Identification et analyse des progéniteurs érythroïdes de la souris en utilisant les CD71/TER119 cytométrie en flux Assay

L'objectif général de l'expérience suivante est d'identifier directement les précurseurs des globules rouges dans un tissu fraîchement prélevé chez la souris. Cela nous permet d'étudier leurs propriétés moléculaires au cours de périodes où le système érythropoïétique de ces souris subit des modifications. Par exemple, durant le développement embryonnaire ou en réponse à un stress hypoxique, le tissu hématopoïétique est d'abord isolé du foie fœtal de souris, de la rate adulte ou de la moelle osseuse, puis dissocié en une suspension monocellulaire.

Ensuite, les cellules sont marquées par des anticorps dirigés contre les marqueurs de surface CD 71 et TER 119, ainsi que contre tout autre marqueur d'intérêt, par exemple pour mesurer la survie cellulaire ou le statut du cycle cellulaire. La suspension cellulaire marquée est alors analysée à l'aide d'un analyseur de cytométrie en flux, et des sous-populations spécifiques d'érythroblastes à des stades distincts de maturation sont identifiées. Ces sous-populations spécifiques peuvent être purifiées par tri cellulaire. Par la suite, des analyses cellulaires et moléculaires peuvent être réalisées pour chaque sous-ensemble de maturation des érythroblastes.

La capacité d'identifier les érythroblastes à des stades spécifiques de maturation directement dans des tissus hématopoïétiques fraîchement isolés nous offre l'opportunité d'étudier ces cellules dans leur environnement physiologique. Cette méthode nous permet donc d'étudier in vivo les érythroblastes à différents stades de maturation. Lorsque les souris sont soumises à des stimuli, elles accélèrent la production érythropoïétique.

Par exemple, des conditions hypoxiques qui imitent l'altitude élevée ou l'injection de l'hormone érythropoïétine. Nous utilisons la cytométrie en flux multiparamétrique pour identifier des érythroblastes au sein d'un environnement tissulaire complexe et étudier simultanément leur signalisation, leur survie et leur statut du cycle cellulaire. Nous pouvons également trier les érythroblastes à des stades spécifiques de maturation directement à partir de tissu frais et analyser leurs niveaux d'expression génique, leur état de la chromatine ou d'autres fonctions moléculaires.

L'érythropoïèse définitive chez la souris se déroule dans la rate et la moelle osseuse de la souris adulte. Par conséquent, ces tissus seront prélevés sur une souris euthanasiée. Après l'euthanasie de la souris, prélevez le sang par ponction cardiaque dans des tubes de prélèvement sanguin contenant de l'EDTA ou de l'héparine ; ce sang sera utilisé ultérieurement pour le comptage de l'hématocrite, le comptage des réticulocytes ou une analyse de la numération globulaire complète (CBC).

Placer la rate et le fémur prélevés dans des tubes séparés contenant du tampon de marquage froid. Garder les tissus prélevés sur de la glace si désiré. Peser la rate.

Les souris subissant une réponse au stress érythropoïétique sont susceptibles de présenter une augmentation significative du poids de la rate. Ensuite, les cellules spléniques et les cellules de la moelle osseuse sont préparées à partir des tissus prélevés selon des procédures déjà démontrées chez l'embryon de souris. L'érythropoïèse définitive a lieu dans le foie fœtal entre les jours embryonnaires 12,5 et 15,5.

Des souris femelles gestantes à journées contrôlées sont préparées pour l'obtention de cellules hépatiques fœtales aux jours 12,5 à 14,5 de gestation. Les souris femelles gestantes à journées contrôlées sont euthanasiées et les cornes utérines sont prélevées dans une boîte de Pétri contenant de la glace. Milieu de culture froid ou tampon de marquage.

Un microscope stéréoscopique est nécessaire pour disséquer le foie fœtal à partir du jour embryonnaire 12,5 ou plus jeune afin d'extraire les embryons de l'utérus. Commencez par séparer chaque embryon du cornu utérin. Ensuite, excisez délicatement la paroi de l'utérus pour libérer l'embryon contenu dans sa poche amniotique.

Détachez délicatement la membrane amniotique. Le foie fœtal est le tissu abdominal rouge le plus volumineux, situé sous un cœur beaucoup plus petit. Pour disséquer le foie fœtal, utilisez une pince pour immobiliser l'embryon de chaque côté du foie et poussez doucement le foie hors de l'abdomen dans le milieu.

Transférez délicatement le foie dans un tube contenant du tampon de marquage frais. Une fois que tous les foies fœtaux ont été disséqués et transférés dans un tube contenant du tampon de marquage frais, dissociez les foies mécaniquement par pipetage, puis filtrez les cellules dissociées à travers un tamis en nylon de 40 microns. Lavez les cellules deux fois par centrifugation, en éliminant le surnageant et en resuspendant les cellules dans le tampon de marquage.

Après le deuxième lavage, colorer les cellules au bleu de trypan et les compter à l’aide d’un hémocytomètre. Un foie fœtal à E 13,5 contient environ 10 puissance sept. Resuspendre les cellules à une concentration de un à deux fois 10 puissance six cellules par échantillon de 200 microlitres pour l’analyse cytométrique en flux.

Pour les besoins de ce protocole vidéo, la coloration par anticorps pour la cytométrie en flux sera démontrée uniquement sur les cellules du foie fœtal. Pour commencer cette procédure, préparez un prémélange d'anticorps primaire contenant les éléments suivants : IgG de lapin purifiée pour bloquer les récepteurs FC des cellules murines, CD 71 FETR un 19 PE et un anticorps dirigé contre la protéine membranaire cellulaire fast. Mélangez délicatement la solution d'anticorps en retournant le tube deux à trois fois, ajoutez 200 microlitres du prémélange d'anticorps primaire à l'échantillon de cellules hépatiques fœtales préparé précédemment, puis pipetez doucement plusieurs fois de haut en bas afin de resuspendre les cellules.

Ensuite, préparez ces six échantillons cellulaires témoins. Un échantillon non marqué dans lequel les cellules sont laissées dans le tampon de marquage afin de fournir l'autofluorescence de fond des cellules, un marquage monochromatique pour chaque anticorps ou couleur utilisé dans le protocole afin de corriger le recouvrement spectral entre les canaux, qui dans cette expérience sont TUR one 19 PE CD 71 fz fast, biotin et streptavidin A PC et seven A A DA, et un témoin fluorescence moins un pour fast biotin, qui fournit le fond réel pour ce canal, où les cellules sont marquées avec toutes les couleurs ou anticorps du protocole sauf fast biotin. Incubez l'échantillon et les témoins pertinents avec l'anticorps primaire sur glace pendant 45 minutes à une heure, à l'abri de la lumière.

À la fin de l'incubation, laver les cellules en ajoutant trois millilitres de tampon de marquage dans chaque tube d'échantillon et centrifuger de trois à cinq minutes à environ 400 ×g à quatre degrés Celsius. Ensuite, ajouter la streptavidine PC et incuber les tubes sur de la glace de 30 à 45 minutes. À la fin de l'incubation, laver les cellules comme pour la coloration par le premier anticorps.

Enfin, resuspendre les cellules dans une solution de marquage contenant le colorant ADN, imperméant aux cellules, seven a a d, afin d'exclure les cellules mortes. Les échantillons sont désormais prêts pour l'analyse par cytométrie en flux. L'aspect le plus délicat de cette procédure est l'analyse correcte du fenêtrage des événements cytométriques, permettant l'identification fiable des sous-populations d'érythroblastes.

Il nécessite une configuration minutieuse de l'appareil, tous les échantillons témoins corrects, une compensation soigneuse du recouvrement spectral et un tri ultérieur permettant d'exclure les cellules mortes, les agrégats et les événements très petits. Au début de l'analyse des données, l'échantillon non marqué et les échantillons témoins monocolorés sont utilisés pour configurer la compensation du recouvrement spectral pour chaque combinaison de couleurs.

Dans cet exemple, nous allons montrer comment la fluorescence de l'APC s'étend dans le canal PE et comment cette superposition spectrale est corrigée après compensation. Tout d'abord, à l'aide du témoin non marqué, nous définissons une région APC positive et PE négative. Ensuite, à l'aide du témoin monocoloré APC, nous pouvons visualiser le débordement spectral dans le canal PE.

Après compensation numérique à l'aide du logiciel FlowJo, le signal de recouvrement E dans le canal PE est minimisé. Une fois compensés, les cellules mortes, les agrégats et les petits événements peuvent être éliminés. Les agrégats et les doublets cellulaires sont supprimés en traçant la hauteur de la diffusion avant par rapport à la surface de la diffusion avant et en sélectionnant les événements situés dans une fenêtre diagonale étroite.

Les cellules mortes sont éliminées en sélectionnant les cellules négatives pour le DAPI, un colorant nucléaire imperméant aux cellules vivantes. Le quadrillage des cellules viables négatives au DAPI exclut également les événements très petits tels que les noyaux ou les débris, qui présentent une diffusion directe très faible. Ensuite, nous présenterons la stratégie de quadrillage pour les cellules du foie fœtal.

Les cellules fraîchement récoltées ont été marquées pour CD71 TUR une 19 et un cocktail d'anticorps marqués ZI dirigés contre des marqueurs de lignage non érythroïde. Dans cet exemple, les échantillons ont déjà été compensés pour les chevauchements spectraux, puis sélectionnés pour exclure les agrégats, les cellules mortes et les événements très petits. Nous utilisons l'échantillon FMO contenant toutes les couleurs sauf la coloration fluorescente positive pour le lignage afin de tracer un histogramme fluorescent et définir la fenêtre des cellules négatives pour le lignage. Nous appliquons ensuite cette fenêtre à l'échantillon de foie fœtal marqué avec les marqueurs de lignage conjugués à ZI.

Les cellules négatives pour la lignée sont sélectionnées et représentées avec CD71 sur l'axe des Y et TER119. Sur l'axe des A, les cellules peuvent désormais être réparties en sous-ensembles allant de S0 à S5. Le sous-ensemble S0, appauvri en lignée (Lin déplété), contient principalement des cellules possédant un potentiel CFUE avant le début de la dépendance à l'EPO.

Le sous-ensemble S1 contient des cellules CFUE dépendantes de l'EPO, majoritairement en phase S du cycle cellulaire. Les cellules du sous-ensemble S2 ont perdu leur potentiel de formation de colonies et commencent à exprimer l'hémoglobine. Les cellules du sous-ensemble S3 sont majoritairement des érythroblastes basophiles. Les sous-ensembles S4 et S5 contiennent des érythroblastes tardifs. L'analyse présentée ici illustre la stratégie d'analyse après l'acquisition des données provenant de cellules spléniques traitées et marquées par des anticorps dirigés contre CD71 et TER119, ainsi que l'histogramme du récepteur de la mort cellulaire (death receptor).

On observe tous les événements acquis, où la porte diagonale représente les événements qui correspondent probablement à des cellules individuelles, excluant les doublets ou les agrégats plus gros. Les cellules situées dans cette porte sont analysées plus en détail dans l'histogramme deux présenté ici. Les événements très petits, probablement des noyaux ou des débris, sont exclus.

Les cellules sélectionnées sont présentées dans l'histogramme trois, où les cellules positives au DAPI, probablement apoptotiques et perméables à la membrane, sont exclues de toute analyse ultérieure. L'histogramme quatre montre la population résultante de cellules spléniques viables. L'eGate pro contient des cellules CD 71 élevées, TER un 19 intermédiaires ; les cellules R un 19 élevées sont analysées plus en détail dans l'histogramme cinq.

Ici, les cellules CD71 élevées sont subdivisées en érythroblastes de grande taille, moins matures, et en érythroblastes A B plus petits et plus matures. La sous-population d'érythroblastes la plus mature est ARI C. L'expression des protéines de surface cellulaire peut être mesurée simultanément pour chacune de ces sous-populations en ajoutant les anticorps spécifiques en même temps que TER R one 19 et CD71. L'histogramme de coloration 6 montre l'expression à la surface cellulaire du récepteur de mort Fas, spécifiquement dans la sous-population A, chez des souris au stade basal et chez des souris injectées avec une dose unique d'Eppo.

Les résultats indiquent que l'EPO supprime l'expression rapide dans cette zone. L'expression in vivo d'une population de protéines intracellulaires ou le statut du cycle cellulaire peuvent également être mesurés pour les cellules de chaque sous-ensemble. Dans cette analyse représentative du cycle cellulaire, des souris ont été injectées par voie intrapéritonéale avec du BRDU et la moelle osseuse a été prélevée 30 à 60 minutes plus tard.

En plus d'être marquées pour CD71 et TER19, les cellules ont été marquées pour l'incorporation de BrdU dans leur ADN. Les cellules positives pour BrdU se trouvent en phase S du cycle. Les cellules en interface sont négatives pour BrdU et peuvent être réparties en phases G1 ou G2/M. À l'aide de DNAD7, les cellules AA D peuvent être triées à partir de chacun des sous-ensembles PROE, aire AAB et AEC.

Ici, elles sont présentées dans des préparations de cytosines, montrant une maturation séquentielle accompagnée d'une diminution de la taille cellulaire, d'une condensation nucléaire et d'une coloration brunâtre de plus en plus marquée, reflétant l'expression d'hémoglobine. Enfin, une analyse représentative du cycle cellulaire du sous-ensemble S3 dans le foie fœtal à E 13,5 est présentée ici. Des souris gestantes ont été injectées avec du BRDU.

Les foies fœtaux ont été prélevés 30 à 60 minutes plus tard, fixés, perméabilisés et marqués avec des anticorps dirigés contre CD71, TER119 et BrdU. Le statut du cycle cellulaire des cellules S3 est analysé, les cellules en phase S étant positives pour BrdU, et la teneur en ADN est quantifiée par marquage au colorant ADNique 7-AAD.

L'approche cytométrique que nous décrivons permet l'investigation simultanée de fonctions cellulaires telles que l'expression de marqueurs de surface et d'autres protéines, la survie cellulaire, la signalisation cellulaire à l'aide d'anticorps spécifiques de fosso et le statut du cycle cellulaire. Elle nous permet donc d'étudier les réponses moléculaires des érythroblastes, à différents stades de maturation, face à une large gamme de stimuli ou à l'effet de mutations génétiques. Il convient de noter que les sous-ensembles de maturation en cytométrie en flux sont définis en fonction de l'expression des marqueurs de surface cellulaire et de la diffusion avant.

Nous avons constaté que, de manière générale, les cellules de chaque sous-ensemble correspondent à un stade érythroblastique morphologique similaire dans une grande variété de modèles murins. Toutefois, nous recommandons de le vérifier lors de l'analyse d'un nouveau modèle murin. En triant les cellules de chaque sous-ensemble et en examinant leur morphologie, les cellules de chaque sous-ensemble peuvent également être triées pour une analyse de l'ARN ou du transcriptome ; les expériences de tri doivent utiliser des pressions de tri faibles et des embouts larges afin de minimiser les contraintes de cisaillement sur les cellules.

Nous recommandons également de vérifier la pureté et la viabilité des cellules après chaque expérience de tri. Enfin, lorsqu'on détecte un changement dans la fréquence d'un sous-ensemble donné, il est important de déterminer s'il s'agit d'une modification réelle du nombre de cellules dans ce sous-ensemble ou si elle résulte de variations dans d'autres sous-ensembles. Par conséquent, en plus de mesurer les fréquences des sous-ensembles, il est toujours nécessaire de mesurer également le nombre absolu de cellules dans chaque sous-ensemble.