de la microscopie à fluorescence. Pour ce faire, une goutte de suspension cellulaire sont ajoutés à une lame de microscope, recouvert d'une lamelle de verre, et évaluées avec un microscope à fluorescence en tenant compte que ces Qdots ont émission et d'excitation des spectres de 565nm et 525nm, respectivement de 405 (fig. 3 ) </li><li> À ce stade, les cellules marquées peuvent être utilisées pour injecter des animaux, ou de maturation peut être induite en incubant ces cellules pendant 48 h (37 ° C, 5 CO 2), en présence de LPS (100 ng / ml) et le TNF-( 20 ng / ml). Fluorescent étiquetage n'est pas affectée par la maturation des CD (fig. 4). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Par la présente, nous avons décrit comment préparer dérivées de la moelle osseuse de souris et comment les PED étiquetés avec Qdots fluorescentes. Fig. 1 résume la procédure pour obtenir la cellule, tandis que la Fig. 2 illustre la procédure à les étiqueter avec Qdots. Comme le montre la Fig. 3, presque toutes les cellules sont marquées par cette procédure, et ce n'est pas affectée par la maturation des CD avec des facteurs inflammatoires (Fig. 4). Fig. 5 montre que Qdot teinté PED (Fig.5a) se comportent similaires aux non-tachés cellules lorsqu'elles sont traitées avec un cocktail inflammatoires. Les deux préparations cellulaires de la même réguler positivement l'expression des molécules de costimulation (Fig. 5b), et de produire des quantités similaires de l'IL-6 (fig. 5c) et l'oxyde nitrique (fig. 5d) à des stimuli de maturation. Ceci concorde avec précédes unités d'organisation des données publiées indiquant que la coloration Qdot n'affecte pas la capacité de DC à se transformer en cellules matures capables de provoquer des réponses immunitaires [6]. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées pour injecter des animaux de laboratoire. Comme le montre la Fig. 6, 2 jours après l'injection intraveineuse de PED étiquetés dans des souris, nous avons été capables de détecter Qdot cellules colorées dans la rate. Ceci est également en accord avec les précédents données publiées montrant l'utilisation des nanocristaux Qdot pour évaluer la migration des DC in vivo [6] par l'imagerie non invasive et cytométrie de flux. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Organigramme Figure 1. Génération du CC de la moelle osseuse. Par la présente, nous dépeignent le processus pour obtenir la moelle osseuse DC dérivées. Les deux tibias et les fémurs sont disséqués et propre à partir de tissus environnants. Conseils osseuse sont préservées et l'intérieur de l'os sont rincées avec support. Après l'élimination des globules rouges, cellules de moelle osseuse sont cultivés pendant 8 jours en présence de GM-CSF pour les différencier en DC. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Organigramme Figure 2. De la procédure d'étiquetage. Aliquotes égales des composants de la cellule Kit Qtracker Etiquetage A et B sont mélangés dans un tube Eppendorf. Les cellules dendritiques sont collectées à partir de 8 jours cultures de moelle osseuse avec GM-CSF et mélangé avec le colorant d'étiquetage pour 60 min à 37C. Puis les cellules sont lavées dans les médias afin d'éliminer les particules d'étiquetage excès. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Microphotographie fluorescent des PED immédiatement après l'étiquetage. Une goutte de cellules marquées a été déposé sur une lame de verre et couverts par une lamelle. Ensuite, des échantillons ont été évalués dans un microscope à fluorescence et images ont été acquises par une caméra numérique 5.0 Micropublisher CCD couleur (QImaging, Surrey, BC Canada). <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Microphotographie fluorescent des PED après 48 h de maturation in vitro. PED étiquetés ont été cultivés pendant 48 h avec le LPS (100 ng / ml) et le TNF-α (20 ng / ml) sur des lames de verre sur un incubateur à CO 2 (37 ° C, 5% CO 2). Ensuite, des échantillons ont été lavés avec du PBS (5 min, 2X), fixées à l'acétone (15 min, 4 ° C) et de contraste avec le DAPI. Les cellules ont été évaluées dans un microscope à fluorescence comme ci-dessus. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. L'activité biologique des Qdot teinté CD matures. PED étiquetés mûri in vitro, comme ci-dessus ont été analysés par cytométrie en flux (A) et (B). (A) Qdot cellules colorées donner un signal fort dans le FL3 (PerCP) canal. Shaded histogramme: contrôle non colorées. (B) PED Qdot-colorées et non colorées ont en outre été colorés avec des anticorps spécifiques contre la maturation des marqueurs CD86 et CD40, et contrôle isotypique. Les cellules ont ensuite été analysées dans un cytomètre en flux FACSort (Becton Dickinson, San Jose, CA). De plus, l'IL-6 (C) et l'oxyde nitrique (NO) ont été déterminés dans les surnageants de maturité Qdot teinté PED et les contrôles. Les niveaux d'IL-6 et de l'oxyde nitrique ont été déterminés par analyse ELISA et test de Griess que nous avons décrit précédemment 7, 8. Toutes les données ont montré dans cette figure est représentative de deux ou trois expériences indépendantes montrant des résultats similaires. Les données ont été analysées par ANOVA en utilisant le logiciel GraphPad. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig6.jpg" alt="Figure 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 6"> Figure 6. Détection des PED dans les tissus étiquetés disséqués. Étiquetés CD matures (1x10 6 cellules) ont été injectés par voie intraveineuse à des souris C57BL / 6. (A) Deux jours plus tard, les souris ont été sacrifiées et les rates recueillies, snap congelés, embarqué dans un PTOM, et 8 sections uM préparés en utilisant un cryostat. Ensuite, des échantillons ont été fixés avec de l'acétone (15 min, 4 ° C) et de contraste avec le DAPI. Les cellules ont été évaluées dans un microscope à fluorescence comme ci-dessus figure 6a:. Grossissement de 40X, fig 6b: grossissement 100X, fig. 6C, grossissement 400x.

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Murin myéloïde) PED ont été largement utilisées afin de déterminer l&#39;efficacité et l&#39;amélioration des vaccins à base de DC; enquêter sur DC: les interactions des cellules T ou de développement continu, et déterminer leur rôle dans diverses maladies 9-11. Par la présente, nous montrons comment générer les PED à partir de précurseurs récupéré de courges os de tibias et les fémurs. Nous récupérons les os sans couper les bouts, nous permettant de les stériliser par immersion dans l&#39;éthanol à 70%, réduisant ainsi la probabilité de contamination. Pour différencier les PED à partir des cellules de moelle osseuse, nous n&#39;utilisons que le GM-CSF que 5 décrit précédemment. Bien que certains protocoles utilisent aussi l&#39;IL-4, il a été rapporté que cette cytokine n&#39;est pas nécessaire lorsqu&#39;on travaille avec des niveaux élevés de GM-CSF 12. En effet, nous l&#39;avons déjà démontré que ces contrôleurs sont capables d&#39;induire des réponses immunitaires 13. Aussi, les soins doivent être prises pour récupérer uniquement les cellules faiblement adhérentes à partir de 8 jours cultures par lavage de la boîte de Pétri avec un milieu de cellules attachées depuis montrent un phénotype plus monocyte. Ici, nous montrons l&#39;étiquetage des PED avec des particules fluorescentes Qdot. Cet étiquetage a peu de respect avantages à d&#39;autres méthodes. Premièrement, les particules Qdots sont facilement incorporés dans les cellules. Deuxièmement, le signal fluorescent est très élevé et n&#39;est pas altérée par la maturation des CD. Troisièmement, la fluorescence n&#39;est pas perdu lorsque les cellules ou les tissus sont fixés avec des solvants comme l&#39;acétone, contrairement à ce qui se passe si la GFP est utilisé pour marquer les PED 14, donnant plus de flexibilité au moment de choisir les protocoles de coloration. Enfin, le signal haute fluorescente donnée par ces particules permet de visualiser les cellules des tissus, malgré l&#39;auto-fluorescence. Comme décrit précédemment 6, coloration Qdot n&#39;a pas affecté la capacité de maturation de ces cellules. Par la présente, nous montrons que Qdot teinté PED se comportent de façon similaire que les non-tachés PED, upregulating molécules de costimulation, et la production d&#39;IL-6 et l&#39;oxyde nitrique en réponse aux stimuli inflammatoires. Bien que les PED sont des cellules spécialisées dans le déclenchement des réponses immunitaires, elles ont été montrées à participer dans des conditions pathologiques comme le cancer et l&#39;athérosclérose 4, 15, 16. Ils ont été également affirmé à participer au processus angiogénique 17, 18, ​​a même suggéré que la structure participe à l&#39;élaboration de nouveaux vaisseaux 19, 20. Ainsi, les méthodes qui permettent de DC suivi in vivo, et de déterminer leur localisation géographique dans les différents tissus 4, 21, 22 sont très précieux.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Souris C57BL / 6 </td><td> Laboratoires Jackson </td><td></td><td> Les femelles, âgées de 6-8 semaines </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-119 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin, qualifié </td><td> Invitrogen </td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotiques antimycosiques </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-096 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10010-049 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon de lyse ACK </td><td> Lonza Walkersville, Inc </td><td> 10-548E </td><td></td></tr><tr><td> Recombinant GM-CSF murin </td><td> PeproTech Inc </td><td> 315-03 </td><td></td></tr><tr><td> Qtracker 655 kit de marquage cellulaire </td><td> Invitrogen </td><td> Q25021MP </td><td></td></tr><tr><td> Lipopolysaccharide </td><td> Invivogen </td><td> tlrl-eblps </td><td></td></tr><tr><td> Recombinant murin TNF alpha </td><td> Peprotech </td><td> 315-01A </td><td></td></tr><tr><td> CD86 anticorps </td><td> BD Biosciences </td><td> 553691 </td><td></td></tr><tr><td> CD40 anticorps </td><td> BD Biosciences </td><td> 553791 </td><td></td></tr><tr><td> Système réactif de Griess </td><td> Promega </td><td> G2930 </td><td></td></tr><tr><td> IL-6 anticorps de capture </td><td> eBioscience </td><td> 13-7061-81 </td><td></td></tr><tr><td> D&#39;anticorps de détection d&#39;IL-6 </td><td> eBioscience </td><td> 13-7062-81 </td><td></td></tr></tbody></table>

génération et d&#39;étiquetage des murins de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées des nanocristaux qdot pour les études de suivi

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Cellules dendritiques (CD) sont des cellules présentant l&#39;antigène professionnelles (APC) a trouvé dans les tissus périphériques et dans les organes immunologiques comme le thymus, la moelle osseuse, la rate, les ganglions lymphatiques et les plaques de Peyer 1-3. PED présente dans l&#39;échantillon des tissus périphériques de l&#39;organisme à la présence d&#39;antigènes, dont ils prennent, traiter et présenter dans leur surface dans le contexte des molécules de complexe majeur d&#39;histocompatibilité (CMH). Ensuite, l&#39;antigène CD chargés de migrer vers les organes immunologiques où ils présentent l&#39;antigène aux lymphocytes T traitées déclenchement des réponses immunitaires spécifiques. Une façon d&#39;évaluer les capacités migratoires des PED est de les étiqueter avec des colorants fluorescents 4. Par la présente, nous démontrons l&#39;utilisation de nanocristaux fluorescents Qdot à l&#39;étiquette dérivées de moelle osseuse murine DC. L&#39;avantage de cet étiquetage est que Qdot nanocristaux possèdent stable et à long fluorescence durables qui les rendent idéales pour la détection de cellules marquées dans les tissus récupérés. Pour ce faire, les premières cellules seront récupérés auprès des courges d&#39;os murins et cultivés pendant 8 jours dans la présence de granulocytes macrophages facteur stimulant les colonies afin d&#39;induire la différenciation DC. Ces cellules seront ensuite marqués avec Qdots fluorescents par de courtes incubation in vitro. Les cellules colorées peuvent être visualisées avec un microscope à fluorescence. Les cellules peuvent être injectées dans les animaux de laboratoire à ce point ou peut être en cellules matures après incubation in vitro avec des stimuli inflammatoires. Dans nos mains, la maturation des CD n&#39;a pas de déterminer la perte de signal fluorescent ni coloration Qdot affecter les propriétés biologiques des PED. Lors de l&#39;injection, ces cellules peuvent être identifiées dans les organes immunitaires par microscopie à fluorescence après la dissection typiques et des procédures de fixation.

Dendritiques antigènes des cellules d&#39;absorption et de migrer vers les organes à l&#39;abri de présenter les antigènes aux cellules T traitées. Qdot nanocristal étiquetage fournit un signal de longue durée et stable fluorescentes. Cela permet le suivi des cellules dendritiques à différents organes par microscopie fluorescente.

Génération et d&#39;étiquetage des murins de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées des nanocristaux Qdot pour les études de suivi

Les cellules dendritiques (CD) sont des cellules présentatrices d'antigène (CPA) professionnelles que l'on trouve dans les tissus périphériques et dans les organes immunologiques tels que le thymus, la moelle...

L'objectif général de cette procédure est de préparer des cellules dendritiques pour des études d'imagerie à l'aide de nanocristaux Q dot. Cela est réalisé en isolant d'abord les cellules de la moelle osseuse à partir des fémurs et tibias de souris. Ensuite, des cultures de cellules de la moelle osseuse sont mises en place afin de favoriser la différenciation cellulaire en cellules dendritiques en présence de GM-CSF.Ensuite, les cellules dendritiques sont récupérées à partir des cultures de cellules de la moelle osseuse après huit jours. La dernière étape de la procédure consiste à colorer les cellules avec des nano-cristaux fluorescents Q. En fin de compte, les cellules dendritiques fortement colorées peuvent être visualisées par microscopie de fluorescence.Le principal avantage de l'utilisation de cette technologie par rapport à d'autres méthodes, comme l'utilisation de cellules dendritiques marquées avec GFP, est que les nano-cristaux Q dot conservent leur fluorescence même après une coloration avec des solvants organiques tels que l'acétone. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés pour les biologistes des cellules dendritiques, telles que les propriétés de migration de ces cellules dans diverses maladies ou dans le contexte de différentes pathologies. La procédure de coloration sera démontrée par Maria Ali, étudiante diplômée de mon laboratoire.Après l'euthanasie, disséquer soigneusement les tibias et les fémurs de deux souris sans couper les extrémités osseuses. Ensuite, utiliser du papier absorbant pour nettoyer tous les tissus attachés aux os, en prenant soin de ne pas les briser. Dans une hotte de sécurité biologique.Remplissez une boîte de Pétri de 35 millimètres avec de l'éthanol à 70 %, puis immergez les os dans l'éthanol pendant 10 minutes. Une fois les os stérilisés, retirez-les de l'éthanol et laissez-les sécher à l'air pendant cinq minutes dans une nouvelle boîte de Pétri. Ensuite, coupez le fémur en son milieu et le tibia par leur extrémité la plus fine.Infusez l'intérieur des os avec un millilitre de milieu RPMI à l'aide d'une seringue stérile. Recueillez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et lavez-la deux fois avec du milieu RPMI par une centrifugation de 10 minutes à 300 ×g à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse équipée d'un rotor à godets oscillants. Après le dernier lavage, resuspendez les cellules dans deux millilitres de tampon de lyse CK et incubez pendant cinq minutes à température ambiante afin d'éliminer les globules rouges.Ensuite, ajoutez 13 millilitres de RPMI supplémenté de 10 % de FBS et lavez les cellules deux fois supplémentaires dans ce milieu en utilisant les mêmes paramètres de centrifugation qu'auparavant. Comptez les cellules et ajustez la concentration à deux fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre. Dans le RPMI supplémenté de 10 % de FBS, ajoutez du G-M-C-S-F murin recombinant à une concentration finale de 20 nanogrammes par millilitre.Ensuite, ajouter 10 millilitres de cette suspension dans une boîte de Petri stérile de qualité microbiologique de 10 centimètres et effectuer la culture. La suspension cellulaire dans un incubateur à dioxyde de carbone. Trois jours plus tard, ajouter 10 millilitres supplémentaires de RPMI contenant 10 % de FBS et 20 nanogrammes par millilitre de G-M-C-S-F murin recombinant à chacune des boîtes préparées.Trois jours supplémentaires plus tard, récupérez 10 millilitres de suspension cellulaire à partir de chaque boîte de Pétri, centrifugez les cellules dans les mêmes conditions et resuspendez le culot dans le même volume de RPMI supplémenté de 10 % de FBS que celui récupéré des boîtes de Pétri, puis complétez avec du G-M-C-S-F murin recombinant frais. Enfin, remettez la suspension cellulaire dans chaque boîte de Pétri d'origine et cultivez les cellules pendant deux jours supplémentaires dans l'incubateur à dioxyde de carbone. Après huit jours de culture, récupérez les cellules en suspension et faiblement adhérentes en lavant les boîtes de Pétri avec du milieu frais.Ensuite, marquer les cellules recueillies à l’aide du kit de marquage cellulaire Q tracker 655 en suivant strictement les instructions du fabricant pour marquer cinq fois 10 à la puissance 6 des DCs dérivées de la moelle osseuse murine avec des nano-cristaux Q à une concentration de 10 nano-molaire. Mélanger d’abord cinq microlitres de chacun des composants A et B du kit dans un tube Eppendorf, puis incuber le mélange pendant cinq minutes à température ambiante. Ajouter ensuite un millilitre de RPMI complété avec 10 % de SFB et vortexer le tube pendant 30 secondes.Ensuite, ajoutez cinq fois 10 à la puissance cinq Dcs en suspension dans 0,5 millilitre de RPMI plus 10 % de FBS dans le tube einor et incubez les cellules dans la solution D à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Lavez ensuite les cellules deux fois dans du RPMI plus 10 % de FBS dans les mêmes conditions qu’auparavant, puis remettez en suspension le culot dans du RPMI.Cette figure montre un exemple de microphotographie fluorescente de dcs. Immédiatement après le marquage, une goutte de cellules marquées a été déposée sur une lame de verre et recouverte d'une lamelle. Ensuite, les échantillons ont été analysés à l'aide d'un microscope à fluorescence.Dans cette figure, une microphotographie fluorescente de CSD après 48 heures de maturation in vitro peut être observée, avec des étiquettes. Les CSD ont été cultivées pendant 48 heures avec 100 nanogrammes par millilitre de LPS et 20 nanogrammes par millilitre de TNF alpha, dans des chambres de culture sur lame, placées dans un incubateur à dioxyde de carbone. Ensuite, les échantillons ont été lavés au PBS, fixés à l'acétone, contre-colorés au DPI et analysés au microscope fluorescent.Les DC marquées matures in vitro ont été analysées par cytométrie en flux. Les cellules marquées avec des pointes quantiques émettent un signal intense dans le canal FL3. Les DC marquées et non marquées ont été en outre colorées avec des anticorps spécifiques dirigés contre les marqueurs de maturation, CD86 et CD40, ainsi que des contrôles d'isotype. Les cellules ont ensuite été analysées par cytométrie en flux. Par ailleurs, les concentrations d'IL-6 et d'oxyde nitrique ont été déterminées dans les surnageants de DC matures marquées avec des pointes quantiques et des contrôles.Ici, une figure représentative de DCS marquées dans un tissu disséqué est présentée. Des DCS matures ont été injectées par voie intraveineuse chez des souris C57 Black Six. Trois jours plus tard, les souris ont été sacrifiées et les splènes ont été collectés.Des échantillons congelés instantanément et inclus dans l’OCT ont été découpés en sections de huit micromètres à l’aide d’un cryostat. Les échantillons ont ensuite été fixés à l’acétone, contre-colorés à la DPI et analysés au microscope fluorescent. Suite à ces procédures.D'autres méthodes, comme la présentation d'antigènes ou la maturation avec différents stimuli, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la migration des cellules dendritiques en réponse à divers stimuli de maturation.

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