Vibratome sectionnement pour la préservation accrue de la cytoarchitecture de l'Organe de Corti des mammifères

L'objectif général de l'expérience suivante est d'obtenir une image de l'organe de Corti avec une préservation maximale de l'architecture cellulaire. Cela est réalisé en sectionnant, à l'aide d'un vibrotome, des oreilles internes disséquées et fixées afin d'obtenir des sections épaisses tout en minimisant le nombre de surfaces coupées par cochlée. Les sections vibrotomiques sont ensuite colorées par immunohistochimie, ce qui permet l'identification de divers types cellulaires et structures cellulaires dans l'organe de Corti.

Ensuite, les sections sont montées et observées par microscopie confocale afin d'obtenir des images haute résolution définissant les positions en Z à travers chaque section épaisse de Vibram. Les résultats obtenus permettent la microscopie confocale des cellules et des structures de l'organe de Corti avec une perturbation minimale due au processus de sectionnement. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'inclusion en paraffine et la cryossection, est que les dommages physiques à la cochlée sont minimisés, permettant une meilleure préservation de l'architecture cellulaire de l'organe de Corti. Afin d'isoler l'oreille interne, décapitez d'abord une souris adulte euthanasiée à l'aide d'une lame de rasoir.

Ouvrir le crâne le long de la ligne médiane, puis retirer le cerveau pour exposer chaque oreille à l’aide d’une pince avec précaution, et extraire les deux oreilles internes. Plonger les oreilles internes dans un flacon cryogénique contenant du paraformaldéhyde frais à 4 %, et agiter doucement toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, éliminer le fixateur par trois rinçages avec du tampon salin phosphate une fois, puis décalcifier le tissu adulte en incubant dans du EDTA à 10 % à quatre degrés Celsius pendant cinq jours.

Rincez et conservez les oreilles internes dans du PBS 1× jusqu'à leur préparation. Préparez de l'agarose à bas point de fusion à 4 % en ajoutant l'agarose au PBS 1× et en chauffant au micro-ondes jusqu'à dissolution complète de l'agarose. Conservez l'agarose fondue dans un bain-marie à 55 °C jusqu'à utilisation.

Retirez l’oreille interne du PBS à l’aide de pinces et placez-la au fond d’un moule d’inclusion démontable. Aspirez tout liquide résiduel, puis remplissez le moule avec du mol et du aros de manière à recouvrir complètement l’oreille interne afin d’obtenir des coupes transversales de l’organe de Corti. Positionnez l’oreille interne de façon à ce qu’elle soit vue en vue latérale, avec le canal semi-circulaire latéral.

Angle visible, oreille interne de manière que la ligne formée par la région postérieure la plus reculée de la cochlée forme un angle de 45 degrés par rapport au plan de sectionnement prévu. Une fois que l'agarose a solidifié, retirer le moule en plastique. Utiliser une lame de rasoir pour éliminer l'agarose excédentaire et former un cube.

Veiller à laisser suffisamment d'aros environnants pour maintenir bien soutenu le tissu. Pendant la coupe, fixer la base du cube d'aros à la surface de coupe du vibromicrotome à l'aide de colle superglue, sectionner à une épaisseur de 40 à 100 micromètres et recueillir les tranches dans une boîte contenant du PBS à 1 fois avec 0,1 % de Triton X-100. À l'aide de pinces.

Disséquez les aros loin des sections de tissu. Transférez les sections dans une boîte contenant du PBS frais avec 0,1 % de Triton X-100, en utilisant une pipette à embout large, puis poursuivez avec la coloration par anticorps dans une plaque de culture tissulaire. Une fois la coloration par anticorps terminée, les sections de tissu sont montées sur une lame de microscope.

Pour éviter d'écraser les sections de tissu épaisses, déposez une couche de graisse à vide en forme de carré autour de la section afin de créer un espace entre la lamelle et la lame. Transférez la section de tissu sur une lame de microscope. Appuyez fermement sur les bords de la lamelle pour créer un joint étanche.

Alternativement, déposer un point d'un microlitre d'ETA par chromatographie sur une résine de taille de maille connue dans chacun des quatre coins où la lame couvrepose reposera, poser délicatement la lame couvrepose et sceller les bords avec du vernis à ongles avant l'acquisition de la première image en microscopie confocale de Zack à travers une section transversale d'un organe de Corti. Les cellules ciliées internes, les cellules ciliées internes adjacentes, les cellules ciliées externes et les cellules de Deiters sont visibles. Lors de la coloration nucléaire, les cellules pilaires sont visibles grâce à une immunomarquage par anticorps anti-S100 et apparaissent en jaune. Au fur et à mesure que le Zack progresse à travers la section par pas de trois micromètres, le nombre de cellules pilaires peut être déterminé en notant l'apparition et la disparition de leurs noyaux.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment découper l'oreille interne au moyen du vibram, réaliser une immunohistochimie sur ces sections, puis effectuer une imagerie par microscopie confocale. Cette procédure simple, généralisable à tout anticorps, garantit une préservation maximale de l'organisation cellulaire de l'organe de Corti.