Name: Immuno-fluorescence Dosage des leptospires exposées à la surface Protéines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Découvrez une méthode d'immunofluorescence pour évaluer l'exposition des protéines de surface des leptospires tout en préservant l'intégrité de la membrane externe fragile. Cette technique permet d'identifier les facteurs de virulence avec des contrôles négatifs rigoureux.

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Cette étude a été soutenue par Public Health Service subventions AI-34431 (pour DAH) de l&#39;Institut national des allergies et des maladies infectieuses et par VA Fonds de recherche médicale (à la DAH).

1. Fixation des lames de verre Leptospira <ol><li> Leptospira interrogans est une classe BSL2 pathogène. Travailler avec des cellules vivantes elle nécessite la manipulation appropriées, telles que porter des gants, sarrau et les étapes de pipetage dans une hotte stérile. </li><li> Cultivez Leptospira dans EMJH medium11, supplémentés avec du sérum de lapin 1% à 30 ° C jusqu'à ce qu'ils atteignent la mi-à fin phase logarithmique (densité de 5 x 10 7 à 5 x 10 8 cellules / ml) pendant environ 6 jours. </li><li> Récolte de la culture par centrifugation à 2000 xg ~ pendant 7 min à température ambiante. </li><li> Retirer le surnageant par aspiration et doucement resuspendre le culot dans un tampon phosphate salin (PBS) -5 mM MgCl 2, pH 7,2 à une concentration finale de 5 x 10 8 cellules / ml. </li><li> Ajouter 1 ml de suspension cellulaire dans chaque puits de deux lames de verre et de chambre et incuber à 30 ° C pendant 80 min pour permettre aux cellules d'adhérer. </li><li> Retirer délicatement le liquide contenant des cellules non liée par aspiration. </li><li> Fix restantes bactéries intactes des lames de verre en ajoutant 1 ml / puits de paraformaldéhyde à 2% dans du PBS-5 MgCl 2 mM. Incuber pendant 40 min à 30 ° C. Ces lames seront d'évaluation des exposés en surface des protéines. </li><li> Pour évaluer les lames de contrôle de sub-surface des protéines, perméabiliser la membrane externe, en fixant à 1 ml / puits de 100% du méthanol glacé. Incuber à -20 ° C pendant 20 min. Le méthanol agit de plusieurs façons: il perméabilise la membrane externe, denaturates les protéines et les cellules des correctifs pour des lames de verre. </li><li> Retirez la fixation des agents par aspiration. </li></ol> 2. Le marquage avec des anticorps spécifiques <ol><li> Bloc liaison non spécifique en ajoutant 1 ml / puits de tampon de blocage (Difco Leptospira enrichissement EMJH). Incuber à 30 ° C pendant 90 min. </li><li> Diluer l'anticorps spécifique (lapin immunsérums ou d'anticorps monoclonaux de souris, sérums de lapin ici polyclonaux spécifiques pour OmpL54 10, FlaA1 12, et OmpL1 13) et pré-immuns sérums de lapins fluides ascétiques ou la souris ne contenant pas d'anticorps (lorsque utilisé comme contrôle négatif) dans tampon de blocage. Les dilutions pour chaque anticorps doivent être déterminées empiriquement en fonction de titrage d'anticorps, antigène-anticorps de réactivité et de l'abondance de la protéine dans la cellule. La gamme habituelle est de 1:50 à 1:600. </li><li> Retirez le tampon de blocage par aspiration et ajouter 1 ml / puits d'anticorps primaires dilués. </li><li> Incuber à 30 ° C pendant 1h. </li><li> Retirer le liquide par aspiration et laver les puits trois fois avec du PBS (1 ml / puits). </li></ol> 3. Visualisation des leptospires <ol><li> Ajouter 1 ml / puits d'Alexa Fluor 488 anticorps secondaires marqués (soit de chèvre anti-IgG de lapin ou de chèvre anti-IgG de souris) dilué 1:2000 et fluorescentes acide nucléique tache, 4'6-diamidino-2-phényl-indole dichlorhydrate ( DAPI) dilué à une concentration finale de 0,25 ug / ml dans le tampon de blocage. Cette étape assure la détection de liaison à l'anticorps et la présence de tous les spirochètes indépendant de fixation des anticorps, respectivement. </li><li> Incuber les lames à 30 ° C pendant 45 min. </li><li> Retirer le liquide par aspiration et laver les puits deux fois avec du PBS et une fois avec de l'eau distillée (1 ml / puits). </li><li> Retirez les chambres et la bande adhésive de la lame de verre et d'air sec pendant environ 10 min. </li><li> Ajouter Prolongez Or anti-fade milieu de montage (2 x 20 pi par diapositive) et un 24 x 50 mm lamelle. </li><li> Incuber une nuit à température ambiante dans l'obscurité. Cette étape est nécessaire pour permettre le support de montage pour guérir (durcir). </li><li> Sceau de la lamelle avec du vernis à ongles. </li><li> Visualisez la coloration par microscopie à fluorescence en utilisant une détection cyan / bleu filtre pour DAPI et un filtre de détection vert pour Alexa Fluor 488. Afin de s'assurer que une représentation exacte des échantillons est faite, assurez-vous d'évaluer la zone de la chambre entière pour chaque échantillon. </li><li> Enregistrer les données d'imagerie par un champ représentatif pour chaque échantillon. Quand l'imagerie de fluorescence Alexa Fluor 488, utilisez le même temps d'exposition pour tous les échantillons. L'utilisation d'un temps d'exposition cohérente permettra une comparaison plus précise des résultats avec des antigènes de test par rapport aux témoins. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Exemples de résultats avec des cellules de surface IFA Leptospira interrogans utilisant des anticorps contre la surface et de sub-surface des protéines sont présentées dans la figure 2. Un test est considéré positif lorsque la fluorescence importante est détectée dans les échantillons avec des leptospires intact pour une protéine d'intérêt qui est la surface exposée (figure 2A). Habituellement, lors d'un test positif (ici, la surface exposée OmpL54), environ la même intensité de fluorescence est observée dans des cellules intactes et deux perméabilisées (figure 2A) Il est essentiel d'inclure un contrôle négatif pour l'intégrité des membranes externe utilisant des anticorps contre un sous-sol , de préférence périplasmique des protéines (par exemple leptospires FlaA1, fig. 2B). Ce n'est que lorsque les données montrent que la membrane externe est restée intacte During de l'expérience, à savoir des anticorps contre une protéine de sub-surface ne réagissent pas à des cellules intactes (pas de fluorescence ou fluorescence beaucoup plus faible lorsque comparé à l'échantillon perméabilisées comme dans la Fig. 2B), peut-on conclure que la protéine (s) d'intérêt est surface exposée. L'inclusion d'expériences avec des sérums pré-immuns (dans le cas d'anticorps polyclonaux) comme un contrôle négatif supplémentaire est indispensable pour les données non ambiguë et ne doit pas céder à fluorescence substantiels dans des cellules intactes ou perméabilisées (Fig. 2A, 2C). Tache DAPI est nécessaire pour visualiser les leptospires lorsque les résultats négatifs (pas de fluorescence Alexa Fluor 488) sont observés. Contre-coloration à l'iodure de propidium est une alternative acceptable à DAPI. Cette méthode est qualitative plutôt que quantitative que brillante fluorescence peut être dû à la surface exposée de multiples épitopes antigéniques être reconnue dans un seul antigène par rapport à d'autres antigènes de l'abondance égale, mais avec moins d'épitopes de surface exposée. Par conséquent, les intensités de fluorescence ne peut être utilisé pour comparer la réactivité des anticorps mêmes, telles que des cellules intactes par rapport perméabilisées et des intensités de fluorescence entre pas de protéines différentes. Cette distinction est importante quand un résultat ambigu, où la fluorescence est obtenue significativement moins est observé dans des cellules intactes que dans les cellules perméabilisées (figure 2C). Un tel résultat indique soit que la protéine est dans un endroit du sous-sol (avec une certaine coloration de fond non spécifique des cellules intactes), les anticorps sont obligatoires préférentiellement aux non-autochtones épitopes qui sont exposés après perméabilisation méthanol ou d'une protéine peut avoir plusieurs sites de localisation comme décrit pour les protéines Erp et Elp d'un autre spirochète, Borrelia burgdorferi 14. Dans les deux cas, un résultat ambigu IFA comme celui-ci nécessite des approches alternatives telles que la biotinylation de surface ou la protéolyse de surface pour déterminer si la protéine d'intérêt est exposées à la surface ou non 10. <img src="/files/ftp_upload/2805/2805fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Organigramme Figure 1. Pour la surface de dosage immuno-fluorescence des spirochètes Leptospira interrogans. Tout d'abord, 1 ml de suspension cellulaire sont ajoutés à chaque puits de diapositives chambre de deux puits (au moins deux lames pour chaque expérience) et incubées pendant les leptospires se conformer. Ensuite, les leptospires sont fixés sur des lames de chambre en ajoutant 1 ml / puits de 2% de paraformaldéhyde (PFA) pour les échantillons avec la membrane externe intacte (OM) et 1 ml / puits de 100% de méthanol à froid pour les échantillons avec perméabilisées OM. Ensuite, les leptospires sont incubées avec des anticorps reconnaissant exposées à la surface des protéines avec des anticorps de contrôle pour les protéines de subsurface (primaire Ab) à 30 ° C pendant 90 min. Ensuite, les anticorps primaires sont détectés par incubation avec 1 ml / puits d'Alexa Fluor 488 anticorps secondaires conjugués. Enfin, les cellules sont visualisées par microscopie à fluorescence. <img src="/files/ftp_upload/2805/2805fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Analyse de surface Figure 2. Immunofluorescence de protéines de leptospires. Leptospira interrogans spirochètes ont été sondés avec des immunsérums et de pré-immun, et les résultats négatifs ont été jumelés avec une contre-coloration DAPI pour démontrer la présence de spirochètes. Un filtre à fluorescence verte a été utilisée pour détecter Alexa Fluor 488 anticorps secondaire marqué se liant à la surface des protéines exposées et bleu / cyan filtre pour détecter la fluorescence se liant à l'ADN des cellules DAPI. A) Les leptospires sondés avec des anticorps reconnaissant une protéine de surface exposée, OmpL54 10. B) les cellules sondés avec des anticorps contre une protéine périplasmique de subsurface, FlaA1 (contrôle négatif). C) Les cellules sondés avec des anticorps contre la leptospirose porine, OmpL1. La liaison du sérum de lapin aux leptospires ont été détectés avec Alexa Fluor 488 fragments conjugués IgG de chèvre anti-lapin. Toutes les images sont prises après 4 sec longue exposition.

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<li>Parveen, N., Leong, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+candidate+glycosaminoglycan-binding+adhesin+of+the+Lyme+disease+spirochete+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi.</a> Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).</li>
<li>Ristow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OmpA-like+protein+Loa22+is+essential+for+leptospiral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence.</a> PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).</li>
</ol>

Notre surface IFA technique est similaire à celui utilisé pour démontrer l&#39;exposition de surface de différentes borrelial 15, 16 et 12 de leptospires, 17 protéines. Les détails de la méthode de la surface IFA décrits ici sont conçus pour minimiser la manipulation de cellules dans un effort pour maintenir l&#39;intégrité de la membrane externe, tout en profitant de la tendance des cellules Leptospira d&#39;adhérer à des lames de verre. La méthode consiste à une concentration plus faib...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Deux lames de verre et de chambre </td><td> Lab-Tek </td><td> 177380 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de lapin </td><td> Immunochemicals Rockland </td><td> D209-00-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Leptospira enrichissement EMJH </td><td> BD Difco </td><td> 279510 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin IgG (H + L) </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> A-11034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG (H + L) </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> A-11029 </td><td></td></tr><tr><td> 4&#39;6-diamidino-2-phényl-indole dichlorhydrate (DAPI) </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Prolonger d&#39;or anti-fade milieu de montage </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> P36930 </td><td> S&#39;équilibrer à température ambiante avant utilisation </td></tr><tr><td> Fisherfinest verre Couvercle premium </td><td> Fisher </td><td> 12-544-14 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à fluorescence </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 40 </td><td></td></tr></tbody></table>

immuno-fluorescence dosage des leptospires exposées à la surface protéines

Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins

Protéines de surface bactériennes sont impliqués dans le contact direct avec les cellules hôtes et de l&#39;absorption des nutriments provenant de l&#39;environnement 1. Pour cette raison, la localisation cellulaire peut fournir des indications sur le rôle fonctionnel des protéines bactériennes. Localisation à la surface des protéines bactériennes est une étape clé vers l&#39;identification des facteurs de virulence impliqués dans les mécanismes de pathogénicité. Méthodes de fractionnement de leptospires 2-5 membranes peuvent être sélectif pour une certaine classe de protéines de la membrane externe (OMP), telles que les lipoprotéines vs OMP transmembranaire, et donc conduire à une classification erronée. C&#39;est probablement ce qui est dû à des différences structurelles et comment elles sont associées à la membrane externe. Les lipoprotéines sont associés aux membranes par une interaction hydrophobe entre le fragment N-terminal de lipides (trois acides gras) et les phospholipides bicouche lipidique 6, 7. En revanche, les OMP transmembranaires sont généralement intégrés dans la bicouche lipidique par amphipathiques β-feuilles disposées dans une structure en tonneau, comme 8, 9. En outre, la présence d&#39;une protéine dans la membrane externe, ne garantit pas nécessairement que la protéine ou ses domaines sont exposés à la surface. Spirochetal membranes externes sont connus pour être des méthodes fragile et nécessite donc impliquant une manipulation douce des cellules et l&#39;inclusion de sous-surface de la protéine de contrôle pour évaluer l&#39;intégrité de la membrane externe. Ici, nous présentons une technique d&#39;immunofluorescence (IFA) méthode pour évaluer directement l&#39;exposition sur la surface des protéines intactes leptospires. Cette méthode est basée sur la reconnaissance des protéines de surface de leptospires par l&#39;antigène-anticorps spécifiques. Ici, des anticorps spécifiques pour OmpL54 10 sont detetcted aftero se liant à des épitopes natifs de surface, exposée. Comparaison de la réactivité des anticorps aux cellules intactes par rapport perméabilisées permet d&#39;évaluer la distribution cellulaire et si oui ou non une protéine est sélectivement présents sur la surface de leptospires. L&#39;intégrité de la membrane externe devrait être évaluée à l&#39;aide d&#39;anticorps à un ou plusieurs protéines de subsurface, situé de préférence dans le périplasme. La méthode de la surface IFA peut être utilisé pour analyser l&#39;exposition en surface d&#39;une protéine de leptospires à laquelle les anticorps spécifiques sont disponibles. Tant l&#39;utilité et la limitation de la méthode dépend de savoir si les anticorps utilisés sont capables de se lier à des épitopes natifs. Puisque les anticorps sont souvent soulevés contre les protéines recombinantes, les épitopes des indigènes, exposées à la surface des protéines peuvent ne pas être reconnu. Néanmoins, la méthode de la surface IFA est un outil précieux pour l&#39;étude des composantes de la surface intacte bactérienne. Cette méthode peut être appliquée non seulement pour les leptospires, mais aussi d&#39;autres spirochètes et les bactéries gram-négatives. Pour plus fortes conclusions concernant surface d&#39;exposition de OMP, une approche globale impliquant plusieurs méthodes de localisation cellulaire est recommandé 10.

Une méthode efficace pour évaluer l&#39;exposition en surface des protéines de leptospires est décrite. La méthode est spécifiquement conçue pour éviter toute perturbation de la membrane externe des cellules fragiles de leptospires. Cette technique nécessite l&#39;emploi de plusieurs contrôles négatifs pour évaluer l&#39;intégrité de la membrane externe et la spécificité de la réaction d&#39;anticorps.

Immuno-fluorescence Dosage des leptospires exposées à la surface Protéines

Les protéines de surface bactériennes participent au contact direct avec les cellules hôtes et à l'absorption des nutriments provenant de l'environnement 1. Pour cette raison, cellular...

Les protéines bactériennes de surface entrent en contact direct avec les cellules hôtes et participent également à l'absorption des nutriments présents dans l'environnement. Par conséquent, la localisation à la surface des protéines bactériennes constitue une étape clé pour l'identification des facteurs de virulence. Une méthode permettant d'évaluer l'exposition à la surface des protéines sur des leptospires intacts est ici présentée, en comparaison avec les dosages d'immunofluorescence décrits précédemment.Les détails de la méthode décrite ici sont conçus pour minimiser la manipulation des cellules afin de préserver l'intégrité de la membrane externe. Tout d'abord, une suspension de leptospires est ajoutée à des lamelles en verre. Les lamelles sont incubées pour permettre aux cellules de s'adhérer ; les leptospires adhérents sont ensuite fixés avec du paraformaldéhyde à 2 % afin de conserver une membrane externe intacte pour l'évaluation des protéines de surface, ou avec du méthanol à 100 % pour permeabiliser la membrane externe et révéler les protéines sous-jacentes.Les spirochètes fixés sont ensuite marqués par des anticorps spécifiques et visualisés à l'aide d'anticorps secondaires fluorescents. Les protéines localisées à la surface peuvent être marquées et observées dans des cellules intactes et perméabilisées, tandis que les protéines sous-surfaciques ne peuvent être observées que dans des cellules perméabilisées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pathogénie microbienne, comme de savoir si une protéine est localisée à la surface bactérienne, où elle pourrait jouer un rôle dans les interactions hôte-pathogène.La méthode présentée ici est conçue pour minimiser la manipulation des cellules, ce qui devrait aider à préserver l'intégrité de la membrane. Cette méthode implique une concentration plus faible d'agent de fixation, un lavage avec un tampon stabilisant la membrane, ainsi qu'un nombre réduit d'étapes de lavage par rapport aux dosages précédemment décrits. De plus, notre méthode d'immunofluorescence de surface souligne l'importance des contrôles positifs et négatifs, essentiels à une interprétation précise des données.Le Dr Maria Pinney, postdoctorante dans mon laboratoire, démontrera la procédure. Leptospira interrogans est un agent pathogène de niveau de sécurité biologique 2. Le travail avec des cellules vivantes exige une manipulation et des précautions appropriées.Un tablier de laboratoire et des gants doivent être portés en tout temps. Toutes les opérations de pipetage ou de manipulation de récipients ouverts contenant des cellules vivantes doivent être effectuées dans un flux laminaire. Cultiver la bactérie *Leptospira* dans un milieu EMJH supplémenté avec 1 % de sérum de lapin à 30 degrés Celsius, lorsque les bactéries ont atteint la phase exponentielle moyenne à tardive.Environ six jours plus tard, récoltez la culture par centrifugation à 2000 fois G pendant sept minutes à température ambiante après la rotation. Éliminez le surnageant par aspiration et resuspendez délicatement le culot dans du PBS contenant du chlorure de magnésium à cinq millimolaire jusqu'à une concentration finale de cinq fois 10 à la huitième cellules par millilitre. Ensuite, ajoutez près de chaque puits de lames en verre à deux puits.Ajoutez un millilitre de la suspension cellulaire ici. Une lame de test et une lame témoin sont préparées pour chaque dosage de protéine de surface, la deuxième puits étant utilisée pour les témoins comme indiqué ici ; incubez à 30 degrés Celsius pour permettre aux cellules d'adhérer. Après 80 minutes, aspirez délicatement le liquide pour éliminer les cellules non liées des lames de test, qui seront utilisées pour évaluer les protéines exposées à la surface.Ajoutez un millilitre par puits de paraformaldéhyde à 2 % dans du PBS contenant du chlorure de magnésium à cinq millimolaire pour fixer les bactéries restantes intactes sur le verre. Incubez pendant 40 minutes à 30 degrés Celsius les lames témoins, qui seront utilisées pour évaluer les protéines sous-surfaciques. Fixez les cellules et perméabilisez la membrane externe en ajoutant un millilitre de méthanol glacé à 100 % dans chaque puits.Le méthanol pénètre la membrane externe, dénature les protéines et fixe les cellules sur le verre. Incuber les lames à moins 20 degrés Celsius pendant 20 minutes. Aspirer les agents de fixation après la fixation.Les cellules ne sont plus viables et n'ont pas besoin d'être manipulées dans une hotte de sécurité biologique. Pour marquer les bactéries avec des anticorps spécifiques, commencez par ajouter un millilitre de tampon de blocage dans chaque puits de toutes les lames afin de bloquer la liaison non spécifique. Incuber à 30 degrés Celsius pendant 90 minutes.Pendant l'incubation, diluez l'anticorps primaire dans le tampon de blocage. Les anticorps utilisés ici sont dirigés contre des protéines de Leptospira interrogans. L'anticorps MPL 54 reconnaît une protéine de membrane externe de 54 kilodaltons exposée à la surface.L'anticorps anti flat A1 reconnaît la sous-unité A de la gellane périplasmique et l'anticorps anti OL1 reconnaît la protéine ponctuelle leptospirale, qui est une protéine de membrane externe. Préparez également des contrôles négatifs en diluant du sérum de lapin pré-immun ou du liquide ascitique de souris ne contenant aucun anticorps dans du tampon de blocage. Après une incubation de 90 minutes, retirez le tampon de blocage par aspiration et ajoutez un millilitre d'anticorps primaires dilués ou de sérum témoin dans chaque puits ; incubez à 30 degrés Celsius pendant une heure.Éliminer le liquide par aspiration et laver les puits trois fois avec du PBS, ajouter un millilitre d'anticorps secondaires marqués par le LOR 4 88 dans chaque puits ainsi que le colorant nucléique fluorescent DPI dilué dans le tampon de blocage. Cette étape permet respectivement la détection de la liaison des anticorps et la mise en évidence de tous les spirochètes indépendamment de la liaison des anticorps. Incuber les lames à 30 degrés Celsius pendant 45 minutes.Éliminer le liquide par aspiration et laver les puits deux fois avec du PBS et une fois avec de l'eau distillée. Retirer les chambres et la bande adhésive des lames de verre. Laisser sécher les lames à l'air pendant environ 10 minutes. Ajouter 20 microlitres de milieu de montage anti-décoloration prolongé gold pour chaque échantillon sur la lame.Ensuite, placez un coverslip de 24 par 50 millimètres et incubez toute la nuit à température ambiante à l'abri de la lumière. Cette étape est nécessaire pour permettre au milieu de montage de polymériser. Le jour suivant.Scellez la lame avec du vernis à ongles. Visualisez la coloration par microscopie à fluorescence en utilisant un filtre de détection cyan ou bleu pour le DPI et un filtre de détection vert pour le LOR 4 88. Pour garantir une représentation fidèle des échantillons, assurez-vous d'évaluer toute la surface de la chambre pour chaque échantillon.Enregistrez les données en imagerie d'un champ représentatif pour chaque échantillon. Lors de l'acquisition de la fluorescence exor 4 88, utilisez le même temps d'exposition pour tous les échantillons. L'utilisation d'un temps d'exposition constant permettra une comparaison plus précise des résultats obtenus avec les antigènes testés par rapport aux contrôles.Veillez à évaluer l'ensemble de la zone de la chambre pour chaque échantillon avant de tirer des conclusions sur la surface. Une analyse par immunofluorescence a été réalisée afin d'évaluer l'exposition à la surface de la MPL 54 chez Leptospira inters. Comme indiqué ici, un signal de fluorescence intense a été détecté.Ce signal était absent dans les cellules incubées avec des sérums pré-immunes, mais restait constant dans les cellules perméabilisées. Si la protéine est à la surface, une intensité de fluorescence importante sera détectée dans les leptaspires intacts. Si la protéine est sous la surface, elle ne sera détectée que dans les cellules perméabilisées, généralement dans un test positif.Une intensité de fluorescence approximativement identique est observée dans les cellules intactes et perméabilisées. Lorsque des cellules non perméabilisées ont été incubées avec la protéine sous-jacente en surface plane, aucune coloration n'a été observée, indiquant que la membrane externe est restée intacte durant l'expérience. Par conséquent, on peut conclure que ML 54 est exposé à la surface lorsque l'intensité de fluorescence observée dans les cellules intactes est significativement inférieure à celle des cellules perméabilisées.Ou bien la protéine se trouve-t-elle dans une localisation sous-membranaire avec une coloration de fond non spécifique sur des cellules intactes, ou bien les anticorps se lient-ils préférentiellement à des épitopes non natifs exposés après perméabilisation au méthanol. Dans les deux cas, un résultat ambigu de ce type nécessite des approches alternatives, telles qu'une biotinylation membranaire ou une protéolyse superficielle, pour déterminer si la protéine est exposée à la surface ou non. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important d'inclure un nombre suffisant de témoins afin de s'assurer que la membrane altérée est restée intacte.Ces contrôles comprennent du méthanol de sérum premium, des cellules perméabilisées et un antisérum dirigé contre les protéines sous-jacentes.

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