Evaluation de la fixation des nanoparticules dans les tumeurs en temps réel par imagerie intravitale

L'objectif général de cette procédure est de quantifier l'absorption de nanoparticules par les tumeurs à l'aide d'une imagerie intravitale. Cela est réalisé en désenveloppant et en cultivant d'abord des embryons d'oiseaux. La deuxième étape consiste à établir des tumeurs xénogreffées dans la membrane chorioallantoïque, ou CAM, et à les laisser croître pendant environ une semaine.

La troisième étape de la procédure consiste à injecter par voie intraveineuse des nanoparticules dans le cam et à réaliser une imagerie confocale intravitale en temps réel de la tumeur xénogreffe. La dernière étape de la procédure est l'excision et la sectionnement de la tumeur. En définitive, la prise en charge des nanoparticules par la tumeur est quantifiée à partir des images, et une analyse secondaire de la tumeur peut être effectuée.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu'elle permet de générer des images haute résolution pour évaluer la dynamique des accumulations de nanoparticules dans les tumeurs au niveau microscopique. De plus, à l'aide de ce système modèle, un seul chercheur peut analyser un très grand nombre de groupes expérimentaux en moins de deux semaines. En outre, la membrane allantoïde des embryons de Shells est facilement accessible pour des manipulations physiques et pour l'imagerie non invasive.

Notre laboratoire se concentre sur le développement de nanoparticules pour l'imagerie moléculaire ciblée et la délivrance de médicaments dans le cancer. Nos recherches visant un modèle de xénogreffe rapide et peu coûteux permettant d'effectuer des analyses détaillées de l'absorption nous ont conduit vers l'embryon de poulet à coquille modifiée. Ici, nous utilisons une imagerie intravitale à haute résolution pour évaluer l'absorption des nanoparticules dans des xénogreffes de tumeurs humaines au sein d'un modèle d'embryon de poulet à coquille modifiée.

Pour ce protocole, préparez et désenveloppez des embryons de poulet fécondés au quatrième jour. À l’aide de la méthode standard, assurez-vous que les embryons sont fécondés et viables en vérifiant la présence d’un battement cardiaque, puis incubez-les à 38 degrés Celsius avec une humidité relative d’au moins 60 % jusqu’au neuvième jour embryonnaire. Les embryons sont alors prêts pour l’inoculation de cellules tumorales.

Assemblez un micro-injecteur en reliant une aiguille de calibre 18 à une seringue d'un millilitre à l'aide d'un morceau de tube en téflon de cinq à six pouces de long. Insérez soigneusement le biseau de l'aiguille dans le tube. Environ quatre à cinq pouces de tube doivent dépasser de l'extrémité de l'aiguille.

À présent, aspirez la suspension de cellules tumorales à travers le tube dans la seringue et retournez-la. Tapez délicatement sur le côté de la seringue et enfoncez le piston pour éliminer toutes les bulles d'air. Ensuite, insérez une micro-aiguille en verre à l'extrémité du tube et enfoncez le piston jusqu'à ce que la suspension cellulaire atteigne l'extrémité de l'aiguille.

Maintenant, sous un microscope stéréo, injectez lentement et soigneusement de 10 000 à 100 000 cellules cancéreuses dans l'espace interstitiel à l'intérieur du cam. Les cellules doivent former un bolus visible au sein du cam ; les cellules déposées sur la surface du cam peuvent être retirées en tamponnant légèrement avec un essuie-tout ou un applicateur en coton. Remettez ensuite les embryons dans un incubateur à 38 degrés Celsius avec une humidité d'au moins 60 %.

Laissé le tumeur se développer et s'irriguer pendant jusqu'à sept jours, atteignant un diamètre d'au moins cinq millimètres avant l'imagerie. Les nanoparticules doivent être marquées par un colorant fluorescent, compatible avec le microscope intravital, et conservées à quatre degrés Celsius dans du PBS, où elles sont stables pendant au moins un an. Ensuite, centrifuger les nanoparticules pendant une minute afin de faire tomber en sédiment tout agrégat, avant de les aspirer dans le micro-injecteur. Préparer maintenant une concentration de travail de un milligramme par millilitre en diluant les nanoparticules avec du PBS, afin d'injecter finalement 50 microgrammes de nanoparticules dans un volume de 50 microlitres.

Procédez maintenant aux injections au jour 16 du développement embryonnaire. Vérifiez que les tumeurs sont suffisamment vascularisées afin de sélectionner les embryons porteurs de tumeurs les plus appropriés par voie intraveineuse. Injectez une dextrine fluorescente de bas poids moléculaire, spectre distinct de celui des cellules tumorales et des nanoparticules.

Ensuite, visualisez la dextrine au microscope à fluorescence et sélectionnez les embryons présentant les tumeurs les plus vascularisées. Une fois les embryons sélectionnés, utilisez un micro-injecteur préparé pour déposer au moins 200 microlitres des nanoparticules préparées. Retournez la seringue.

Tapotez doucement sur le côté et enfoncez le piston pour éliminer toutes les bulles d'air. Insérez ensuite une longue microcanule en verre effilée à l'extrémité du tube et enfoncez le piston jusqu'à ce que la solution de nanoparticules atteigne l'extrémité de la microcanule. Une microcanule émoussée ne traversera pas l'ectoderme, tandis qu'une microcanule trop fine et trop pointue se brisera lors de son insertion dans le tissu.

Ensuite, injecter par voie intraveineuse entre 30 et 200 microlitres de nanoparticules dans les embryons, au niveau opposé au côté que l'on souhaite visualiser immédiatement après l'injection des nanoparticules. Les tumeurs, telles que décrites dans la section suivante, commencent par la préparation de l'unité d'imagerie de l'embryon. Appliquer d'abord une fine couche de graisse à vide autour de la circonférence du port d'imagerie située sur la face inférieure du couvercle.

Ensuite, fixez un coverslip en verre de 18 millimètres sur le port. Chargez maintenant l'embryon dans l'unité de manière à ce que le coverslip se trouve au-dessus de la zone à imager. Abaissez lentement le couvercle de l'unité jusqu'à ce que le coverslip entre juste en contact avec l'embryon, puis vissez le couvercle en place.

Remplissez maintenant la boîte contenant l'embryon avec de l'eau à 37 degrés Celsius dans l'unité d'imagerie. Cette unité maintiendra l'embryon en place sous le microscope confocal à disque rotatif du microscope à fluorescence confocale à disque tournant. Vérifiez que la chambre environnementale est à 37 degrés Celsius.

Placez maintenant l'unité d'imagerie sur la platine de sorte que la lame couvre soit directement sous l'objectif du microscope, puis procédez à l'acquisition d'images. Acquérez des séries d'images en haute résolution du tumeur et de la vascularisation environnante immédiatement après l'injection et à intervalles horaires.

Par la suite, les images refléteront les changements structuraux détaillés survenant dans la vascularisation tumorale. L'embryon peut être observé en continu jusqu'à 36 heures sans nécessiter de changement du bain d'eau. Pour quantifier l'absorption des nanoparticules virales à partir des images, utilisez un logiciel tel que velocity.

Tout d'abord, sélectionnez la tumeur et délimitez-la par rapport au stroma environnant. La sélection est facilitée par l'étiquetage de la tumeur avec de la dextrine fluorescente. Calculez ensuite le signal fluorescent moyen provenant des nanoparticules dans la tumeur et dans des zones représentatives du stroma adjacent.

Ensuite, calculez le rapport du signal moyen. Renforcez la sélection tumorale par rapport au signal moyen. Renforcez la sélection du stroma.

Un rapport supérieur à un indique que les nanoparticules sont principalement localisées dans la tumeur. Des cellules de cancer colorectal HT 29 ont été injectées pour former un bolus d’environ un millimètre de diamètre dans la membrane chorioallantoïdienne du neuvième jour. Des embryons de poulet, après sept jours d’incubation, ont été injectés par voie intraveineuse avec une dextrine de faible masse moléculaire afin de confirmer la vascularisation tumorale.

L'administration intraveineuse de nanoparticules de CPMV LOR 6 47 ou de CPMV LOR 6 47 PEGylé, suivie d'une imagerie confocale en temps réel à haute résolution, a révélé que les nanoparticules de CPMV et de CPMV PEGylé marquent rapidement l'ensemble du réseau vasculaire. Douze heures après l'injection, la quantification du signal fluorescent dans les régions tumorales par rapport aux régions stromales a montré que l'absorption du CPMV PEGylé par la tumeur était d'environ trois fois supérieure à celle du CPMV. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une imagerie intravitale à haute résolution afin d'évaluer l'absorption de nanoparticules dans des xénogreffes tumorales chez un modèle d'embryon aviaire, depuis la préparation des embryons aviaires jusqu'à la xénogreffe de cellules tumorales, l'injection intraveineuse de nanoparticules et l'évaluation de l'absorption des nanoparticules dans les tumeurs par imagerie confocale intravitale en temps réel.