Name: Calorimétrie titration isotherme pour Mesure macromolécules-ligand daffinité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Apprenez la calorimétrie de titration isotherme pour étudier les interactions ligand-macromolécule en biochimie. Cette méthode permet de déterminer simultanément l'enthalpie et l'entropie de liaison.

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Calorimétrie de titrage isotherme (ITC) est une technique bien établie qui permet de déterminer tous les paramètres thermodynamiques (affinité, enthalpie et stœchiométrie) d'une interaction de liaison dans une expérience. 1 CCI travaille en titrant un réactif dans un second réactif dans des conditions isothermes. Le signal mesuré est la chaleur dégagée ou absorbée lors de l'interaction (liaison) des deux réactifs. Une série d'injections sont pratiquées et le signal de la chaleur sera proche de zéro que le réactif limitant devient saturé. Montage de l'isotherme donne les paramètres thermodynamiques. Plusieurs examens sont disponibles qui décrivent l'instrumentation ainsi que les mathématiques de la collecte de données et d'analyse. Calorimètres 2,3 Bien d'autres sont disponibles (notamment les CCI 200 avec de petits volumes), ici, nous décrivons un protocole général pour la VP-ITC fabriqués par MicroCal (maintenant partie de GE Healthcare). 1. Préparation des échantillons <ol><li> Afin de préparer la macromolécule et le ligand dans un tampon, quelques problèmes potentiels doivent être abordés. S'adapte précis nécessitent des concentrations appropriées de la macromolécule, l'espèce qui va généralement dans la cellule de l'échantillon de l'ITC, et le ligand, l'espèce dans la seringue. Parce que certaines protéines agrégées à des concentrations élevées nécessaires pour l'espèce dans la seringue, le plus souvent la protéine est chargée dans la cellule d'échantillon. La concentration optimale macromolécule est déterminé à partir "c", le produit de l'affinité prédit du système, qui peut être estimée en utilisant des méthodes orthogonales avant d'utiliser le CCI, et la concentration totale macromolécule, où c = K a * [M]. Les valeurs optimales de la gamme C 10-1000, 1 s'il est possible d'obtenir des données précises pour la faiblesse des systèmes de sous-contraignante des conditions expérimentales spécifiques avec des valeurs C en dessous de la limite inférieure. 4 Ainsi, la concentration macromolécule doit être déterminée avec cette gamme de c valeurs à l'esprit (par exemple, pour un K a de 10 6 M -1, les concentrations macromolécule de 10 à 1000 um devrait être utilisé). La connaissance préalable de l'affinité de liaison du système peut contribuer à minimiser la protéine utilisée pour l'ITC à travers une meilleure conception de l'expérience de l'ITC. La concentration du ligand doit être suffisamment grand (7-25 fois plus concentré que le Kd pour le site de liaison du ligand plus faible) de sorte que la saturation se produit dans le premier tiers à la moitié de la titration. Ajustement précis des données exige également la saturation du signal. Pour les systèmes avec affinité de liaison plus élevée, une concentration inférieure ligand doit être utilisé pour éviter la saturation trop tôt dans le titrage, ce qui donnera s'adapte inexactes. Une fois la chaleur de contrôle de la dilution (titrage soit de ligand dans le buffer) a été soustraite de la titration, l'enthalpie à saturation devrait approcher de zéro. </li><li> Parce que les impuretés de petites molécules peut donner lieu à des signaux artéfactuelle dans les mesures de l'ITC, il est préférable, si possible, que la macromolécule et le ligand de manière exhaustive dialyse contre du tampon. Alternativement, chromatographie sur colonne, le dessalage colonnes de centrifugation, ou le tampon d'échange filtres centrifuges (par exemple, Centricons) peut être utilisée pour changer le tampon de la macromolécule. Si le ligand est une petite molécule, il peut être préparé en utilisant le tampon de dialyse après la macromolécule a été dialysé ou par dialyse contre les membranes de dialyse avec seuils adaptés pour les petites molécules (c. 100-500 Da pour un Spectra / Por Float-A-Lyzer ). Les différences dans la composition de tampon entre le ligand et des solutions macromolécule peut conduire à des signaux des artefacts de la chaleur de la dilution des impuretés dans les échantillons. Après la préparation, vérifiez que le pH du match tampon, macromolécule et le ligand (unités de pH ± 0,05) que les artefacts de l'enthalpie peuvent survenir en raison d'effets de tampon protonation. 5 Assurez-vous de préparer suffisamment de chaque espèce. Pour les expériences en triple et un contrôle de la dilution, la quantité de matériel nécessaire dépendra de la CCI utilisés. Mais, pour la plupart des instruments CCI qui ont approximativement 2 ml de cellules volume d'échantillon, au moins 6-7 ml de solution de macromolécule sera nécessaire, et peut être commodément préparés dans des tubes de 15 ml Falcon. Pour 300 seringues uL, 1-2 ml de solution devrait être suffisante, et peuvent être préparés dans des tubes Falcon soit ou microtubes. </li><li> La poussière et autres particules, peut causer des artefacts dans la ligne de base du thermogramme CCI. Il est impératif qu'ils soient retirés avant l'exécution de l'expérience. Après la préparation des solutions mères de l'échantillon, les échantillons doivent être centrifugés dans des microtubes de cinq minutes à 8000 à 14.000 RPM aux particules granulés dans la solution. Retirer le surnageant, en faisant attention à ne pas perturber le culot, et le placer dans un nouveau Falcon / microcentrifugeuse tube. Si des agents réducteurs sont nécessaires pour maintenir cystéines réduites, l'utilisation de faibles concentrations et les stocks frais de β-Mercaptoethanol, PTCE (tris (2-carboxy) phosphine) ou le dithiothréitol pour minimiser les artefacts dus à l'oxydation réducteur. En outre, la présence de solvants organiques dans la mémoire tampon (communes pour certains ligands de petites molécules qui peuvent avoir besoin de méthanol ou le DMSO pour être soluble) peut causer des artefacts du signal. Si des solvants organiques sont nécessaires pour le ligand, alors la solution macromolécule doit aussi contenir la même concentration pour éviter tout signal provenant de la chaleur de dilution du solvant organique. De légères différences dans la composition de tampon entre le ligand et macromolécule en raison de co-solvants, sels ou de pH sont possibles lors de la préparation des échantillons. Il est préférable de vérifier la dilution du ligand dans le tampon d'échantillon ou le tampon d'échantillon dans la macromolécule de s'assurer que les signaux de la chaleur résultant de différences dans le contenu du buffer ne causent pas de données résultant uniquement d'artefacts. </li><li> Vérifiez la concentration de la macromolécule et le ligand soin en utilisant des techniques appropriées à votre système (telles que les mesures d'absorbance, HPLC, dosages colorimétriques, les essais BCA pour les protéines, etc) pour enregistrer leurs concentrations exactes. Les différences dans la concentration réelle et la concentration utilisée pour ajuster l'isotherme provoquera des erreurs dans la stoechiométrie, enthalpie et l'affinité de liaison déterminée à partir de l'expérience. Il est commun pour dégazer les échantillons pour éviter les artefacts du signal due aux bulles d'air ou la libération des gaz dissous pendant le titrage, en particulier à des températures élevées. </li></ol> 2. Mise en place de l'Expérience <ol><li> Assurez-vous que la cellule d'échantillon et d'une seringue d'injection sont nettoyés selon le protocole du fabricant avant le chargement de la macromolécule et le ligand. Rincer la cellule échantillon à deux ou trois fois avec 1,8 ml d'eau distillée à l'aide de la seringue Hamilton (recours aux soins avec la seringue de Hamilton que le baril est facilement cassé ou plié l'aiguille). Suivant rincer la cellule d'échantillon à plusieurs reprises avec 1,8 ml de tampon. Chargez la cellule d'échantillon avec 1,8 ml de solution de macromolécule, en faisant attention à éviter la formation de bulles. </li><li> Remplissez la cellule de référence avec de l'eau distillée. Pour la plupart des tampons, l'eau distillée est bon d'utiliser comme solution de référence. Cependant, pour des tampons avec notamment des forces ioniques élevées ou osmolalité, il est préférable d'utiliser le tampon comme une référence. </li><li> Retirer les bulles d'air à partir des cellules de référence et l'échantillon en utilisant la seringue Hamilton. Déplacez doucement l'aiguille de la seringue va-et-les côtés de la cellule de frapper toutes les bulles qui peuvent être au fond de la cellule et attachés à la même au sommet de la cellule. Retirez tout excès de volume de l'échantillon et les cellules de référence. </li><li> Attacher une seringue en plastique à l'orifice de remplissage de la seringue d'injection à l'aide de tubes. Rincer la seringue avec de l'eau distillée. Suivez par un tampon de rinçage. Assurez-vous que la seringue d'injection est complètement évacué en aspirant l'air par le système. Placez l'aiguille de la seringue dans la solution de ligand et dessiner la solution de ligand dans la seringue d'injection jusqu'à la seringue entière est pleine. Continuer le dessin un peu de volume en excès (environ 50 pi ou plus) dans le port et les tubes attachés. Fermer immédiatement l'orifice de remplissage de la seringue et déconnecter la seringue tube en plastique. Purge et remplissage de la seringue d'injection deux fois plus pour éliminer les bulles de la seringue. Retirer la seringue de la solution de ligand et essuyez le côté avec une Kimwipe pour enlever les gouttes, en faisant attention de ne pas toucher le bout de la seringue à l'Kimwipe car cela peut enlever le volume de la seringue. Aussi, faites attention de ne pas frapper ou un bocal de la seringue car cela peut également causer la perte de volume à partir du bout de la seringue. Placez la seringue dans la cellule de l'échantillon. </li><li> Configurez les paramètres pour l'exécution du CCI. Pour les systèmes de liaison avec les signaux forte chaleur, un grand nombre d'injections à faible volume donneront des points de données plus pour le montage (par exemple 75 injections de 3 pi). Pour les systèmes qui ont des signaux faibles de la chaleur, un petit nombre d'injections grand volume sont préférables (par exemple 33 injections de 8 pi). Le plus souvent, moins d'injections avec des volumes d'injection plus élevées sont utilisées. Cela peut prendre plusieurs titrations d'optimiser les conditions qui sont les meilleurs pour votre système. Il est important de noter que l'enthalpie de liaison peuvent être soit exothermique ou endothermique, selon le système étudié. Malheureusement, certains systèmes ont des signaux à basse température, ce qui rend la chaleur de réaction difficile à déterminer. Problèmes avec de tels systèmes peuvent potentiellement être surmonté en augmentant la concentration de la macromolécule, en changeant la température de l'expérience (en fonction de la capacité thermique du système de liaison), et / ou modifier le pH ou la force ionique du tampon. </li><li> Voir également l'espacement de temps entre chaque injection. Il est impératif que après chaque injection de ligand, le système est donné le temps de s'équilibrer et le signal de la chaleur revient à la normale avant l'injection suivante se produit. Pour la plupart des systèmes, trois à cinq millesnutes devrait être suffisant. Le temps entre les injections doit être augmentée pour les systèmes où l'équilibration ne se produit pas dans les cinq minutes. </li><li> Parce qu'il y aura un certain mélange entre la macromolécule et solutions ligand dans la seringue une fois qu'il est inséré dans la cellule d'échantillon, la première injection donnera des résultats erronés. Il est préférable d'utiliser de petits volumes (par exemple 2 pl) pour l'un ou de deux premières injections (afin qu'ils puissent plus tard être mis au rebut) et garder les injections suivantes, les valeurs souhaitées. </li><li> Choisissez la température de l'expérience (à 25 ° C étant le plus commun, bien que des températures entre 2 et 80 ° C peut être utilisé). Il est préférable de choisir une température qui correspond à d'autres expériences (reliure, cinétique, etc) effectuées sur le système ligand-macromolécule. L'ITC peut être mis en place pour s'équilibrer à une température différente de la température de l'expérience. Si l'expérience va être effectuée à une température supérieure à 10 ° C, hors de la température ambiante, alors il est préférable de régler la température d'équilibration de l'instrument dans les 5 ° C de la température expérimentale. Cela diminuera le temps de l'instrument prendra pour atteindre la température de l'expérience. La vitesse d'agitation de la seringue doit également être envisagée. L'agitation est nécessaire pour un mélange adéquat du ligand et macromolécule pendant le titrage, mais certaines protéines sont déstabilisés par une agitation rapide. Pour ces cas, la vitesse d'agitation doit être fixé à un taux relativement faible. Une fois tous les paramètres expérimentaux ont été mis en place, puis l'expérience peut être démarré. </li><li> Une fois l'expérience terminée, l'ITC peut être nettoyée selon le protocole du fabricant. La solution dans la cellule échantillon à la fin de l'expérience peut être maintenu si les expériences complémentaires sur le mélange macromolécule-ligand sont souhaitées. </li><li> Répétez le titrage d'au moins une ou deux fois plus pour obtenir des données reproductibles. Exécutez un contrôle où ligand est titré dans le buffer dans la cellule de l'échantillon pour déterminer la chaleur de dilution pour le ligand. Pour certains systèmes où il est coopératif contraignante, des informations supplémentaires sur le processus de liaison peut être acquise par l'injection de la macromolécule dans le ligand. Les orientations d'injection différents peuvent donner des informations supplémentaires, qui peuvent être utiles pour le montage global. 6 </li></ol> 3. Analyse des données <ol><li> Montage des données peut être facilement réalisée en utilisant des macros dans un programme des données d'appareillage (généralement fourni par le fabricant avec l'instrument). Chargez le fichier de données d'abord. Vérifiez la thermogramme premières pour tous les signes de bulles d'air ou d'autres artefacts dans le signal. S'il ya des artefacts (tels que des pointes dans la ligne de base ou des pics quand il n'y avait pas d'injection à ce point dans le temps), puis notez ces points de données tels qu'ils devraient être supprimés. Ensuite, charger les données de dilution ligand de contrôle, et de soustraire les données de dilution ligand de l'isotherme de liaison. À ce moment, supprimer tous les points de données fausses, y compris le ou les deux premiers points de données de titrage où des artefacts de dilution se produire (voir l'étape 7). </li><li> Sélectionnez le modèle de données de montage (un site de liaison, deux / plusieurs sites de liaison, liaison coopérative, etc) pour être utilisé pour ajuster les données. Les données peuvent être adaptés aux estimations initiales des paramètres d'ajustement, stœchiométrie (n), enthalpie (AH) et l'affinité de liaison (Ka). Si la connaissance préalable de l'affinité de liaison, ou d'autres paramètres, est connu à partir d'expériences orthogonaux, alors ces valeurs peuvent être saisies. Cela permet d'éviter l'ajustement devient piégé dans des minima locaux lors du montage. Une fois les données ont été adapté pour le premier titrage, répétez les étapes 15 et 16 pour le reste des isothermes. Alternativement, les données peuvent être adaptés au niveau mondial en utilisant des programmes tels que SEDPHAT. SEDPHAT 6 peut être particulièrement utile dans le montage global de binaires ensembles de données complexes (molécules à savoir A + B) en combinaison avec des ensembles de données complexes ternaires (molécules A + B + C). Par exemple, dans la liaison de C molécule à un complexe d'AB, il n'est pas toujours clair s'il pouvait y avoir aucun signal due à la liaison de C à A ou de B à A (si A n'est pas complètement saturée). </li><li> Afin de s'assurer que les données ne sont pas artéfactuelle CCI, l'affinité de liaison et de stoechiométries obtenus à partir de l'ITC devraient être comparés à une méthode orthogonale 7,8. En outre, la valeur d'enthalpie CCI peut être comparé à l'enthalpie d'une parcelle de Van't Hoff. 9 Il peut également s'avérer utile d'utiliser différentes concentrations du ligand ou macromolécule comme la valeur absolue du signal de la chaleur devrait augmenter avec la concentration croissante macromolécule. Les artefacts sont plus susceptibles de survenir si les tampons dans la cellule et la seringue ne sont pas appariés. Une autre possibilité pour les artefacts se pose à partir d'échantillons impurs. </li><li> Nous recommandons que l'utilisateur de commencer avec de simples binaires titrages complexes pour lesquels il ya des informations précédentes disponibles sur K d et stoichiometry. Ensuite, si les ligands se lient supplémentaires, l'utilisateur peut essayer plus compliqué titrages complexe ternaire, en variant les concentrations de ligand, et peut-être passer la seringue et les composants cellulaires. Une comparaison des enthalpies pour les deux chemins à la formation de complexes ternaires devrait être additif comme enthalpie est une fonction d'état. 10 Encore une fois, SEDPHAT 6 est susceptible d'être très utile ici. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2796/2796fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Un exemple représentatif d'un titrage bien comportés pour la liaison du cofacteur NADPH à E. coli chromosomiques dihydrofolate réductase (ecDHFR). Panneau (A) représente le thermogramme premières; (B), l'isotherme de liaison de l'ajustement thermogramme intégrés en utilisant le modèle d'un site dans le logiciel Origin, et (C) l'ajustement de l'isotherme en utilisant le modèle d'un site de liaison le long SEDPHAT avec résidus ajustement. À partir du logiciel d'origine, en utilisant le modèle à un site de liaison, n = 1,09 ± 0,02, K d = 0,194 ± 0,001 uM, AH = -22,7 ± 0,4 kcal / mol, TΔS = -13,1 ± 0,4 kcal / mol, et Ag = - 9,16 ± 0,01 kcal / mol. S'adapte sur les données en utilisant Sedphat s'offrir un n de 0,94 ± 0,01, un Kd de 0,195 ± 0,013 Am, un AH de -22,5 ± 0,2 kcal / mol, TΔS de -13,39 kcal / mol et d'Ag -9,15 kcal / mol.

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<li>Baker, B. M., Murphy, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+linked+protonation+effects+in+protein+binding+reactions+using+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry.</a> Biophys. J. 71, 2049-2055 (1996).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

CCI a été largement utilisé dans l&#39;étude des interactions ligand macromolécule, 11 avec des études portant sur ​​la protéine-ligand, ADN-ligand 12 13 et de l&#39;ARN-macromolécule 14 études. CCI peut même être utilisée avec des matériaux solides, comme les nanoparticules, qui forment des suspensions uniforme. 15 De plus, les systèmes ternaires, où un ligand est déjà lié à la macromolécule et un second ligand est titré, peut être utilisée pour déterminer la thermodynamique, par Par exemple, la liaison du substrat à un système enzymatique cofacteur. 7 Les études peuvent aussi être effectués pour des molécules à très haute affinité de liaison qui serait normalement pas dépasser la limite de détection de l&#39;ITC en effectuant des dosages de liaison par compétition avec les plus faibles ligands contraignant. 16 Renseignements sur les faiblement contraignante ligands peuvent également être obtenues par des essais de compétition. 17 Le rôle de l&#39;eau dans la liaison peut être exploré par le CCI, 18 ainsi que la dépendance de l&#39;enthalpie sur la réorganisation du solvant. 19 Récemment, la thermodynamique des changements de conformation des variantes DNAK ont été mesurés lors de la liaison des ADP et l&#39;ATP. 20 protéine-protéine d&#39;association peut être étudiée par le CCI, ce qui donne des informations sur des complexes hétéro 21 ainsi que sur l&#39;homo-association. 22 effets de la température sur l&#39;enthalpie contraignante donnera la capacité thermique de l&#39;événement de liaison. 2 Le nombre de protons absorbée ou libérée lors de la liaison peut également être déterminée à partir d&#39;expériences réalisées dans des tampons avec des enthalpies d&#39;ionisation différents. 5 Si des études supplémentaires sont CCI fait à différentes valeurs de pH, le pKa du groupe impliqué peut potentiellement être déterminée. 23 Pour résumer, des mesures précises de la concentration de la macromolécule et le ligand est impératif pour une expérience de l&#39;ITC bon. Concentrations dans l&#39;échantillon ont également besoin d&#39;être dans une fourchette appropriée pour obtenir des données fiables. Des précautions doivent être prises avec le tampon sous forme d&#39;impuretés à petites molécules et l&#39;inadéquation du pH se traduit artefacts dans le thermogramme.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> 1,7 ml microtubes </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-282 </td></tr><tr><td> 15 ml tubes Falcon </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 à 959-49B </td></tr><tr><td> 2,5 ml seringue Hamilton </td><td> MicroCal </td><td> SYN161714 </td></tr></tbody></table>

calorimétrie titration isotherme pour mesure macromolécules-ligand d&#39;affinité

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Calorimétrie de titrage isotherme (ITC) est un outil utile pour la compréhension de l&#39;image complète d&#39;un thermodynamiques réaction de liaison. Dans les sciences biologiques, les interactions macromoléculaires sont essentielles dans la compréhension de la machinerie de la cellule. Les conditions expérimentales, tel que le tampon et la température, peuvent être adaptés au système de liaison particulière à l&#39;étude. Cependant, une planification minutieuse est nécessaire car certains ligands et des plages de concentration macromolécule sont nécessaires pour obtenir des données utiles. Les concentrations de la macromolécule et le ligand besoin d&#39;être déterminée avec précision pour des résultats fiables. Un soin particulier doit également être prises lors de la préparation des échantillons sous forme d&#39;impuretés peuvent influer considérablement sur l&#39;expérience. Lorsque expériences CCI, avec les contrôles, sont effectuées correctement, les informations utiles contraignants, tels que la stoechiométrie, l&#39;affinité et l&#39;enthalpie, sont obtenus. En effectuant des expériences supplémentaires en vertu de tampon ou de conditions différentes de température, des informations plus détaillées peuvent être obtenues sur le système. Un protocole pour la configuration de base d&#39;une expérience ITC est donné.

Un protocole général pour l&#39;utilisation de la calorimétrie de titration isotherme pour surveiller la thermodynamique contraignante pour les systèmes biologiques avec les modérés affinités de liaison est présenté.

Calorimétrie titration isotherme pour Mesure macromolécules-ligand d&#39;affinité

La calorimétrie d'isotherme de titration (ITC) est un outil utile pour appréhender l'ensemble du profil thermodynamique d'une réaction de liaison. Dans le domaine biologique...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer une méthode générale permettant d'étudier la liaison entre un ligand et une macromolécule à l'aide de la calorimétrie de titration isotherme, ou ITC. Cela est réalisé en préparant tout d'abord des solutions de ligand et de macromolécule exemptes d'impuretés et appariées en ce qui concerne la composition du tampon et le pH. Les concentrations finales des solutions de ligand et de macromolécule sont ensuite déterminées.Les paramètres expérimentaux suivants de la CII sont ensuite définis, suivis de la collecte des données. La dernière étape de la procédure consiste à analyser et ajuster les données. Enfin, les résultats illustrant les interactions entre le ligand et la macromolécule sont obtenus par analyse graphique des données de titrage afin de déterminer les paramètres de liaison et les paramètres thermodynamiques.L'avantage principal de cette technique de liaison par rapport aux méthodes existantes, telles que les titrations par absorption et par fluorescence, est que l'enthalpie et donc l'entropie de liaison peuvent être déterminées dans le cadre d'une même expérience. La préparation de l'échantillon commence par la détermination des concentrations appropriées pour le macromolécule et le ligand. Une étape cruciale pour obtenir des ajustements précis en ITC consiste à prendre en compte les informations fournies dans la procédure écrite lors du calcul de ces concentrations.Dans cette démonstration, on étudie la liaison du cofacteur NADPH à l'enzyme dihydrofolate réductase chromosomique d'Escherichia coli. Tout d'abord, reconstituez la macromolécule lyophilisée dans un tampon à la concentration souhaitée, puis dissolvez le ligand dans le volume nécessaire de tampon. Ensuite, vérifiez que les valeurs de pH des échantillons de macromolécule et de ligand se situent à ± 0,05 unité de pH près de celle du tampon et l'une par rapport à l'autre. Centrifugez ensuite les solutions de dihydrofolate réductase chromosomique et de NADPH dans des tubes de microcentrifugeuse pendant cinq minutes.À 8 000 à 14 000 tr/min, cela formera un culot avec toutes les particules présentes dans la solution, lesquelles peuvent provoquer des artefacts dans la ligne de base du thermogramme ITC. Après la centrifugation, vérifiez attentivement les concentrations des solutions de macromolécule et de ligand par spectroscopie UV-visible et notez leurs concentrations exactes.Ensuite, préparer le volume approprié de chaque solution pour ITC en diluant les solutions mères préparées du macromolécule et du ligand jusqu'aux concentrations expérimentales nécessaires. Enfin, débarrasser les échantillons des gaz dissous afin d'éviter les artefacts de signal dus aux bulles d'air ou au dégazage pendant la titration, avant de charger le macromolécule et le ligand dans l'ITC. Nettoyer la cellule d'échantillonnage et la seringue d'injection conformément au protocole du fabricant.Ensuite, rincez la cellule d'échantillon deux ou trois fois avec 1,8 millilitre d'eau distillée à l'aide d'une seringue Hamilton. Manipulez la seringue avec précaution, car la pointe longue se courbe facilement. Puis, rincez la cellule d'échantillon plusieurs fois avec le même volume de tampon.Une fois que la cellule d'échantillon est propre, introduisez 1,8 millilitre de la solution de macromolécule dans la cellule. Veillez à éviter la formation de bulles ; arrêtez l'ajout d'échantillon au moment où la solution apparaît à l'extrémité du tube de la cellule. Éliminez toute bulle d'air à l'aide de la seringue Hamilton en déplaçant doucement l'aiguille de haut en bas le long des parois de la cellule afin de faire disparaître les bulles éventuellement présentes.Retirez la seringue et éliminez tout excès de volume du puits situé en haut de la cellule. Ensuite, remplissez la cellule de référence avec de l'eau distillée. Puis, fixez une seringue en plastique au port de remplissage de la seringue d'injection à l'aide d'un tube.Ouvrez le port de remplissage sur la console du VP Viewer 2000. Rincez la seringue d'injection avec de l'eau distillée, puis rincez-la avec un tampon. Assurez-vous que la seringue d'injection est complètement vidée en faisant passer de l'air à travers le système.Placer l'aiguille de la seringue d'injection dans la solution de ligand et aspirer la solution dans la seringue jusqu'à ce qu'elle soit complètement pleine. Continuer à aspirer un léger excès de volume dans le port et détacher le tube immédiatement après la fermeture du port de remplissage. Détacher le tube ainsi que la seringue en plastique, puis purger et recharger deux fois la seringue d'injection afin d'éliminer toutes les bulles présentes dans la seringue.Retirez la seringue d'injection de la solution de ligand et essuyez toute goutte sur le côté avec un chiffon chimique. Veillez à ne pas toucher l'extrémité de la seringue avec le chiffon ni à heurter la seringue, car cela pourrait entraîner une perte de volume.Configurez les paramètres pour l'exécution de la CII à l'aide du programme V VP Viewer 2000 fourni par Micro Cal pour les systèmes de liaison. Lorsque les signaux thermiques sont intenses, comme dans le système chromosomique de la DIHYDROFOLATE réductase avec le N-A-D-P-H, un grand nombre d'injections de faible volume fournira davantage de points de données pour l'ajustement. En revanche, pour les systèmes présentant des signaux thermiques faibles, il est préférable d'utiliser un petit nombre d'injections de grand volume.Pour les une ou deux premières injections, réglez le volume d'injection à deux microlitres. Ces injections seront finalement écartées car elles pourraient produire des résultats erronés en raison du mélange entre les solutions de ligand et de macromolécule. Lors de la saisie du délai entre les injections, prévoyez plusieurs minutes afin de permettre au système d'atteindre l'équilibre et au signal thermique de revenir à la ligne de base.Ensuite, choisissez la température de l'expérience et saisissez la vitesse d'agitation de la seringue nécessaire pour un mélange adéquat du ligand et de la macromolécule pendant la titration, après avoir configuré les paramètres expérimentaux, puis lancez l'expérience. Une fois l'expérience terminée, le signal calorimétrique final devrait être proche de la saturation. Nettoyez le ITC conformément au protocole du fabricant et répétez les titrations au moins une ou deux fois supplémentaires afin d'obtenir des données reproductibles.Enfin, effectuez une expérience témoin dans laquelle le ligand est titré dans le tampon contenu dans la cellule d'échantillon afin de déterminer la chaleur de dilution du ligand. L'ajustement des données peut être facilement réalisé à l'aide de macros dans n'importe quel programme d'ajustement de données. Origin version 7, fourni par Micro Cal, est utilisé ici pour illustrer l'ajustement des données. Commencez par charger le premier fichier de données.Vérifiez le thermogramme brut à la recherche de signes de bulles d'air ou d'autres artefacts dans le signal, notamment en cas de pics sur la ligne de base ou de pics en l'absence de point d'injection. Notez ces points de données, car ils doivent être supprimés. Ensuite, chargez les données du contrôle de dilution du ligand et soustrayez-les de l'isotherme de liaison à ce stade.Supprimez tous les points de données parasites, notamment les premiers points de la titration où se produisent généralement des artefacts de dilution. Ensuite, sélectionnez le modèle d'ajustement des données. Une fois le modèle choisi, les données peuvent être ajustées en saisissant manuellement des valeurs initiales estimées pour les paramètres d'ajustement, notamment la stœchiométrie, l'enthalpie et l'affinité de liaison.Cependant, si des connaissances préalables concernant certains paramètres sont disponibles à partir d'expériences orthogonales, ces valeurs doivent être saisies car elles permettront d'éviter que les données ne restent piégées dans un minimum local lors de l'ajustement. Une fois que les données de la première titration ont été ajustées, répétez les étapes d'analyse pour le reste des isothermes. Alternativement, les données peuvent être ajustées globalement à l'aide d'un programme tel que said fat ; pour commencer un ajustement global, enregistrez les données dans Origin sous forme de fichier dot dat.Ensuite, importez les données dans ledit gras. Choisissez un modèle d'ajustement et ajustez globalement les données en basculant alternativement entre les options d'ajustement simplex et Mark HAR Leven jusqu'à ce que la valeur globale du khi-deux atteigne un minimum. La procédure représentative de CII démontrée dans cette vidéo surveille la liaison du N-A-D-P-H à la dihydrofolate réductase chromosomique d'e coli.La liaison exothermique du NADPH à la dihydrofolate réductase est évidente sur le thermogramme brut, car de la chaleur est libérée. La diminution des signaux thermiques après chaque injection successive indique une saturation de la liaison, qui se produit durant la première moitié du titrage. La pureté des composants et la bonne correspondance des tampons sont confirmées par la portion saturée du graphique, où les signaux thermiques résiduels sont minimes et proviennent uniquement de la chaleur de dilution du ligand.Les données ont été ajustées à un modèle à site unique à l'aide du logiciel Origin afin de révéler l'isotherme de liaison. Deux jeux de données ont ensuite été ajustés à un modèle à site unique à l'aide de ce même logiciel. Les faibles valeurs et le motif aléatoire des résidus indiquent que les paramètres thermodynamiques sont raisonnables. Ces paramètres sont également validés par comparaison avec des valeurs de la littérature obtenues par des méthodes orthogonales.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment étudier la liaison de macro molécules aux ligands à l’aide d’une ITC VP de MicroCal, en préparant correctement les solutions, en configurant les paramètres expérimentaux et en analysant les données.

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Calorimétrie titration isotherme pour Mesure macromolécules-ligand d'affinité

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