Une approche rapide à l'imagerie de fluorescence à haute résolution dans les tranches de cerveau semi-épais

L'objectif général de cette procédure est de visualiser plus facilement les neurones fluorescents dans des tranches cérébrales épaisses. Cela est réalisé en premier lieu en incluant le cerveau dans un porte-échantillon en aérosol. La deuxième étape de la procédure consiste à découper le cerveau en tranches épaisses sur le tomographe compressé.

La troisième étape de la procédure consiste à rendre transparents optiquement les tranches de cerveau dans un gradient de glycérol. La dernière étape de la procédure consiste à monter les tranches de cerveau clarifiées sur des lames pour l'imagerie fluorescente. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant une expression de protéines rapporteuses fluorescentes à haute résolution dans les neurones au sein de tranches de cerveau épaisses, par microscopie épifluorescente ou confocale.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les coupes minces, la microscopie fluorescente en série ou l'imagerie multiphotonique réside dans sa rapidité accrue, sa faible intensité de main-d'œuvre et le fait qu'elle ne nécessite pas de technique de microscopie coûteuse ou sophistiquée. Pour commencer, récupérez le tissu cérébral de souris ayant subi une fixation NC2 par perfusion cardiaque et ayant été post-fixé pendant une à deux heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, préparez une solution d'agarose à 2 % à haute résistance et à bas point de gélification dans du PBS, puis chauffez-la au micro-ondes jusqu'à dissolution complète.

Transférez l'agarosio fondu dans un tube à essai et placez-le dans un bloc chauffant à 40 degrés Celsius afin d'équilibrer la température, pendant que l'agarosio s'équilibre. Collez le tissu cérébral fixé sur le piston de la seringue d'échantillonnage. À l'aide de la colle Sano Aate, immergez le tissu monté dans une solution saturée de saccharose en PBS pour recouvrir la surface du cerveau, puis rétractez le piston dans le corps de la seringue. Pipetez l'agarosio tiède dans le piston, en recouvrant complètement le tissu cérébral tout en veillant à ne pas introduire de bulles d'air.

Enfin, fixez la seringue contenant l'échantillon avec un bloc réfrigérant froid pendant environ une minute. Pour installer les aros, insérez la seringue contenant le tissu cérébral inclus dans le logement comprimé. Alignez précisément le bord de la lame avec la sortie de la seringue, puis remplissez le réservoir tampon avec du PBS.

Faites tourner le micromètre. Avancez l'épaisseur de coupe pour extruder le tissu cérébral inclus hors de la seringue d'échantillon. Pour générer la première coupe, appuyez sur le bouton de démarrage de l'unité de contrôle.

Répétez le processus d’avancement du tissu inclus et appuyez sur le bouton de démarrage pour générer le nombre souhaité de tranches. Ramassez les tranches à l’aide d’une pipette de transfert et transférez-les dans un flacon en verre contenant du PBS. Aspirez la majeure partie du PBS des tranches recueillies et remplacez-le par une solution de 10 % de glycérol dans le PBS. Agitez doucement le flacon à quatre degrés Celsius sur un agitateur rotatif de table jusqu’à ce que les tranches coulent.

Poursuivez le dégagement progressif en répétant le processus de décantation et de remplissage avec des solutions de glycérine à 25, 50, puis 75 %. Pipetez la solution de glycérine à 75 % et remplacez-la par de la glycérine à 90 %. Veillez à ne pas introduire de bulles et équilibrez à quatre degrés Celsius avec un balancement doux.

Maintenant que les sections ont été entièrement clarifiées, elles ne couleront plus, mais présenteront plutôt une flottabilité neutre. Découpez un adhésif double face en forme de rectangle ouvert avec une bordure de deux à trois millimètres, dimensionné pour s'ajuster à la zone observable d'une lame de microscope de 25 sur 75 millimètres à l’aide d’une paire de forceps. Disposez les sections cérébrales à l’intérieur de cette bordure sur la lame.

Abaissez délicatement la lame de couverture sur le ruban adhésif. Veillez à ne pas introduire de bulles d'air et appliquez une pression pour créer un joint étanche ; aspirez tout excès de glycérine, puis scellez les bords de la lame en appliquant un vernis à ongles transparent. Une fois le scellement sec, la préparation peut être conservée dans une boîte à diapositives à quatre degrés Celsius ou être observée au microscope.

Utilisez immédiatement la microscopie en épifluorescence. Le profil d'expression d'un vecteur viral exprimant la GFP améliorée peut être observé sur une coupe coronale de tissu cérébral de souris d'une épaisseur de 200 micromètres. Ici, la zone mise en évidence sur l'image en épifluorescence est présentée en haute résolution au moyen de la microscopie confocale afin de révéler les neurones corticaux individuels de la couche V.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des tranches épaisses de cerveau fixées pour une imagerie fluorescente rapide et à haute résolution.