Transduction des cellules humaines avec des polymères complexés Lentivirus écotrope pour Enhanced biosécurité

L'objectif général de l'expérience suivante est d'insérer des oncogènes ou d'autres gènes potentiellement dangereux dans des cellules humaines à l'aide d'un lentivirus écotrope. Cette opération est réalisée en produisant un lentivirus pantrope, codant pour le récepteur du rétrovirus murin, ainsi qu'un lentivirus écotrope codant pour le gène d'intérêt. Les cellules sont d'abord transduites avec le récepteur du rétrovirus murin, ce qui les rend sensibles à la transduction par le virus écotrope. Ensuite, les cellules sont transduites avec le virus écotrope afin d'introduire l'oncogène, en utilisant une complexation polymérique avec du polybrène et du sulfate de chondroïtine pour améliorer l'efficacité de la transduction. Les résultats obtenus montrent une transduction sélective des cellules humaines par le lentivirus écotrope, comme en témoignent la microscopie fluorescente et les analyses FACTS.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la transduction par rétrovirus gamma, est que les particules lentivirales peuvent transduire de manière plus efficace de nombreux types cellulaires, y compris les cellules non divisantes telles que les cellules souches. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le cancer et les cellules souches, notamment à mieux comprendre la fonction de gènes candidats oncogènes. Avant de commencer cette procédure, consultez l'agent de sécurité de votre établissement et suivez les consignes de sécurité recommandées.

Commencez avec une culture de cellules 293T saines et en prolifération rapide, manipulées dans une hotte de culture tissulaire. Dans des conditions aseptiques, resuspendez cinq fois 10 puissance 6 cellules 293T dans 10 millilitres de milieu 293T sans antibiotique. Transférez la suspension cellulaire dans une plaque de culture tissulaire de 10 centimètres et incubez-la toute la nuit dans une incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Le lendemain, commencez la transfection en fin d'après-midi. Prélevez d'abord un aliquot d'Optum ainsi que les plasmides de transfert, d'emballage et d'enveloppe, puis laissez-les atteindre la température ambiante. Pipetez 375 microlitres d'optimum dans un tube microcentrifuge, puis ajoutez 25 microlitres de réactif de transfection FU gene HD. Veillez à ce que le réactif FU gene soit pipeté directement dans le milieu et ne touche pas la paroi du tube.

Ensuite, dans un deuxième tube de microcentrifugeuse, mélanger cinq microgrammes du plasmide de transfert, 3,75 microgrammes du plasmide d’emballage et 1,25 microgramme du plasmide d’enveloppe dans la quantité requise d’OptiMEM pour obtenir un volume final de 100 microlitres. Puis ajouter le mélange OptiMEM/Fuji au tube contenant le mélange de plasmides et incuber à température ambiante pendant 20 à 30 minutes. Pendant les dernières minutes de l’incubation, aspirer très doucement le milieu du plateau contenant les cellules 293T et le remplacer par 10 millilitres de milieu 293T frais sans antibiotique.

Enfin, ajoutez goutte à goutte le mélange de plasmide du gène FU dans le milieu de la plaque de 10 centimètres. Placez la plaque dans une étuve à culture cellulaire réglée à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, et incubez toute la nuit. Le jour suivant, aspirez très délicatement le milieu de la plaque et remplacez-le par du milieu 2 9 3 T frais sans antibiotique.

Ensuite, remettez la plaque dans l'incubateur de culture tissulaire et incubez-la pendant deux jours supplémentaires. Trois jours après la transfection, aspirez le milieu contenant le virus à partir de la plaque et filtrez-le à l’aide d’un filtre de 0,45 micron à faible liaison aux protéines. Après filtration, serrez le virus pour obtenir un virus concentré, puis effectuez des dilutions sérielles d’un virus témoin fluorescent dans un milieu frais sans antibiotique contenant six microgrammes par millilitre de polybrene, et utilisez ces dilutions pour transduire les cellules de la lignée cellulaire appropriée. Le jour suivant, dans une plaque de 24 puits, remplacez le milieu par du milieu frais sans antibiotique, puis poursuivez l’incubation pendant deux jours supplémentaires afin de permettre aux cellules d’exprimer la protéine fluorescente.

Utilisez les données obtenues pour déterminer la fraction de cellules transduites pour chaque dilution virale. Calculez ensuite le titre en unités transformantes par millilitre, en vous basant sur les dilutions qui produisent moins de 15 % de transduction, afin de minimiser les événements de transduction multiples. On suppose que les titres des autres lentivirus non fluorescents produits en parallèle sont similaires à celui du virus fluorescent.

Pour transduire les cellules cibles, commencez par sélectionner une multiplicité d'infection supérieure à deux afin de garantir que la majorité des cellules seront transduites. Diluez d'abord le surnageant viral à la multiplicité d'infection requise dans un milieu de culture complet frais, supplémenté avec six microgrammes par millilitre de polybrene, jusqu'à un volume final d'un millilitre.

Aspirez le milieu d'une plaque de 35 millimètres contenant les cellules cibles et ajoutez un millilitre de surnageant viral dilué. Incubez dans l'incubateur de culture tissulaire pendant 24 à 48 heures afin d'obtenir une expression suffisante du récepteur SLC7A1 si désiré. Utilisez une sélection antibiotique avec la blasticidine pour sélectionner les cellules transduites de façon stable exprimant SLC7A1, conformément aux instructions décrites dans la procédure écrite.

Pour commencer la détermination de la toxicité, préparez une solution mère de 20 milligrammes par millilitre de sulfate de chondroïtine et une solution mère de 20 milligrammes par millilitre de poly cerveau dans de l'eau, puis filtrez de manière stérile. Les solutions mères en excès peuvent être conservées à moins 20 degrés Celsius jusqu'à utilisation.

Ensuite, déterminez le nombre de cultures cellulaires en plaques de 96 puits nécessaire pour évaluer avec précision la toxicité du complexe polymère. À l'aide du test au MTT, au moins six concentrations de sulfate de chondroïtine et de poly green doivent être testées en triplets. En outre, incluez des cellules non traitées et des cellules cultivées sans sérum.

Un milieu doit être inclus afin de fournir une référence pour des cellules saines et de contrôler respectivement l'arrêt de la croissance. Une fois le nombre de puits requis déterminé, ensemencer 5 000 cellules cibles dans chaque puits d'une plaque de 96 puits, parallèlement à des cellules ensemencées dans une plaque de 24 puits pour une analyse microscopique ou fondée sur des faits de l'efficacité de la transduction dans chaque condition expérimentale, puis laisser les deux lots de cellules croître pendant la nuit. Le lendemain, prélever un aliquot de la solution mère de sulfate de chondroïtine et un aliquot de la solution mère de polybrain.

Ensuite, diluez le virus codant pour la GFP dans un milieu sans antibiotique contenant six microgrammes par millilitre de polybrain à une multiplicité d'infection suffisante pour transduire environ 10 à 50 % des cellules cibles par puits. Assurez-vous qu'il y a suffisamment de virus dilué pour chaque condition testée ainsi que pour les puits témoins sur chaque plaque. Étiquetez un ensemble de tubes avec chaque concentration de sulfate de chondroïtine et de polymère polygreen à tester.

Ensuite, aliquoter une quantité suffisante de la suspension virale pour chaque condition en triple exemplaire dans les tubes. Puis, prélever au pipetage le volume requis de sulfate de chondroïtine et de solution mère de poly cerveau afin d'obtenir les concentrations d'essai, et ajouter successivement dans chacun des tubes. Immédiatement après l'ajout de sulfate de chondroïtine et de poly vert, agiter brièvement le tube pour homogénéiser.

Laisser les mélanges de virus, de chondroïtine sulfate et de polyvert incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Le mélange peut devenir trouble à mesure que les précipités viraux se forment. Après l'incubation, aspirer le milieu des puits de la plaque de 96 puits.

Ensuite, ajouter le mélange de virus, de sulfate de chondroïtine et de polyvert au(x) puits selon le plan prévu. Pipeter également le milieu contrôle et le milieu sans sérum dans les puits appropriés. Répéter le processus pour la plaque de 24 puits et incuber toute la nuit dans l'incubateur de culture tissulaire.

Ensuite, aspirez le milieu contenant le virus à partir des plaques et remplacez-le par du milieu frais. Replacez les plaques dans l'incubateur pendant 48 heures. Après 48 heures, retirez la plaque 24 puits et utilisez les faits pour analyser l'efficacité de transduction de chaque concentration de sulfate de chondroïtine et de poly-cerveau.

Le lendemain, aspirez le milieu de tous les puits de la plaque 96 puits et remplacez-le par 100 microlitres de solution de MTT. Incubez pendant trois heures dans un incubateur humidifié afin de permettre la réduction du MTT dans les mitochondries des cellules métaboliquement actives. Après trois heures, aspirez la solution de MTT et remplacez-la par 200 microlitres de solution solvant.

Incuber la plaque pendant deux heures à température ambiante ou jusqu'à ce que tout le MTT violet formé et le précipité soient dissous. Lire l'absorbance sur un lecteur de microplaque à 570 nanomètres, en soustrayant la mesure de fond à 690 nanomètres. La concentration optimale du polymère produira une amélioration maximale de la transduction, déterminée par des faits, avec un effet minimal sur l'activité métabolique, déterminée par le test au MTT pour hdfs.

100 microgrammes par millilitre de sulfate de chondroïtine. Poly brain est la concentration optimale de polymère déterminée par cette méthode. Préparez d'abord suffisamment de mélange de surnageant viral poly green contenant 100 microgrammes par millilitre de sulfate de chondroïtine pour transduire le nombre requis de boîtes de 35 millimètres de cellules HDF exprimant le récepteur SLC seven A one. Incubez le mélange pendant cinq minutes pour permettre la formation des complexes polymériques.

Ensuite, aspirez le milieu des cellules cibles exprimant le récepteur et remplacez-le par le mélange viral. Incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après avoir retiré le mélange viral, lavez la surface des cellules deux fois avec du PBS afin d'éliminer les complexes viraux. Une élimination complète n'est pas nécessaire, car aucun effet néfaste sur la santé cellulaire n'a été observé en présence de complexes polymériques résiduels.

Cette image de microscope à fluorescence illustre une transduction suffisante de cellules humaines de sarcome exprimant de façon stable SLC seven A one avec un virus tropique, lorsqu'on utilise des vecteurs témoins fluorescents pour surveiller l'efficacité de la transduction. La quantification de la fluorescence par analyse fax révèle une efficacité de transduction supérieure à 90 %. Les taux de transduction des HDFS sont généralement plus faibles, car les cellules n'ont pas été activées ni sélectionnées pour l'expression du récepteur ; les titres de lentivirus atropique mesurés sur S-L-C-H-S-C représentent généralement 10 à 20 % de ceux du virus pseudotypé VSV. Le test de viabilité MTT permet une détection sensible de l'arrêt de croissance dans les cellules cibles, comme observé ici, après transduction avec le virus en présence de concentrations de sulfate de chondroïtine.

Des concentrations de poly cerveau allant jusqu'à 800 microgrammes par millilitre n'ont aucun effet sur le métabolisme des HDF. Analyse par télécopie des HDF transduits par le virus en présence de diverses concentrations de sulfate de chondroïtine. Le poly vert montre une amélioration de la transduction par rapport au poly vert seul.

L'effet d'amélioration maximal se produit à 100 microgrammes par millilitre. Le poly-sulfate de chondroïtine cérébral est plusieurs fois inférieur aux valeurs précédemment rapportées. Ainsi, il est important d'optimiser les conditions de complexation avec le sulfate de chondroïtine pour tout type cellulaire donné.

Poly cérébral améliore le titre observé, d'environ trois fois dans S-L-C-H-S-C. En pratique, cela produit un effet plus marqué sur l'efficacité de transduction à de faibles concentrations de virus qu'à des concentrations plus élevées, ce qui est très probablement dû à la présence de multiples cellules transduites et à la saturation des récepteurs à des concentrations élevées de virus. La transduction avec un virus tropique est spécifique des cellules exprimant le récepteur rétroviral neuronal.

Lors de la transduction de cellules humaines non modifiées à l'aide d'un virus tropique, une fluorescence supérieure au fond non réduit n'a pas été observée, comme le montre l'analyse par microscopie. Les HDFS ne montrent aucune transduction en l'absence de récepteur, tandis que la pré-transduction avec récepteur donne lieu à des cellules fluorescentes. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de se rappeler de vérifier que le virus ne transduira pas les cellules humaines modifiées.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser un lentivirus trophique pour délivrer des gènes potentiellement dangereux à des cellules humaines, y compris l'utilisation de la complexation par polymère pour améliorer la transduction.