Name: Evaluation de la fixation des nanoparticules dans les tumeurs en temps réel par imagerie intravitale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie intravitale en temps réel pour quantifier la fixation des nanoparticules dans les tumeurs xénogreffées chez l'embryon d'oiseau. Cette technique offre une analyse haute résolution de l'accumulation tumorale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Cette étude a été soutenue par IRSCC # 700537 Grant et subvention des IRSC # 84535 à la LDJ et le NIH / NCI octroi # CA120711-01A1-01A1 et CA120711 à AZ. Toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les règlements et les directives de l&#39;Institutional Animal Care et utilisation comité à l&#39;Université de Californie à San Diego, soins des animaux et l&#39;utilisation à l&#39;Université de Western Ontario.

1. L'inoculation de la tumeur dans le CAM d'embryon aviaire <ol><li> Préparer sans coquille des embryons de poulet fécondés comme décrit 8. </li><li> Le 9 ème jour de développement embryonnaire, assembler un micro-injecteur à l'aide d'une aiguille de calibre 18 connectés sur seringue de 1 mL. Coupez un morceau de tuyau 5-6 pouces Tygon (1 / 32 "de diamètre, 3 / 32" de diamètre extérieur, 1 / 32 "épaisseur de paroi) et insérer délicatement l'aiguille de biseau de dans le tube. Environ 4-5 cm de tubulure doit s'étendent de la pointe de l'aiguille (figure 1a). </li><li> Remplir la seringue et le tube avec la suspension cellulaire. Ensuite, insérer une aiguille de verre micro-injection à l'extrémité du tube et enlever soigneusement les bulles d'air. </li><li> Injecter Jour 9 embryons (figure 1b) sous un champ de dissection d'un illuminateur d'10,000-100,000 cellules cancéreuses en bolus dans le CAM (figure 1c). Lentement injecter des cellules et soigneusement s'assurer que l'aiguille est dans le bon endroit pour les cellules de former un bol visibles au sein de la CAM. Les cellules qui dégoutte sur la surface de came peuvent être nettoyés en utilisant l'applicateur Kimwipe ou autres. </li><li> Retour aux embryons incubateur humidifié à 38 ° C avec une humidité de 60% et permettre la tumeur de croître et vasculariser (jusqu'à 7 jours). </li></ol> 2. Préparation de nanoparticules <ol><li> Pour préparer marqué par fluorescence des nanoparticules CPMV pour l'injection dans l'embryon de poulet; diluer les nanoparticules virales (synthétisé comme en 8 dans du PBS, pH 7,4, à une concentration du mélange Vortex 100 pg / ml avant de l'utiliser et centrifuger pendant une minute pour enlever tout. agrégats. sonication peut également être utile en fonction de conjugués et le degré d'agrégation. Stocks de CPMVs marqué par fluorescence sont stables pendant au moins 1 an s'il est conservé à 4 ° C dans l'obscurité. Vérifiez périodiquement stocks en mettant quelques gouttes sur une lame de verre et la vérification pour la fluorescence. Transmission Electron Microscopy (TEM) peuvent également être utilisés pour déterminer si les particules restées intactes après conjugaison. </li><li> En bref, un microgramme de nanoparticules virales (dans un volume final de 2 pl) peuvent être ajoutés à des grilles de cuivre enrobées. Ensuite, ajoutez un volume égal d'acétate d'uranyle 2% pendant 1 minute à microscope électronique (Philips EM 410). </li></ol> 3. L'injection intraveineuse d'marqués à la fluorescence des nanoparticules virales <ol><li> Le Jour 16, assembler des micro-injecteur tel que décrit ci-dessus. Aspirer le volume désiré de nanoparticules virale à travers le tube dans la seringue (&gt; 200 uL). Retirez délicatement les bulles d'air. Insérez l'aiguille de verre micro-injection à l'extrémité du tube. Assurez-vous que l'aiguille est plus longue et effilée que possible (figure 2a). Si l'aiguille est trop brutal, il ne sera pas en mesure de percer l'ectoderme et ne parviendra pas à pénétrer dans le bateau. Si l'aiguille est trop forte, la pointe va s'effondrer lors de la pénétration tissulaire. </li><li> Intraveineuse injecter 100 ml de dextran 1 mg / ml de fluorescéine (MW 70000 Da, Invitrogen) en portant une tumeur embryonnaire distale du site désiré pour être visualisées (figure 3d). Canulation veineuse réussie de CAM est évident par la compensation de sang dans le chemin du débit d'injection (Figure 2b). Évaluer vasculaires fuites 1 heure après l'injection. </li><li> Par voie intraveineuse d'injecter 50 ul de 1 mg / ml, solution de CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) ou pégylé CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) dans des embryons contenant les tumeurs avec fuite vasculaire distale du site désiré être visualisées. </li><li> Tumeurs Image immédiatement et toutes les heures après l'injection en utilisant un Zeiss examinateur Z1 microscope droit équipé d'un disque Yokogawa filature, Hamamatsu Imagem 9100-12 EM-CCD. </li></ol> 4. En temps réel d'imagerie intravitale <ol><li> Pour assembler l'unité d'imagerie embryon, appliquer une mince couche de graisse à vide autour de la circonférence du port d'imagerie sur le dessous du couvercle de l'unité d'imagerie embryon, et en forme une lamelle de verre de 18 mm sur le port. </li><li> Position de l'embryon de telle sorte que la lamelle couvre la zone souhaitée pour l'imagerie. Abaissez lentement le couvercle jusqu'à ce que la lamelle est tout simplement le contact avec l'embryon, puis vissez le couvercle sur l'appareil pour le maintenir en place (figure 2c). </li><li> Ajouter de l'eau chauffée à 37 ° C dans l'unité d'imagerie embryon en dehors du plat contenant l'embryon, puis placez l'unité entière sur la scène d'un microscope confocal à droite avec la chambre de l'intérieur de l'environnement équilibré à 37 ° C. </li><li> Positionnez l'unité d'imagerie contenant l'embryon au microscope à fluorescence confocale à disque rotatif (figure 2e). L'unité d'imagerie tiendra l'embryon en place et tenir le champ de vision tout en capturant des images fixes, permettant à la fois des piles Z en trois dimensions et time-lapse de capturer des images. Nous acquérir et d'analyser en trois dimensions time-lapse images à l'aide de Perkin Elmer (anciennement Improvisation) logiciel Volocity (figure 3a). Acquérir une haute résolution en trois dimensions pile de la tumeur et les vaisseaux environnants pour visualiser detaileanalyses d structurelles spécifiques au temps des points. Acquérir en trois dimensions des piles à intervalles réguliers de temps aux points de carte détaillée des changements structurels dans la vascularisation tumorale. Tumeurs image toutes les heures après l'injection. </li><li> Quantifier l'absorption des nanoparticules virales en calculant la moyenne Alexa Fluor (AF) 647 du signal dans des régions sélectionnées dans la tumeur ou dans le stroma (non tumoral région) en utilisant le logiciel d'image telles que la quantification Volocity (Perkin Elmer). La tumeur du stroma ratio a été calculé en divisant la moyenne AF 647 du signal dans la tumeur sur la moyenne du signal AF 647 dans le stroma. Un ratio tumeur / stroma supérieur à 1 indique que la nanoparticule est repris par la tumeur. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Dans l'exemple décrit ici, nous avons injecté des cellules HT-29 du cancer du colon pour former un bolus d'environ 1mm dans la taille au sein de la CAM d'embryons de poulet jour 9 (figure 1b). Après inoculation, les embryons ont été cultivés pendant 7 jours dans un incubateur humidifié pour permettre la croissance tumorale et la vascularisation suffisante (figure 1c). Les embryons ont été injectés par voie intraveineuse avec un faible poids moléculaire du dextrane de confirmer la vascularisation tumorale, et les tumeurs ont été visualisées au microscope Zeiss Z1 AxioExaminer verticale (figure 2d). Après administration intraveineuse de CPMV-AF 647 ou CPMV-PEG-AF 647 nanoparticules (figure 3a et b), à haute résolution en temps réel l'imagerie confocale (figure 2e) a révélé que les deux CPMV et CPMV-PEG nanoparticules rapidement étiquetés la vascularisation entier, mais l'absorption de CPMV-PEG par la tumeur était d'environ 3 fois plus élevé que CPMV après 12 heures (figure 3a). La captation tumorale relative de nanoparticules a été déterminé en utilisant le logiciel d'analyse d'image (Volocity de Perkin Elmer). Régions d'intérêt ont été choisis au sein et en dehors de la tumeur (dans le compartiment stromal) et l'intensité moyenne de fluorescence de chacun a été déterminé. Les données sont exprimées en tumeur / stroma ratio. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Microinjection de tumeurs dans la CAM d'un embryon aviaire. (A) L'appareil est assemblé à partir de micro-injection des composants comme indiqué. (B) des embryons aviaire au jour 9 sont prêts à être inoculés avec la tumeur lors de la CAM s'est propagé à couvrir toute la surface. (C) Au jour 16, la tumeur aura atteint jusqu'à 1 cm de diamètre (ligne pointillée) et est prête pour l'injection des nanoparticules. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Injection de nanoparticules et de l'imagerie intravitale. Injection sous un microscope de dissection montrant (a) la pointe de l'aiguille microinjecteur prêt à être injecté dans la veine CAM et (b) l'aiguille microinjecteur inséré dans la veine (indiqué par la flèche) et de nanoparticules injectées dans la circulation sanguine (vu par compensation de sang). (C) l'unité d'imagerie contenant embryon aviaire avec la lamelle interfacé directement avec la CAM. (D) Avant l'injection de nanoparticules, la vascularisation tumorale est évaluée en utilisant l'imagerie intravitale après l'injection de fluorescéine dextrane. (E) l'unité d'imagerie contenant l'embryon placé sur la platine d'un microscope confocal à droite au sein d'une régulation de température mis enceinte à 37 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Visualisation de l'absorption des nanoparticules intravitale dans les tumeurs humaines. Les tumeurs sont visualisées 7 heures après l'injection de (a) CPMV-AF647 et (b) CPMV-PEG-AF647. d) L'excision de la tumeur de l'embryon aviaire pour une analyse ultérieure.

<ol><li>Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+lymphocyte+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of lymphocyte trafficking.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 581-603 (2005).</li>
<li>Judenhofer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+PET-MRI%3A+a+new+approach+for+functional+and+morphological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Simultaneous PET-MRI: a new approach for functional and morphological imaging.</a> Nat Med. 14, 459-465 (2008).</li>
<li>Weissleder, R., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+the+era+of+molecular+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging in the era of molecular oncology.</a> Nature. 452, 580-589 (2008).</li>
<li>Chambers, A. F., Ling, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+for+experimental+metastatic+ability+of+heterologous+tumor+cells+in+the+chick+embryo+after+DNA-mediated+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Selection for experimental metastatic ability of heterologous tumor cells in the chick embryo after DNA-mediated transfer.</a> Cancer Res. 44, 3970-3975 (1984).</li>
<li>Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+rat+glioma+growth%2C+invasion%2C+and+vascularization+in+a+novel+chick+embryo+brain+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model.</a> Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).</li>
<li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibition+of+tumor+cell+intravasation+and+subsequent+metastasis+via+regulation+of+in+vivo+tumor+cell+motility+by+the+tetraspanin+CD151%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151.</a> Cancer cell. 13, 221-234 (2008).</li>
<li>Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nature medicine. 12, 354-360 (2006).</li>
<li>Leong, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nature protocols. 5, 1406-1417 (2010).</li>
<li>Chatterji, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+addresses+on+an+addressable+virus+nanoblock%3B+uniquely+reactive+Lys+residues+on+cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+biology%22%5BJournal%5D)">New addresses on an addressable virus nanoblock; uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus.</a> Chemistry & biology. 11, 855-863 (2004).</li>
<li>Brunel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrazone+ligation+strategy+to+assemble+multifunctional+viral+nanoparticles+for+cell+imaging+and+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting.</a> Nano letters. 10, 1093-1097 (2010).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylated+viral+nanoparticles+for+biomedicine%3A+the+impact+of+PEG+chain+length+on+VNP+cell+interactions+in+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">PEGylated viral nanoparticles for biomedicine: the impact of PEG chain length on VNP cell interactions in vitro and ex vivo.</a> Biomacromolecules. 10, 784-792 (2009).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPMV+nanoparticles+target+surface+vimentin+on+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells.</a> Nanomedicine. , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

La membrane chorio (CAM) de l&#39;embryon aviaire est un modèle utile pour évaluer la dynamique vasculaire et la pharmacocinétique de tumeurs humaines. La structure et la position de la came permet l&#39;acquisition de haute qualité d&#39;image et accueille de nombreux types de xénogreffes de cancer invasif, sans intervention chirurgicale. Par ailleurs, les xénogreffes de tumeurs cancéreuses implantées dans la membrane chorio devenu vascularisé dans les 7 jours, offrant un moyen rapide, peu coûteuse et semi-haut-débit pour évaluer l&#39;accumulation de nanoparticules dans le tissu tumoral. Depuis xénogreffes de cancer implanté dans la CAM d&#39;embryons de poulet sans coquille sont accessibles à l&#39;optique à haute résolution d&#39;un microscope confocal à épifluorescence ou debout, l&#39;information contextuelle et temporelle sur la fixation des nanoparticules dans la vascularisation tumorale peut être facilement obtenu. Xénogreffes de cancer dans ce modèle ont tendance à croître latéralement à travers la CAM, résultant dans des tumeurs qui sont grandes, tout en restant inférieure à 200 m de profondeur. Cela les rend particulièrement bien adapté pour l&#39;imagerie intravitale parce norme microscopes à épifluorescence peut pénétrer efficacement la masse tumorale entier. En revanche, les tumeurs implantées dans des sites soit superficielle ou orthotopique dans la souris prolifèrent en trois dimensions, il est difficile de localiser précisément des nanoparticules profonde au sein de ces tumeurs par des techniques non invasives. Nous avons utilisé ce modèle pour évaluer l&#39;absorption des quantum dots, des liposomes, des nanoparticules d&#39;oxyde de fer et dans un certain nombre de xénogreffes tumorales humaines, soulignant le potentiel de ce modèle soit adapté à l&#39;analyse in vivo d&#39;une large gamme de formulations de nanoparticules.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom Réactif / Equipement </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Oeufs fécondés Leghorn </td><td> Écloserie Frey `s, St. Jacobs </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Outil rotatif Dremel </td><td> Dremel </td><td></td><td> Peut utiliser n&#39;importe quel modèle </td></tr><tr><td> Roues de coupure Dremel pas. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> Sportsman Hatcher </td><td> Berry Hill </td><td> 1550HA </td><td></td></tr><tr><td> Sportsman incubateur </td><td> Berry Hill </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Éthanol </td><td></td><td></td><td> 70% (vol / vol) </td></tr><tr><td> Polystyrène pèsent bateaux </td><td> VWR </td><td> 12577-01 </td><td></td></tr><tr><td> Place des boîtes de Pétri </td><td> Simport, VWR </td><td> 25378-115 </td><td></td></tr><tr><td> Rubbermaid caoutchouc contenant avec couvercle </td><td> Guillevin </td><td> RH3-228-00-BLU </td><td> des trous percés dans les côtés </td></tr><tr><td> Verticale pipette extracteur </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modèle 720 </td><td> Réglages: 16,3 (chauffage) et 2.3 (solénoïde) </td></tr><tr><td> Tubes en verre de borosilicate de sodium capillaires </td><td> Instrument Sutter </td><td> BF100-58-10 </td><td> (OD, 1,0 mm; 0,58 mm ID; 10 cm longueur) </td></tr><tr><td> 1X Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin (PBS-D) (1X), liquide </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> La trypsine, 0,05% (1X) avec de l&#39;EDTA 4NA, liquide </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Invitrogen </td><td> 12483-020 </td><td> Chauffer inactiver </td></tr><tr><td> Hématimètre </td><td> Hausser scientifique, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse </td><td> Eppendorf modèle 5810R </td><td> 5811 000.010 </td><td></td></tr><tr><td> Beaux-point forceps </td><td> VWR </td><td> 25607-856 </td><td></td></tr><tr><td> Tygon R-3603 tube </td><td> VWR </td><td> 63009-983 </td><td> 50 pi (1/32-inch diamètre intérieur, 3/32-inch diamètre extérieur, épaisseur de la paroi 1/32-inch </td></tr><tr><td> Aiguilles hypodermiques pour des injections de 18 aiguilles de calibre </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td> Boîte de 100 </td></tr><tr><td> Seringues de 1 ml pour les injections </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> Boîte de 100 </td></tr><tr><td> Illuminateur de microscope à fibre optique </td><td> Amscope </td><td> HL250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> VWR </td><td> 10805-905 </td><td></td></tr><tr><td> Graines de V. unguiculata (Californie noir oeil non. 5) </td><td> Burpee </td><td> 51771A </td><td></td></tr><tr><td> Les lumières de croissance intérieure </td><td> Sunlite, alimentation du jardinier </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Méthyl-PEO4-ester de NHS </td><td> Pierce </td><td> PI22341 </td><td></td></tr><tr><td> mPEG-NHS, le PEG succinimidyl ester, MW 2000 </td><td> NANOCS </td><td> PEG1-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 carboxylique (succinimidyl ester) </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 ester succinimidyle * 6-isomère * </td><td> Invitrogen </td><td> O-6149 </td><td></td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Dibasique monohydrogénophosphate </td><td> Sigma </td><td> 379980 </td><td> K2HPO4 (pour le tampon phopshate) </td></tr><tr><td> Monobasique dihydrogénophosphate </td><td></td><td> P5655 </td><td> KH2PO4 (pour le tampon phopshate) </td></tr><tr><td> Superose 6 colonnes d&#39;exclusion de taille </td><td> GE Healthcare Life Sciences </td><td> 17-0673-01 </td><td></td></tr><tr><td> ÄKTA Explorer 100 Chromatographe </td><td> GE Amersham Pharmacia </td><td> WS-AKTA100 </td><td></td></tr><tr><td> Kit ÄKTA haut débit </td><td> GE Healthcare Life Sciences </td><td> 18-1154-85 </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrifuger </td&gt; <td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SW 28 Ti rotor </td><td> Beckman </td><td> 342204 </td><td> Seau de swing </td></tr><tr><td> 50.2 Ti rotor </td><td> Beckman </td><td> 337901 </td><td> Angle fixe </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 unités de filtration centrifuge </td><td> Millipore </td><td> UFC910008 </td><td> 100 kDa coupé </td></tr><tr><td> Dégradé anciens </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> dextrane, la fluorescéine, 70.000 MW, anioniques </td><td> Invitrogen </td><td> D1823 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning microscope à fluorescence confocale disque </td><td> Quorum; Yokogawa CSU 10, Yokogawa </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Épifluorescence à champ large de microscope </td><td> Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu Imagem 9100-12 EM-CCD </td><td> Quorum; Hamamatsu </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Unité de boîtier Température pour microscope </td><td> Precision Plastics </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Graisse à vide </td><td> VWR </td><td> 59344-055 </td><td></td></tr><tr><td> De verre circulaire lamelles pas. 1 (18 mm) </td><td> VWR </td><td> 16004-300 </td><td></td></tr><tr><td> Logiciels Volocity </td><td> Perkin Elmer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Boîtier d&#39;embryon de poulet </td><td></td><td> fabriqués sur mesure </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux délicats </td><td> VWR </td><td> 25608-203 </td><td></td></tr><tr><td> Formol </td><td> Bioshop </td><td> FOR201.500 </td><td> Utilisation dans hotte </td></tr><tr><td> Coupe optimale </td><td> Fisher; Tissue Tek </td><td> 1437365 </td><td></td></tr><tr><td> Température (PTOM) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Moules plastiques </td><td> Fisher </td><td> 22-038217 </td><td></td></tr><tr><td> VWR VistaVision HistoBond adhésif Diapositives </td><td> VWR </td><td> 16004-406 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongez l&#39;or avec du DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Lames jetables pour cryostat </td><td> Fisher </td><td> 12-634-2 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> Leica CM 3050 S </td><td> 14047033518 </td><td></td></tr></table>

evaluation de la fixation des nanoparticules dans les tumeurs en temps réel par imagerie intravitale

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Les technologies actuelles d&#39;imagerie des tumeurs, comme l&#39;échographie, IRM, PET et CT, sont incapables de donner des images haute résolution pour l&#39;évaluation de l&#39;absorption des nanoparticules dans les tumeurs au niveau microscopique 1,2,3, soulignant l&#39;utilité d&#39;un modèle de xénogreffe adaptée dans lequel pour effectuer des analyses détaillées absorption. Ici, nous utilisons l&#39;imagerie haute résolution intravitale pour évaluer l&#39;absorption des nanoparticules dans les xénogreffes de tumeurs humaines dans une modification, le modèle d&#39;embryon de poulet sans coquille. Le modèle d&#39;embryons de poulet est particulièrement bien adaptée pour ces analyses in vivo, car elle soutient la croissance de tumeurs humaines, est relativement peu coûteux et ne nécessite pas une anesthésie ou une chirurgie 4,5. Les cellules tumorales forment totalement xénogreffes vascularisé dans les 7 jours lorsqu&#39;ils sont implantés dans la membrane chorio (CAM) 6. Les tumeurs qui en résultent sont visualisés par imagerie non invasive en temps réel, haute résolution qui peut être maintenue jusqu&#39;à 72 heures avec peu d&#39;impact sur l&#39;hôte ou des systèmes de tumeur. Les nanoparticules avec une large gamme de tailles et de formulations administrées à la tumeur distale peuvent être visualisées et quantifiées comme ils par la circulation sanguine, de la vascularisation tumorale s&#39;extravaser qui fuient, et s&#39;accumulent dans le site tumoral. Nous décrivons ici l&#39;analyse de nanoparticules dérivées de virus de la mosaïque du niébé (CPMV) décoré avec le proche infrarouge colorants fluorescents et / ou polymères de polyéthylène glycol (PEG) 7, 8, 9,10,11. Après administration par voie intraveineuse, ces nanoparticules virales sont rapidement internalisées par les cellules endothéliales, entraînant l&#39;étiquetage global de la vascularisation à l&#39;extérieur et au sein de l&#39;7,12 tumeur. PEGylation des nanoparticules virale augmente leur demi-vie plasmatique, s&#39;étend de leur temps dans la circulation, et accroît leur accumulation dans les tumeurs via la perméabilité accrue et la rétention (EPR) Effet 7, 10,11. Le taux et l&#39;étendue de l&#39;accumulation de nanoparticules dans une tumeur est mesurée au cours du temps en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image. Cette technique fournit une méthode à la fois visualiser et de quantifier la dynamique des nanoparticules dans les tumeurs humaines.

Nous présentons une nouvelle approche pour quantifier la localisation des nanoparticules dans le système vasculaire des tumeurs humaines xénogreffées aide dynamique, imagerie en temps réel intravitale dans un modèle d&#39;embryon aviaire.

Evaluation de la fixation des nanoparticules dans les tumeurs en temps réel par imagerie intravitale

Les technologies actuelles d'imagerie tumorale, telles que l'échographie, l'IRM, la TEP et la CT, sont incapables de produire des images à haute résolution pour l'évaluation des nanoparticules...

L'objectif général de cette procédure est de quantifier l'absorption de nanoparticules par les tumeurs à l'aide d'une imagerie intravitale. Cela est réalisé en désenveloppant et en cultivant d'abord des embryons d'oiseaux. La deuxième étape consiste à établir des tumeurs xénogreffées dans la membrane chorioallantoïque, ou CAM, et à les laisser croître pendant environ une semaine.La troisième étape de la procédure consiste à injecter par voie intraveineuse des nanoparticules dans le cam et à réaliser une imagerie confocale intravitale en temps réel de la tumeur xénogreffe. La dernière étape de la procédure est l'excision et la sectionnement de la tumeur. En définitive, la prise en charge des nanoparticules par la tumeur est quantifiée à partir des images, et une analyse secondaire de la tumeur peut être effectuée.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu'elle permet de générer des images haute résolution pour évaluer la dynamique des accumulations de nanoparticules dans les tumeurs au niveau microscopique. De plus, à l'aide de ce système modèle, un seul chercheur peut analyser un très grand nombre de groupes expérimentaux en moins de deux semaines. En outre, la membrane allantoïde des embryons de Shells est facilement accessible pour des manipulations physiques et pour l'imagerie non invasive.Notre laboratoire se concentre sur le développement de nanoparticules pour l'imagerie moléculaire ciblée et la délivrance de médicaments dans le cancer. Nos recherches visant un modèle de xénogreffe rapide et peu coûteux permettant d'effectuer des analyses détaillées de l'absorption nous ont conduit vers l'embryon de poulet à coquille modifiée. Ici, nous utilisons une imagerie intravitale à haute résolution pour évaluer l'absorption des nanoparticules dans des xénogreffes de tumeurs humaines au sein d'un modèle d'embryon de poulet à coquille modifiée.Pour ce protocole, préparez et désenveloppez des embryons de poulet fécondés au quatrième jour. À l’aide de la méthode standard, assurez-vous que les embryons sont fécondés et viables en vérifiant la présence d’un battement cardiaque, puis incubez-les à 38 degrés Celsius avec une humidité relative d’au moins 60 % jusqu’au neuvième jour embryonnaire. Les embryons sont alors prêts pour l’inoculation de cellules tumorales.Assemblez un micro-injecteur en reliant une aiguille de calibre 18 à une seringue d'un millilitre à l'aide d'un morceau de tube en téflon de cinq à six pouces de long. Insérez soigneusement le biseau de l'aiguille dans le tube. Environ quatre à cinq pouces de tube doivent dépasser de l'extrémité de l'aiguille.À présent, aspirez la suspension de cellules tumorales à travers le tube dans la seringue et retournez-la. Tapez délicatement sur le côté de la seringue et enfoncez le piston pour éliminer toutes les bulles d'air. Ensuite, insérez une micro-aiguille en verre à l'extrémité du tube et enfoncez le piston jusqu'à ce que la suspension cellulaire atteigne l'extrémité de l'aiguille.Maintenant, sous un microscope stéréo, injectez lentement et soigneusement de 10 000 à 100 000 cellules cancéreuses dans l'espace interstitiel à l'intérieur du cam. Les cellules doivent former un bolus visible au sein du cam ; les cellules déposées sur la surface du cam peuvent être retirées en tamponnant légèrement avec un essuie-tout ou un applicateur en coton. Remettez ensuite les embryons dans un incubateur à 38 degrés Celsius avec une humidité d'au moins 60 %.Laissé le tumeur se développer et s'irriguer pendant jusqu'à sept jours, atteignant un diamètre d'au moins cinq millimètres avant l'imagerie. Les nanoparticules doivent être marquées par un colorant fluorescent, compatible avec le microscope intravital, et conservées à quatre degrés Celsius dans du PBS, où elles sont stables pendant au moins un an. Ensuite, centrifuger les nanoparticules pendant une minute afin de faire tomber en sédiment tout agrégat, avant de les aspirer dans le micro-injecteur. Préparer maintenant une concentration de travail de un milligramme par millilitre en diluant les nanoparticules avec du PBS, afin d'injecter finalement 50 microgrammes de nanoparticules dans un volume de 50 microlitres.Procédez maintenant aux injections au jour 16 du développement embryonnaire. Vérifiez que les tumeurs sont suffisamment vascularisées afin de sélectionner les embryons porteurs de tumeurs les plus appropriés par voie intraveineuse. Injectez une dextrine fluorescente de bas poids moléculaire, spectre distinct de celui des cellules tumorales et des nanoparticules.Ensuite, visualisez la dextrine au microscope à fluorescence et sélectionnez les embryons présentant les tumeurs les plus vascularisées. Une fois les embryons sélectionnés, utilisez un micro-injecteur préparé pour déposer au moins 200 microlitres des nanoparticules préparées. Retournez la seringue.Tapotez doucement sur le côté et enfoncez le piston pour éliminer toutes les bulles d'air. Insérez ensuite une longue microcanule en verre effilée à l'extrémité du tube et enfoncez le piston jusqu'à ce que la solution de nanoparticules atteigne l'extrémité de la microcanule. Une microcanule émoussée ne traversera pas l'ectoderme, tandis qu'une microcanule trop fine et trop pointue se brisera lors de son insertion dans le tissu.Ensuite, injecter par voie intraveineuse entre 30 et 200 microlitres de nanoparticules dans les embryons, au niveau opposé au côté que l'on souhaite visualiser immédiatement après l'injection des nanoparticules. Les tumeurs, telles que décrites dans la section suivante, commencent par la préparation de l'unité d'imagerie de l'embryon. Appliquer d'abord une fine couche de graisse à vide autour de la circonférence du port d'imagerie située sur la face inférieure du couvercle.Ensuite, fixez un coverslip en verre de 18 millimètres sur le port. Chargez maintenant l'embryon dans l'unité de manière à ce que le coverslip se trouve au-dessus de la zone à imager. Abaissez lentement le couvercle de l'unité jusqu'à ce que le coverslip entre juste en contact avec l'embryon, puis vissez le couvercle en place.Remplissez maintenant la boîte contenant l'embryon avec de l'eau à 37 degrés Celsius dans l'unité d'imagerie. Cette unité maintiendra l'embryon en place sous le microscope confocal à disque rotatif du microscope à fluorescence confocale à disque tournant. Vérifiez que la chambre environnementale est à 37 degrés Celsius.Placez maintenant l'unité d'imagerie sur la platine de sorte que la lame couvre soit directement sous l'objectif du microscope, puis procédez à l'acquisition d'images. Acquérez des séries d'images en haute résolution du tumeur et de la vascularisation environnante immédiatement après l'injection et à intervalles horaires.Par la suite, les images refléteront les changements structuraux détaillés survenant dans la vascularisation tumorale. L'embryon peut être observé en continu jusqu'à 36 heures sans nécessiter de changement du bain d'eau. Pour quantifier l'absorption des nanoparticules virales à partir des images, utilisez un logiciel tel que velocity.Tout d'abord, sélectionnez la tumeur et délimitez-la par rapport au stroma environnant. La sélection est facilitée par l'étiquetage de la tumeur avec de la dextrine fluorescente. Calculez ensuite le signal fluorescent moyen provenant des nanoparticules dans la tumeur et dans des zones représentatives du stroma adjacent.Ensuite, calculez le rapport du signal moyen. Renforcez la sélection tumorale par rapport au signal moyen. Renforcez la sélection du stroma.Un rapport supérieur à un indique que les nanoparticules sont principalement localisées dans la tumeur. Des cellules de cancer colorectal HT 29 ont été injectées pour former un bolus d’environ un millimètre de diamètre dans la membrane chorioallantoïdienne du neuvième jour. Des embryons de poulet, après sept jours d’incubation, ont été injectés par voie intraveineuse avec une dextrine de faible masse moléculaire afin de confirmer la vascularisation tumorale.L'administration intraveineuse de nanoparticules de CPMV LOR 6 47 ou de CPMV LOR 6 47 PEGylé, suivie d'une imagerie confocale en temps réel à haute résolution, a révélé que les nanoparticules de CPMV et de CPMV PEGylé marquent rapidement l'ensemble du réseau vasculaire. Douze heures après l'injection, la quantification du signal fluorescent dans les régions tumorales par rapport aux régions stromales a montré que l'absorption du CPMV PEGylé par la tumeur était d'environ trois fois supérieure à celle du CPMV. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une imagerie intravitale à haute résolution afin d'évaluer l'absorption de nanoparticules dans des xénogreffes tumorales chez un modèle d'embryon aviaire, depuis la préparation des embryons aviaires jusqu'à la xénogreffe de cellules tumorales, l'injection intraveineuse de nanoparticules et l'évaluation de l'absorption des nanoparticules dans les tumeurs par imagerie confocale intravitale en temps réel.

evaluation-nanoparticle-uptake-tumors-real-time-using-intravital

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Nanoparticules virales végétales (VNPs) sont prometteurs plates-formes pour des applications dans le domaine biomédical. Ici, nous décrivons les procédures pour les installations VNP propagation, la purification, la caractérisation et la bioconjugaison. Enfin, nous montrons l'application de VNPs prise d'origine tumorale et d'imagerie en utilisant un modèle de xénogreffe de souris et l'imagerie de fluorescence.

Les nanoparticules virales pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des tumeurs

A Novel haute résolution<em&gt; In vivo</em&gt; Technique d&#39;imagerie pour étudier la réponse dynamique des structures intracrâniennes à la croissance tumorale et de thérapeutique

Cet article détaille les procédures d'analyse d'imagerie optique de la nanoparticule tumeur ciblée, Herdox. En particulier, l'utilisation de détail du dispositif d'imagerie multimode pour détecter le ciblage tumoral et l'évaluation de la pénétration tumeur est décrit ici.

Analyse de la protéine virale ciblée nanoparticules administrées à HER2 + Tumeurs

Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour effectuer la validation ex vivo d’expériences d’imagerie de xénogreffes de fluorescence dans le proche infrarouge in vivo chez la souris à l’aide de nanocorps marqués au fluorophore et d’anticorps conventionnels.

Validation des Nanobodies et Anticorps Based<em&gt; In Vivo</em&gt; Expériences tumeur xénogreffe NIRF-imagerie dans des souris en utilisant<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cytométrie en flux et microscopie

Ce protocole décrit l'utilisation de la microscopie multiphotonique pour effectuer prolongée imagerie time-lapse d'interactions multicellulaires en temps réel, in vivo à la résolution d'une seule cellule.

Time-lapse Extended Imagerie intravitale du temps réel multicellulaire Dynamics dans le microenvironnement de la tumeur

Ce protocole décrit l’imagerie intravitale des souris transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents spécifiques des cellules. Intravitale imagerie fournit une méthode non invasive pour les observations à haute résolution dans les animaux vivants à l’aide de windows implantables permettant la visualisation microscopique des processus est possible. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier les processus longitudinales.

La microscopie intravitale du système vasculaire associées à la tumeur en utilisant Advanced dorsale pli fenêtre Chambers sur des souris transgéniques fluorescents

La mauvaise compréhension des performances in vivo des nanomédicaments entrave leur traduction clinique. Les procédures d’évaluation du comportement in vivo des nanomédicaments anticancéreux aux niveaux systémique, tissulaire, unicellulaire et subcellulaire chez des souris immunocompétentes porteuses de tumeurs sont décrites ici. Cette approche pourrait aider les chercheurs à identifier des nanomédicaments anticancéreux prometteurs pour l’application clinique.

Une procédure exhaustive pour évaluer la<em&gt; In Vivo</em&gt; Performance du Cancer nanomédicaments

Imagerie de cellules vivantes est un outil puissant pour visualiser les processus dynamiques. L’examen des cellules fixes fournit uniquement des images statiques, qui peuvent conduire à des erreurs d’interprétation et de la confusion au sujet du processus. Cet ouvrage présente une méthode pour étudier l’absorption, la libération de la drogue et localisation intracellulaire des nanoparticules LIPOSOMALES dans les cellules vivantes.

À l’aide de In Vitro imagerie de cellules vivantes pour explorer les agents chimiothérapeutiques livré par nanoparticules à base de lipides

Nous présentons une nouvelle approche pour la microscopie à deux photons de l’administration tumorale de nanoparticules d’oxyde de fer marquées par fluorescence au glioblastome dans un modèle murin.

Microscopie intravitale à deux photons du glioblastome dans un modèle murin

Ici, nous décrivons le protocole d’administration in vivo de nanoparticules d’oxyde de fer magnétiques portant des oligomères d’ARN au cancer du sein métastatique dans des modèles animaux, fournissant une approche cliniquement viable pour le silençage thérapeutique des acides nucléiques oncogènes.

Surveillance de l’accumulation de nanomédicaments dans les métastases du cancer du sein murin

La barrière hémato-encéphalique est un obstacle important à l’administration de traitements pour le glioblastome, une maladie pour laquelle il n’existe aucun remède. Ici, nous rapportons une nanoplateforme thérapeutique d’oxyde de fer guidée par l’image in vivo qui peut contourner cette barrière physiologique en raison de sa taille et s’accumuler dans la tumeur.

Livraison de nanoparticules d’une charge utile d’oligonucléotide dans un modèle animal de glioblastome multiforme

Découvrez une méthode d'imagerie intravitale en temps réel pour quantifier la fixation des nanoparticules dans les tumeurs xénogreffées chez l'embryon d'oiseau. Cette technique offre une analyse haute résolution de l'accumulation tumorale.

Evaluation de la fixation des nanoparticules dans les tumeurs en temps réel par imagerie intravitale

Explorer plus de vidéos