Génération et d'étiquetage des murins de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées des nanocristaux Qdot pour les études de suivi

L'objectif général de cette procédure est de préparer des cellules dendritiques pour des études d'imagerie à l'aide de nanocristaux Q dot. Cela est réalisé en isolant d'abord les cellules de la moelle osseuse à partir des fémurs et tibias de souris. Ensuite, des cultures de cellules de la moelle osseuse sont mises en place afin de favoriser la différenciation cellulaire en cellules dendritiques en présence de GM-CSF.

Ensuite, les cellules dendritiques sont récupérées à partir des cultures de cellules de la moelle osseuse après huit jours. La dernière étape de la procédure consiste à colorer les cellules avec des nano-cristaux fluorescents Q. En fin de compte, les cellules dendritiques fortement colorées peuvent être visualisées par microscopie de fluorescence.

Le principal avantage de l'utilisation de cette technologie par rapport à d'autres méthodes, comme l'utilisation de cellules dendritiques marquées avec GFP, est que les nano-cristaux Q dot conservent leur fluorescence même après une coloration avec des solvants organiques tels que l'acétone. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés pour les biologistes des cellules dendritiques, telles que les propriétés de migration de ces cellules dans diverses maladies ou dans le contexte de différentes pathologies. La procédure de coloration sera démontrée par Maria Ali, étudiante diplômée de mon laboratoire.

Après l'euthanasie, disséquer soigneusement les tibias et les fémurs de deux souris sans couper les extrémités osseuses. Ensuite, utiliser du papier absorbant pour nettoyer tous les tissus attachés aux os, en prenant soin de ne pas les briser. Dans une hotte de sécurité biologique.

Remplissez une boîte de Pétri de 35 millimètres avec de l'éthanol à 70 %, puis immergez les os dans l'éthanol pendant 10 minutes. Une fois les os stérilisés, retirez-les de l'éthanol et laissez-les sécher à l'air pendant cinq minutes dans une nouvelle boîte de Pétri. Ensuite, coupez le fémur en son milieu et le tibia par leur extrémité la plus fine.

Infusez l'intérieur des os avec un millilitre de milieu RPMI à l'aide d'une seringue stérile. Recueillez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et lavez-la deux fois avec du milieu RPMI par une centrifugation de 10 minutes à 300 ×g à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse équipée d'un rotor à godets oscillants. Après le dernier lavage, resuspendez les cellules dans deux millilitres de tampon de lyse CK et incubez pendant cinq minutes à température ambiante afin d'éliminer les globules rouges.

Ensuite, ajoutez 13 millilitres de RPMI supplémenté de 10 % de FBS et lavez les cellules deux fois supplémentaires dans ce milieu en utilisant les mêmes paramètres de centrifugation qu'auparavant. Comptez les cellules et ajustez la concentration à deux fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre. Dans le RPMI supplémenté de 10 % de FBS, ajoutez du G-M-C-S-F murin recombinant à une concentration finale de 20 nanogrammes par millilitre.

Ensuite, ajouter 10 millilitres de cette suspension dans une boîte de Petri stérile de qualité microbiologique de 10 centimètres et effectuer la culture. La suspension cellulaire dans un incubateur à dioxyde de carbone. Trois jours plus tard, ajouter 10 millilitres supplémentaires de RPMI contenant 10 % de FBS et 20 nanogrammes par millilitre de G-M-C-S-F murin recombinant à chacune des boîtes préparées.

Trois jours supplémentaires plus tard, récupérez 10 millilitres de suspension cellulaire à partir de chaque boîte de Pétri, centrifugez les cellules dans les mêmes conditions et resuspendez le culot dans le même volume de RPMI supplémenté de 10 % de FBS que celui récupéré des boîtes de Pétri, puis complétez avec du G-M-C-S-F murin recombinant frais. Enfin, remettez la suspension cellulaire dans chaque boîte de Pétri d'origine et cultivez les cellules pendant deux jours supplémentaires dans l'incubateur à dioxyde de carbone. Après huit jours de culture, récupérez les cellules en suspension et faiblement adhérentes en lavant les boîtes de Pétri avec du milieu frais.

Ensuite, marquer les cellules recueillies à l’aide du kit de marquage cellulaire Q tracker 655 en suivant strictement les instructions du fabricant pour marquer cinq fois 10 à la puissance 6 des DCs dérivées de la moelle osseuse murine avec des nano-cristaux Q à une concentration de 10 nano-molaire. Mélanger d’abord cinq microlitres de chacun des composants A et B du kit dans un tube Eppendorf, puis incuber le mélange pendant cinq minutes à température ambiante. Ajouter ensuite un millilitre de RPMI complété avec 10 % de SFB et vortexer le tube pendant 30 secondes.

Ensuite, ajoutez cinq fois 10 à la puissance cinq Dcs en suspension dans 0,5 millilitre de RPMI plus 10 % de FBS dans le tube einor et incubez les cellules dans la solution D à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Lavez ensuite les cellules deux fois dans du RPMI plus 10 % de FBS dans les mêmes conditions qu’auparavant, puis remettez en suspension le culot dans du RPMI.

Cette figure montre un exemple de microphotographie fluorescente de dcs. Immédiatement après le marquage, une goutte de cellules marquées a été déposée sur une lame de verre et recouverte d'une lamelle. Ensuite, les échantillons ont été analysés à l'aide d'un microscope à fluorescence.

Dans cette figure, une microphotographie fluorescente de CSD après 48 heures de maturation in vitro peut être observée, avec des étiquettes. Les CSD ont été cultivées pendant 48 heures avec 100 nanogrammes par millilitre de LPS et 20 nanogrammes par millilitre de TNF alpha, dans des chambres de culture sur lame, placées dans un incubateur à dioxyde de carbone. Ensuite, les échantillons ont été lavés au PBS, fixés à l'acétone, contre-colorés au DPI et analysés au microscope fluorescent.

Les DC marquées matures in vitro ont été analysées par cytométrie en flux. Les cellules marquées avec des pointes quantiques émettent un signal intense dans le canal FL3. Les DC marquées et non marquées ont été en outre colorées avec des anticorps spécifiques dirigés contre les marqueurs de maturation, CD86 et CD40, ainsi que des contrôles d'isotype. Les cellules ont ensuite été analysées par cytométrie en flux. Par ailleurs, les concentrations d'IL-6 et d'oxyde nitrique ont été déterminées dans les surnageants de DC matures marquées avec des pointes quantiques et des contrôles.

Ici, une figure représentative de DCS marquées dans un tissu disséqué est présentée. Des DCS matures ont été injectées par voie intraveineuse chez des souris C57 Black Six. Trois jours plus tard, les souris ont été sacrifiées et les splènes ont été collectés.

Des échantillons congelés instantanément et inclus dans l’OCT ont été découpés en sections de huit micromètres à l’aide d’un cryostat. Les échantillons ont ensuite été fixés à l’acétone, contre-colorés à la DPI et analysés au microscope fluorescent. Suite à ces procédures.

D'autres méthodes, comme la présentation d'antigènes ou la maturation avec différents stimuli, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la migration des cellules dendritiques en réponse à divers stimuli de maturation.