Identification et analyse des progéniteurs érythroïdes de la souris en utilisant les CD71/TER119 cytométrie en flux Assay

L’objectif global de l’expérience suivante est d’identifier les précurseurs des globules rouges directement dans les tissus fraîchement récoltés chez la souris. Cela nous permet d’étudier leurs propriétés moléculaires pendant les périodes où le système érythropoïétique de ces souris subit des changements. Par exemple, au cours du développement embryonnaire ou lors de la réponse au stress hypoxique, le premier tissu hématopoïétique est isolé du foie fœtal de souris ou de la rate ou de la moelle osseuse adulte et dissocié en une suspension unicellulaire.

Ensuite, les cellules sont marquées avec des anticorps contre les marqueurs de surface cellulaire CD 71 et TER un 19, et avec tout autre marqueur d’intérêt, par exemple, pour mesurer la survie cellulaire ou l’état du cycle cellulaire, la suspension cellulaire marquée est ensuite analysée à l’aide d’un analyseur de cytométrie en flux et des sous-ensembles spécifiques d’érythroblastes à des stades distincts de maturation sont identifiés. Ces sous-ensembles spécifiques peuvent être purifiés par le tri cellulaire. Par la suite, des analyses cellulaires et moléculaires peuvent être effectuées pour chaque sous-ensemble de maturation des érythroblastes.

La capacité d’identifier les érythroblastes à des stades de maturation spécifiques directement dans des tissus hématopoïétiques fraîchement isolés nous donne la possibilité d’étudier les cellules du cortex physiologique. Cette méthode nous permet donc d’étudier les érythroblastes élevés de différents stades de maturation, répondant in vivo. Lorsque les souris sont soumises à des stimuli, elles accélèrent la caisse érythropoïétique.

Par exemple, des conditions hypoxiques qui imitent la haute altitude ou l’injection de l’hormone érythropoïétine. Nous utilisons la cytométrie en flux multiparamétrique pour identifier une lame dans un environnement tissulaire complexe et étudier simultanément sa signalisation, sa survie et l’état de son cycle cellulaire. Nous pouvons également trier les érythroblastes à leurs stades de maturation spécifiques directement à partir de tissus frais et explorer leurs niveaux d’expression génique, leur statut chromatinal ou d’autres fonctions moléculaires.

L’érythropoïèse définitive de la souris a lieu dans la rate et la moelle osseuse de la souris adulte. Par conséquent, ces tissus seront prélevés sur une souris euthanasiée. Après l’euthanasie de la souris, prélever du sang par ponction cardiaque dans des tubes de prélèvement sanguin d’EDTA ou d’héparine, ce sang sera utilisé plus tard pour la numération histonomique, la numération des réticulocytes ou l’analyse de la FSC.

Placez la rate et le fémur récoltés dans des tubes séparés contenant une coloration à froid. Tampon. Conservez les tissus prélevés sur de la glace si vous le souhaitez. Pesez la rate.

Les souris subissant une réponse au stress érythropoïétique sont susceptibles de montrer une augmentation significative du poids de la rate. Par la suite, les cellules de la rate et de la moelle osseuse sont préparées à partir des tissus prélevés par des procédures démontrées précédemment dans l’embryon de souris. L’érythropoïèse définitive a lieu dans le foie fœtal entre les jours embryonnaires 12,5 et 15,5.

souris femelles enceintes chronométrées sont préparées pour obtenir des cellules hépatiques fœtales entre les jours 12,5 à 14,5 de la grossesse. Les souris femelles enceintes sont euthanasiées et les cornes utérines sont retirées dans une boîte de Pétri contenant de la glace. Milieu de culture froid ou tampon de coloration.

Un microscope de dissection est nécessaire pour disséquer le foie fœtal à partir du 12e jour embryonnaire ou plus tôt afin de prélever des embryons de l’utérus. Séparez d’abord chaque perle de la corne. Ensuite, excise doucement la paroi de l’utérus pour libérer l’embryon qui se trouve dans son sac amniotique.

Décollez doucement la membrane amniotique. Le foie fœtal est le plus grand tissu abdominal rouge situé sous un cœur beaucoup plus petit. Pour disséquer le foie fœtal, utilisez des pinces pour immobiliser l’embryon de chaque côté du foie et poussez doucement le foie hors de l’abdomen dans le milieu.

Transférez doucement le foie dans un tube contenant un tampon de coloration frais. Une fois que tous les foies fœtaux ont été disséqués et transférés dans un tube contenant une coloration fraîche. Le tampon dissocie mécaniquement les foies par pipetage, puis filtre les cellules dissociées à travers un tamis en nylon de 40 microns lavant les cellules deux fois par centrifugation, en éliminant le surnageant et le résus en suspension dans le tampon de coloration.

Après le deuxième lavage, colorez les cellules avec du bleu trian et comptez à l’aide d’un hémocytomètre. Un foie fœtal à E 13,5 a environ 10 à la septième puissance. Les cellules sont remises en suspension à raison d’une à deux fois 10 à 10 à six cellules par échantillon de 200 microlitres pour l’analyse cytométrique en flux.

Pour les besoins de ce protocole vidéo, la coloration des anticorps pour la cytométrie en flux sera démontrée uniquement sur les cellules hépatiques fœtales. Pour commencer cette procédure, préparez un prémélange primaire de coloration d’anticorps contenant les IgG de lapin purifiés suivants pour bloquer les récepteurs FC dans les cellules de souris CD 71 FETR un 19 PE et un anticorps dirigé vers la protéine de surface cellulaire fast. Mélangez doucement la solution d’anticorps en inversant le tube deux à trois fois, ajoutez 200 microlitres de coloration primaire des anticorps pré-mélangés à l’échantillon de cellules hépatiques fœtales préalablement préparé, et pipetez doucement de haut en bas pour remettre les cellules en suspension.

Ensuite, préparez ces six échantillons de cellules témoins. Un échantillon non coloré dans lequel les cellules sont laissées dans un tampon de coloration pour fournir l’autofluorescence de fond des cellules, une seule couleur pour chaque anticorps ou une couleur utilisée dans le protocole pour corriger le chevauchement spectral entre les canaux, qui dans cette expérience sont TUR un 19 PE CD 71 fz rapide, biotine et streptavidine A PC et sept fluorescence A A DA moins un contrôle pour la biotine rapide, Ce qui fournit le véritable arrière-plan de ce canal où les cellules sont colorées avec toutes les couleurs ou anticorps du protocole, à l’exception de la biotine rapide. Incuber l’échantillon et les témoins pertinents dans la coloration primaire de l’anticorps sur de la glace pendant 45 minutes à une heure dans l’obscurité.

À la fin de l’incubation, lavez les cellules en ajoutant trois millilitres de tampon de coloration dans chaque tube d’échantillon et faites-les tourner pendant trois à cinq minutes à environ 400 fois la gravité à quatre degrés Celsius. Ensuite, appliquez le streptocoque avid dans un PC et incubez les tubes sur de la glace pendant 30 à 45 minutes. À la fin de l’incubation, lavez les cellules comme pour la première coloration d’anticorps.

Enfin, remettre les cellules en suspension dans une solution de coloration contenant le colorant cellulaire imperméable à l’ADN sept a a d pour exclure les cellules mortes. Les échantillons sont maintenant prêts pour l’analyse par cytométrie en flux. L’aspect le plus difficile de cette procédure est l’analyse correcte des événements cytométriques en flux, permettant une identification fiable des sous-ensembles d’érythroblastes.

Cela nécessite une configuration minutieuse de la machine pour tous les échantillons de contrôle corrects, une compensation minutieuse pour le chevauchement spectral et un gate ultérieur qui exclut les cellules mortes, les agrégats et les très petits événements. Au début de l’analyse des données. L’échantillon non coloré et les échantillons de contrôle de couleur unique sont utilisés pour configurer la compensation de chevauchement spectral pour chaque combinaison de couleurs.

Dans cet exemple, nous allons montrer comment la fluorescence fit e se déverse dans le canal PE et comment ce chevauchement spectral est corrigé après compensation. Tout d’abord, en utilisant le contrôle non coloré, nous définissons une région d’ajustement E positif et PE négative. Ensuite, à l’aide de la commande monocolore fit E, nous pouvons visualiser le débordement spectral dans le canal PE.

Après la compensation numérique avec le logiciel FlowJo, le débordement du signal E dans le canal PE est minimisé. Une fois compensés, les cellules mortes, les agrégats et les petits événements peuvent être éliminés. Les agrégats et les doublets de cellules sont éliminés en traçant la hauteur de diffusion vers l’avant en fonction de la zone de diffusion vers l’avant et en sélectionnant les événements à l’intérieur d’une porte diagonale étroite.

Les cellules mortes sont éliminées en sélectionnant des cellules négatives pour la mort de l’ADN imperméable à la cellule DAPI. La porte cellulaire viable négative DAPI exclut également les très petits événements tels que les noyaux ou les débris, qui ont une très faible diffusion vers l’avant. Ensuite, nous montrerons la stratégie de contrôle pour les cellules hépatiques fœtales.

Des cellules fraîchement récoltées ont été marquées pour CD 71 TUR un 19, et un cocktail d’anticorps marqués par ZI dirigé contre des marqueurs de lignées non érythroïdes. Dans cet exemple, les échantillons ont déjà été compensés pour le chevauchement spectral, puis contrôlés pour exclure les agrégats, les cellules mortes et les très petits événements. Nous utilisons l’échantillon FMO qui contient toutes les couleurs à l’exception de la coloration fitzy positive de la lignée pour tracer un histogramme fitzy et définir la porte cellulaire négative de la lignée, nous appliquons ensuite cette porte à l’échantillon de cellule hépatique fœtale qui a été coloré avec des marqueurs de lignée conjugués ZI.

Les cellules négatives de lignage sont sélectionnées et tracées avec CD 71 sur l’axe Y et TER un 19. Sur l’axe A, les cellules sont maintenant prêtes à être divisées en sous-ensembles S zéro à S cinq. Le sous-ensemble S zéro appauvri en Lin contient en grande partie des cellules avec un potentiel CFUE avant le début de la dépendance à l’EPO.

Le sous-ensemble S one contient des cellules CFUE dépendantes de l’EPO en grande partie dans la phase S du cycle cellulaire. Les cellules du sous-ensemble S deux ont perdu leur potentiel de formation de colonies et commencent à exprimer l’hémoglobine Les cellules du sous-ensemble S3 sont en grande partie basophiles Les sous-ensembles S quatre et S cinq contiennent des érythroblastes tardifs. La stratégie d’analyse suite à l’acquisition des données à partir de cellules de rate traitées et marquées avec des anticorps dirigés contre CD 71 et TER 19, ainsi que l’histogramme rapide du récepteur de la mort, est présentée

L’un montre tous les événements acquis où la porte diagonale représente des événements susceptibles d’être des cellules uniques, à l’exclusion des doublets ou des agrégats plus grands. Les cellules de cette porte sont analysées plus en détail dans l’histogramme deux ici. De très petits événements, probablement des noyaux ou des débris, sont exclus.

Les cellules dépendantes sont montrées dans l’histogramme trois où les cellules positives DAPI qui sont probablement des cellules apoptotiques perméables à la membrane sont exclues d’une analyse plus approfondie. L’histogramme quatre montre la population résultante de cellules viables de la rate. Le pro eGate contient le CD 71 TER élevé, un 19 cellules intermédiaires, un 19 cellules hautes, sont analysées plus en détail dans l’histogramme cinq.

Ici, les cellules élevées de CD 71 sont subdivisées en érythroblastes de grande surface moins matures et en érythroblastes A B plus petits et plus matures. L’expression des protéines de surface cellulaire peut être mesurée simultanément pour chacun de ces sous-ensembles en ajoutant les anticorps pertinents en même temps que TER R un 19 et CD 71. L’histogramme de coloration six montre l’expression rapide du récepteur de mort à la surface cellulaire, en particulier dans la zone A, sous-ensemble chez les souris à l’état basal et les souris injectées avec une dose unique de E ppo.

Les résultats indiquent que l’EPO supprime l’expression rapide dans la zone. L’expression in vivo d’une population de protéines intracellulaires ou l’état du cycle cellulaire peut également être mesurée pour les cellules de chaque sous-ensemble. Dans cette analyse représentative du cycle cellulaire, des souris ont reçu une injection intrapéritonéale de BRDU et la moelle osseuse a été prélevée 30 à 60 minutes plus tard.

En plus d’être colorées pour CD 71 et TER 19, les cellules ont été colorées pour l’incorporation de BRDU dans leurs cellules répliquatives D-N-A-B-R-D-U positives sont en phase S du cycle. Les cellules d’interface sont BRDU négatives et peuvent être résolues en phases G un ou G deux M. À l’aide de l’ADN, sept cellules A, A, D peuvent être triées à partir de chacun des sous-ensembles PRO E, A, A, B et A, EC.

Ici, ils sont montrés dans des préparations de cytosine, montrant une maturation séquentielle avec une diminution de la taille des cellules, une condensation nucléaire et une coloration brune croissante reflétant l’expression de l’hémoglobine. Enfin, une analyse représentative du cycle cellulaire du sous-ensemble S3 dans le foie fœtal E 13.5 est présentée ici. Des souris enceintes ont reçu une injection de BRDU.

Les foies fœtaux ont été prélevés 30 à 60 minutes plus tard, fixés et colorés avec des anticorps contre CD 71, TER un 19 et BRDU. L’état du cycle cellulaire des cellules S3 est analysé là où se trouvent les cellules de la phase S. BRDU positif et le contenu en ADN est quantifié par coloration pour le colorant ADN sept A a d.

L’approche cytométrique que nous décrivons permet d’étudier simultanément les fonctions cellulaires telles que l’expression de marqueurs de surface cellulaire et d’autres protéines, la survie cellulaire, la signalisation cellulaire à l’aide d’anticorps spécifiques du fosso et l’état du cycle cellulaire. Cela nous permet donc d’étudier les réponses moléculaires des érythroblastes, un stade de maturation différent à un large éventail de stimuli ou l’effet de mutations génétiques. Il convient de noter que les sous-ensembles de maturation de la cytométrie en flux sont définis en termes d’expression de marqueurs de surface cellulaire et de diffusion directe.

Nous avons constaté qu’en général, les cellules de chaque sous-ensemble correspondent à un stade morphologique érythroblastique similaire dans une grande variété de modèles murins. Cependant, nous vous recommandons de le vérifier lors de l’examen d’un nouveau modèle de souris. En triant les cellules de chaque sous-ensemble et en examinant leur morphologie, les cellules de chaque sous-ensemble peuvent également être triées pour l’analyse de l’ARN ou du transcriptome Les expériences de tri utilisent de faibles pressions de tri et un nez large afin de minimiser le stress sur les cellules.

Nous recommandons également de vérifier la pureté et la viabilité des cellules après chaque expérience de tri. Enfin, lors de la détection d’un changement dans la fréquence d’un sous-ensemble donné, il est important de déterminer si cela est dû à un changement réel du nombre de cellules de ce sous-ensemble ou si cela est dû à des changements dans d’autres sous-ensembles. Par conséquent, en plus de mesurer les fréquences des sous-ensembles, il est toujours nécessaire de mesurer également le nombre absolu de cellules dans chaque sous-ensemble.