Name: Transduction des cellules humaines avec des polymères complexés Lentivirus écotrope pour Enhanced biosécurité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 3 s
Description: Découvrez la transduction de cellules humaines avec un lentivirus écotrope complexé à des polymères pour une biosécurité renforcée. Cette méthode permet d'introduire des oncogènes en toute sécurité.

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Le financement de ce projet était prévu par le California Institute for Regenerative.

1. Production, récolte et congélation du lentivirus
<ol>
	<li>Consultez votre responsable de la sécurité institutionnelle avant de commencer ce protocole et suivez ses recommandations en matière de consignes de sécurité.</li>
	<li>Jour 1. Commencez avec des cellules 293T saines et en croissance rapide pour produire le virus. Ensemencez les cellules à raison de 5 x 106 
	cellules par plaque de 10 cm. Utilisez un milieu 293T sans antibiotique (DMEM à haute teneur en glucose contenant 10 % de FBS et 4 mM de L-glutamine) pour la production du virus.</li>
	<li>Jour 2. En fin d'après-midi, transfectez les cellules 293T comme suit (les quantités indiquées correspondent à une plaque de 10 cm). 
	Laissez tous les réactifs atteindre la température ambiante. Prélevez 375 μl d'OptiMEM dans un tube de microcentrifugeuse, puis ajoutez 25 μl 
	de Fugene HD. Veillez à ce que le Fugene non dilué n'entre pas en contact avec la paroi du tube.</li>
	<li>Dans un tube de microcentrifugeuse, mélangez :
		<ul>
			<li>5 μg de plasmide de transfert (Slc7a1, vecteur cible ou vecteur contrôle fluorescent)</li>
			<li>3,75 μg de plasmide d’emballage (pCMV-dR8.91 ou psPax2)</li>
			<li>1,25 μg de plasmide d’enveloppe (pMD2.G pour pantropique, pHCMV-EcoEnv pour écotropique)</li>
			<li>OptiMEM sans sérum jusqu’à un volume final de 100 μl</li>
		</ul>
	</li>
	<li>Combinez les contenus des deux tubes et incubez le mélange 20 à 30 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Remplacez le milieu des cellules 293T par 10 ml de milieu 293T frais sans antibiotique. Ajoutez goutte à goutte le mélange Fugene/plasmide sur la plaque et incubez toute la nuit à 37°C, 5 % CO2.</li>
	<li>Jour 3. Remplacez le milieu des cellules 293T par 10 ml de milieu 293T frais sans antibiotique. Soyez délicat, 
	car les cellules 293T adhèrent faiblement et peuvent se détacher si le milieu est pipetté trop brutalement sur la 
	couche monocellulaire. Incubez pendant deux jours dans un incubateur humidifié pour la production du virus.</li>
	<li>Jour 5. Récupérez le virus et filtrez-le à l’aide d’un filtre à faible liaison aux protéines de 0,45 mm. Utilisez immédiatement ou répartissez en aliquots à usage unique et congélez à -80°C. Le virus pantropique et écotropique congelé doit être réétalonné après un stockage de six mois et un mois respectivement.</li>
	<li>Étalez la concentration du virus comme suit, en utilisant des cellules relativement sensibles à la transduction. Transduisez les cellules avec le virus contrôle fluorescent pendant une nuit en utilisant des dilutions sériées (par exemple 1:10, 1:100, 1:1000) dans du milieu frais contenant 6 μg/ml de PB. Remplacez par du milieu frais le lendemain. Laissez aux cellules deux jours après la transduction pour commencer à exprimer la protéine fluorescente, puis déterminez la fraction de cellules transduites par cytométrie en flux (FACS). Calculez la concentration en unités transformantes (TU) par ml, en vous basant sur les dilutions produisant &lt; 15 % de transduction afin de minimiser les événements de transduction multiples. 
	<img src="/files/ftp_upload/2822/2822eq1.jpg" alt="Formule de calcul de la concentration, équation de quantification virale, analyse mathématique en virologie." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Équation 1">
	</li>
</ol>
2. Transduction de cellules cibles humaines avec le récepteur de rétrovirus murin Slc7a1
<ol>
	<li>Choisir une multiplicité d'infection (MOI) = 2 afin de garantir que la majorité des cellules seront transduites. Pour les cellules cibles résistantes à la transduction, comme les HDF, un MOI plus élevé sera nécessaire ; nous diluons le surnageant viral uniquement à 1:2 afin d'obtenir la transduction de la majorité des cellules.</li>
	<li>Transduire les cellules cibles pendant la nuit avec le surnageant viral dilué dans un milieu de culture frais contenant 6 μg/ml de PB, ce qui augmente la transduction en renforçant l'interaction électrostatique entre le virus et la cellule cible.1 Idéalement, on devrait utiliser un volume minimal de virus, par exemple 1 ml pour une plaque de 35 mm, car la diffusion constitue un facteur limitant pour l'efficacité de la transduction.</li>
	<li>Cultiver les cellules pendant au moins 48 heures après retrait du virus avant de les transduire avec un virus écotrope, afin de s'assurer d'une expression suffisante du récepteur Slc7a1.</li>
	<li>(Facultatif) Il est possible d'utiliser la blasticidine pour sélectionner les cellules transduites de façon stable exprimant Slc7a1, si souhaité. Une courbe de sélection à la blasticidine doit être établie préalablement afin de déterminer la concentration minimale efficace, généralement comprise entre 2 et 10 μg/ml, qui élimine toutes les cellules cibles non transduites en 7 jours. Environ 2 jours après le retrait du virus Slc7a1, transférer les cellules transduites dans un milieu contenant de la blasticidine. Cultiver les cellules dans un milieu contenant de la blasticidine pendant 7 jours ; à ce stade, toutes les cellules restantes exprimeront de façon stable le récepteur du rétrovirus et pourront alors être transduites avec un virus écotrope, tout en étant conservées pour une utilisation future sous forme d'une lignée stable exprimant Slc7a1.</li>
</ol>
3. Titration du complexe polymère pour déterminer la toxicité
<ol>
	<li>Jour 1. Ensemencer les cellules à raison de 5000 cellules/puits dans une plaque de 96 puits, en prévoyant au moins trois puits par groupe expérimental. Inclure des cellules non transduites en milieu complet afin d'obtenir une valeur de référence pour des cellules saines, ainsi que des échantillons composés de cellules en milieu sans sérum pour induire un arrêt de croissance servant de contrôle. Parallèlement, ensemencer les cellules dans un format approprié (par exemple une plaque de 24 puits) pour une analyse microscopique ou par cytométrie en flux (FACS) de l'efficacité de transduction dans chaque condition expérimentale.</li>
	<li>Jour 2. Transduire les cellules dans les plaques préparées pour les analyses MTT et FACS avec un virus codant pour la GFP, à une dose d'infection (MOI) de 0,5 afin de transduire environ 40 % des cellules cibles. Tester différentes concentrations de CS/PB (par exemple 50, 100, 200, 400, 600 et 800 mg/ml de chaque composant), ainsi que 6 μg/ml de PB, afin de déterminer les quantités optimales. Préparer les complexes polymériques comme décrit dans la partie 4 ci-dessous.</li>
	<li>Jour 3. Retirer le milieu contenant le virus et le remplacer par du milieu frais. Remettre les plaques dans un incubateur humidifié.</li>
	<li>Jour 5. Analyser la plaque FACS afin de déterminer l'efficacité de transduction pour chaque concentration de polymère.</li>
	<li>Jour 6. Retirer le milieu de tous les puits de la plaque MTT et les remplacer par 100 μl de solution de MTT (1 mg/ml de MTT en milieu complet). Incuber pendant trois heures dans un incubateur humidifié afin de permettre la réduction du MTT dans les mitochondries des cellules métaboliquement actives.</li>
	<li>Retirer la solution de MTT et la remplacer par 200 ml de solvant de MTT (0,1 N HCl, 0,1 % Igepal CA-630 dans l'isopropanol).</li>
	<li>Incuber pendant deux heures à température ambiante ou jusqu'à dissolution complète du précipité violet de formazan MTT. Lire l'absorbance sur un lecteur de microplaques à 570 nm, en soustrayant la valeur du fond mesurée à 690 nm.</li>
	<li>Sélectionner la concentration optimale de polymère produisant un renforcement maximal de la transduction, tel que déterminé par la FACS, avec un effet minimal sur l'activité métabolique, tel que déterminé par le test MTT. Pour les HDF, nous avons sélectionné une concentration de 100 μg/ml de CS/PB, sur la base des données présentées dans les résultats représentatifs ci-dessous.</li>
</ol>
4. Transduction écotrope avec complexation par polymère
<ol>
	<li>Préparez des solutions mères stériles filtrées de PB et de sulfate de chondroïtine à 20 mg/ml dans de l’eau. Aliquoter et conserver à -20°C.</li>
	<li>Prélèvez le surnageant viral dans un tube de microcentrifugeuse et diluez-le jusqu’à la concentration finale souhaitée (par exemple, une MOI de 2) avec du milieu de culture frais. Ajoutez successivement des volumes égaux de PB et de sulfate de chondroïtine (concentrations déterminées à l’étape 3 ci-dessus), en agitant légèrement le tube après chaque ajout pour homogénéiser. Le mélange viral devient immédiatement trouble avec la formation de précipités. Incubez le mélange viral à température ambiante pendant 5 minutes pour permettre la formation des complexes.</li>
	<li>Retirez le milieu des cellules cibles exprimant le récepteur, remplacez-le par le mélange viral et incubez toute la nuit à 37°C, 5 % CO2. Après avoir retiré le mélange viral, lavez la surface des cellules deux fois avec du PBS afin d’éliminer les complexes viraux. Une élimination complète n’est pas nécessaire ; nous n’avons observé aucun effet néfaste sur la santé cellulaire lié à la présence de complexes polymériques résiduels.</li>
</ol>
5. Vérification de la spécificité de la transduction écotrope
<ol>
	<li>Lorsque vous produisez pour la première fois un virus écotropic, il est prudent, pour des raisons de sécurité, de vérifier que le virus est incapable de transduire des cellules humaines non modifiées. Transduisez des cellules humaines avec un lentivirus écotropic à une concentration relativement élevée (seulement une dilution 1 à 2 fois du surnageant viral dans un milieu frais) pendant une nuit avec 6 μg/ml de PB ou une concentration optimisée de CS/PB.</li>
	<li>Éliminez le milieu contenant le virus et remplacez-le par du milieu frais. Après avoir incubé les cellules pendant 2 jours, validez l'expression du transgène par cytométrie en flux (FACS) en utilisant des vecteurs fluorescents et/ou par RT-PCR avec des amorces spécifiques du transgène.</li>
</ol>
6. Résultats représentatifs :
La figure 1A illustre le processus de production du lentivirus, et la figure 1B montre la transduction de cellules humaines avec un lentivirus écotropic, incluant une pré-transduction avec le récepteur rétroviral murin Slc7a1. Pour la titration du virus, nous utilisons une lignée cellulaire humaine de rhabdomyosarcome stably transduite avec Slc7a1 (Slc-hRMS). Lorsque nous utilisons des vecteurs témoins fluorescents pour surveiller l'efficacité de la transduction, nous atteignons couramment une efficacité de transduction > 90 % des cellules Slc-hRMS avec le virus écotropic, comme illustré aux figures 2A et 2B. Les taux de transduction des HDF sont généralement plus faibles car les cellules n'ont pas été sélectionnées au blasticidin pour l'expression du récepteur (figure 2C). Les titres du lentivirus écotropic sont généralement de 10 à 20 % de ceux du virus pseudotypé avec VSV lorsqu'ils sont mesurés sur les cellules Slc-hRMS (figure 2D).
Un cycle de congélation-décongélation réduit le titre du virus écotrope de 16 à 3 %, ce qui équivaut à la perte de titre observée lors d'un cycle unique de congélation-décongélation du virus pseudotypé avec VSV (p &gt; 0,05). Contrairement à des rapports antérieurs,2 nous n'observons aucun effet positif sur le titre viral lié à la congélation rapide dans de la glace sèche. Au contraire, nous obtenons des titres post-décongélation plus élevés pour chaque pseudotype en plaçant simplement les tubes contenant le virus dans un congélateur à -80 °C (données non montrées).
Le test de viabilité au MTT permet une détection sensible de l'arrêt de la croissance des cellules cibles. La transduction par le virus en présence de concentrations de CS/PB allant jusqu'à 800 μg/ml n'a aucun effet sur le métabolisme des HDF (Fig. 3A). L'exposition à CS/PB en l'absence de virus n'exerce également aucun effet toxique sur les cellules (données non montrées). L'analyse par cytométrie en flux des HDF transduites avec le virus et diverses concentrations de CS/PB montre une amélioration de la transduction par rapport au PB seul (Fig. 3B). L'amélioration maximale est observée à 100 μg/ml de CS/PB (Fig. 3C), soit une concentration plusieurs fois inférieure aux valeurs rapportées précédemment.3 Il est donc essentiel d'optimiser les conditions pour chaque type cellulaire cible.
La complexation avec CS/PB augmente d'environ trois fois le titre observé dans les Slc-hRMS (Fig. 4A, p &lt; 0,01). En pratique, cet effet est plus marqué sur l'efficacité de transduction à de faibles concentrations de virus qu'à des concentrations plus élevées (Fig. 4B), ce qui est très probablement dû à une transduction multiple des cellules et à la saturation des récepteurs à des concentrations élevées de virus.
La transduction par un virus écotrope est spécifique aux cellules exprimant le récepteur du rétrovirus murin. Lors de la transduction de cellules humaines non modifiées par un virus écotrope, nous n'avons observé aucune fluorescence supérieure au fond de non-transduction, qu'il s'agisse d'utiliser PB ou CS/PB, comme illustré à la figure 5A. Au microscope, les HDF ne montrent aucune transduction en l'absence de récepteur (fig. 5B), tandis que la pré-transduction avec le récepteur entraîne l'apparition de cellules fluorescentes (fig. 5C).
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig1.jpg" alt="Schéma du processus de production de lentivirus, illustrant la transduction de cellules 293T et les étapes du surnageant viral." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1. Vue schématique de (A) la production du virus et de (B) la transduction de cellules humaines exprimant le récepteur rétroviral murin suivi d'un lentivirus écotrope.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig2.jpg" alt="Graphiques de cytométrie en flux, analyse du pourcentage de cellules GFP+, microscopie de fluorescence, histogramme de titrage viral." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2. Transduction hautement efficace de cellules humaines avec un lentivirus écotrope codant pour GFP. Les cellules ont été préalablement transduites avec le récepteur rétroviral murin Slc7a1. (A) Ligne cellulaire humaine de rhabdomyosarcome sélectionnée au blasticidin pour l'expression de Slc7a1 (Slc-hRMS), transduite (bleu) ou non transduite (rose) avec GFP. (B) Micrographie fluorescente de cellules Slc-hRMS transduites avec le virus écotrope (4X). (C) Fibroblastes dermiques humains (HDF) transduits (bleu) et non transduits (rose) avec un lentivirus écotrope codant pour GFP ; les cellules ont été transduites avec Slc7a1 deux jours avant la transduction écotrope. (D) Titre du lentivirus pseudotypé avec VSV-G et du lentivirus écotrope, mesuré sur les cellules Slc-hRMS.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig3.jpg" alt="Effets de la concentration du polymère sur l'expression de la GFP ; graphiques d'absorbance, de cytométrie en flux et de pourcentage de GFP." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3. Optimisation des concentrations de sulfate de chondroïtine/polybrene (CS/PB) dans les fibroblastes dermiques humains. (A) Viabilité des fibroblastes dermiques humains mesurée par le test au MTT après transduction en présence de PB seul ou de différentes concentrations de CS/PB. (B) Amélioration de l'efficacité de transduction dans les fibroblastes dermiques humains par différentes concentrations de CS/PB, mesurée par cytométrie en flux (FACS). (C) Quantification de l'amélioration de la transduction, montrant que la transduction maximale est obtenue à 100 μg/ml de CS/PB.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig4.jpg" alt="Efficacité de la transduction génique par rapport à l'analyse de la concentration, graphique à barres et nuage de points, comparaison de l'effet du polybrene." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4. Effet de 400 μg/ml de CS/PB sur la transduction de Slc-hRMS avec un lentivirus écotrope. (A) Augmentation de la concentration, et (B) facteur d'augmentation du taux de transduction par rapport à 6 μg/ml de polybrene seul.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig5.jpg" alt="Graphique d'intensité de fluorescence GFP en cytométrie en flux accompagné d'images de microscopie montrant la distribution des cellules GFP+" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5. Absence de transduction écotrope des HDF en l'absence du récepteur viral rétroviral murin Slc7a1. (A) Graphique FACS de fibroblastes humains BJ, non transduits (rose) ou transduits (bleu) avec un lentivirus GFP écotrope, dans les deux cas en absence du récepteur Slc7a1. Fibroblastes humains BJ transduits avec un lentivirus GFP écotrope, sans (B) et avec (C) pré-transduction du récepteur Slc7a1 (4X).

<ol><li>Davis, H. E., Rosinski, M., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charged+polymers+modulate+retrovirus+transduction+via+membrane+charge+neutralization+and+virus+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation.</a> Biophys J. 86, 1234-1242 (2004).</li>
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</ol>

Recombinant GAMMARETROVIRUS écotrope à base de virus leucémie murine de Moloney (MLV) et ses récepteurs mSlc7a1 sont bien étudiés et largement disponible, ayant été utilisé pendant plus de 20 ans pour fournir des transgènes dans les cellules murines. GAMMARETROVIRUS écotrope a aussi été utilisée plus récemment pour offrir oncogènes dans les cellules humaines;. Dans le contexte de la reprogrammation cellulaire, l&#39;utilisation de mSlc7a1 pour éviter la production de virus oncogènes humains amphotropes hébergement est bien établi 4,5 Cependant, lentivirus fournit des avantages significatifs sur GAMMARETROVIRUS dans la transduction de populations de cellules réfractaires, y compris les 6 cellules primaires qui sont souvent la cible souhaitable pour la reprogrammation, parce que les lentivirus de pré-intégration complexe permet la transduction des cellules ne se divisant 7. Les lentivirus ont été produites avec des dizaines de pseudotypes différents, y compris les MLV, dans un effort pour modifier le tropisme du virus, la toxicité et d&#39;autres propriétés. 8 lentivirus écotrope MLV pseudotypé a été utilisé pour transduire des cellules de souris, 9, mais a rarement été utilisée sur des cellules humaines 10. Nous proposons donc l&#39;utilisation de MLV-pseudotypées lentivirus écotrope comme un véhicule sûr, rentable et très efficace pour livrer des oncogènes connus ou présumés, y compris les facteurs cellulaires reprogrammation, pour les cellules humaines. Il est essentiel de noter que ce protocole n&#39;est pas entièrement éliminer le besoin de produire et d&#39;utiliser des lentivirus pantropique, mais plutôt ce protocole sépare l&#39;oncogène (s) du virus de la pantropique, isolation des chercheurs de potentiel d&#39;auto-inoculation avec des virus liés au cancer. Le mSlc7a1 protéine et son homologue humain sont hSlc7a1 exprimée de manière ubiquitaire transporteurs d&#39;acides aminés avec aucune tumorigénicité connus ou capacité à conférer un avantage de croissance sélective sur les cellules réceptrices, 11 mSlc7a1 prise de risque relativement faible pour l&#39;incorporation dans virus amphotrope. Cette étape ajoutée peut être particulièrement utile dans les laboratoires manquent de virus dédiés ou des installations de culture tissulaire du niveau requis de biosécurité. Dans certaines situations, il peut être possible d&#39;éliminer complètement l&#39;utilisation de virus pantropique en transfectant le plasmide Slc7a1 directement dans les cellules cibles, mais de nombreuses cellules qui seraient des cibles utiles de cette technique sont aussi réfractaires à la transfection. Comme alternative, la possibilité d&#39;isoler les cellules transduites-Slc7a1 par sélection blasticidine signifie que VSV-G lentivirus pseudotypées peut être utilisée qu&#39;une fois pour générer un stock de cellules exprimant le récepteur, après quoi le virus écotrope peut être utilisée en routine pour la transduction de ces cellules pour de nombreux expériences. Les chercheurs devraient toujours suivre leurs directives de sécurité institutionnel pour travailler avec toute lentivirus, quel que soit son tropisme. Les titres de virus écotrope obtenus avec ce protocole sont modérément plus faible que le virus VSV-pseudotypées, généralement à 10-20% du titre du virus pantropique, en accord avec les études précédentes. 9 Ces titres ont été mesurés dans les cellules humaines transduites avec Slc7a1 stablement, de sorte que le plus faible titre observé pour le virus écotrope peut être en partie due à l&#39;expression variée du gène du récepteur dans les cellules cibles. Néanmoins, les titres viraux obtenus dans notre protocole sont plus que suffisantes pour la plupart des applications et conduire à la transduction de la majorité des cellules, dans certains cas&gt; 90% des cellules. Centrifugation basé techniques sont couramment utilisées pour concentrer les particules virales. Toutefois, la centrifugation nécessite plusieurs heures, génère des aérosols infectieux, et peut entraîner une perte importante de particules virales. 12 Comme alternative, la complexation avec CS / PB peut être utilisé pour améliorer la transduction sans altérer le tropisme viral. 3 Cette méthode est rapide (5 minutes ) et peu coûteux (0,03 $ par tranche de 10 virus ml), tandis qu&#39;environ tripler le titre observé. Aucun équipement spécial ou de réactifs de propriété sont nécessaires, et nous avons observé un minimum de toxicité aiguë après exposition des HDFS à CS / PB, en accord avec des travaux antérieurs dans d&#39;autres lignées cellulaires. 13 Un inconvénient potentiel de ce protocole est que certains complexes visibles au microscope polymères adhèrent à les cellules pendant plusieurs jours dans la culture. Nous ne pouvons pas exclure la possibilité que ces complexes, tout en n&#39;étant pas manifestement toxiques pour les cellules, peuvent avoir des effets plus subtils sur les processus cellulaires. Ici, nous avons décrit une méthodologie pour sûr et efficace de transduction des cellules humaines avec des facteurs oncogènes. Cette approche devrait être d&#39;une grande utilité pour les chercheurs qui étudient les oncogènes et biologie des cellules souches, y compris les cellules iPS.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> pLenti6/UbC/mSlc7a1 </td><td> Addgene </td><td> 17224 </td><td> Murin MLV récepteurs </td></tr><tr><td> pMD2.G </td><td> Addgene </td><td> 12259 </td><td> VSV-G enveloppe </td></tr><tr><td> pCMV-dR8.91 </td><td> D. Trono de laboratoire 14 </td><td></td><td> Emballage plasmidique (équivalent psPax2 plasmide est disponible à partir Addgene, Cat. Numéro 12260) </td></tr><tr><td> pHCMV-EcoEnv </td><td> Addgene </td><td> 15802 </td><td> Enveloppe écotrope </td></tr><tr><td> FUGW </td><td> Addgene </td><td> 14883 </td><td> GFP plasmide de contrôle </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche </td><td> 04 709 705 001 </td><td></td></tr><tr><td> Hexadiméthrine bromure (Polybrène) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9268 </td><td></td></tr><tr><td> Le sel de chondroïtine sulfate de sodium à partir de cartilage de requin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4384 </td><td></td></tr><tr><td> Blasticidine S </td><td> Fisher </td><td> BP 2647100 </td><td></td></tr><tr><td> Methylthiazolyldiphenyl-tétrazolium (MTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2128 </td><td></td></tr><tr><td> Igepal CA-630 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I3021 </td><td></td></tr></tbody></table>

transduction des cellules humaines avec des polymères complexés lentivirus écotrope pour enhanced biosécurité

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Des études souches et la biologie des cellules tumorales ont souvent besoin de transduction virale des cellules humaines avec des oncogènes connus ou suspectés, soulevant des questions de sécurité majeur pour le personnel de laboratoire. Lentivirus pantropique, comme le couramment utilisé VSV-G pseudotype, sont un outil précieux pour étudier la fonction des gènes, car ils peuvent transduire nombreux types cellulaires, y compris les cellules ne se divisent pas. Cependant, les chercheurs peuvent souhaiter éviter la production et la centrifugation de virus oncogènes pantropique encodage raison de la hausse des exigences de biosécurité de niveau et de manipulation des questions de sécurité. Plusieurs oncogènes puissants, y compris c-Myc et antigène T de SV40 grandes, sont connus pour augmenter la production de cellules souches pluripotentes induites (COPSi). Tous les autres connus iPSC induisant des modifications génétiques (Oct4, Sox2, KLF4, NANOG, LIN28, et la perte de fonction de p53) ont également des liens vers le cancer, les rendant de préoccupation de sécurité relativement élevé ainsi. Bien que ces virus liés au cancer sont utiles dans l&#39;étude de la reprogrammation cellulaire et de pluripotence, ils doivent être utilisés en toute sécurité. Pour répondre à ces questions de biosécurité, nous démontrons une méthode pour la transduction des cellules humaines avec des lentivirus écotrope, avec un accent supplémentaire sur un coût réduit et manipulation aisée. Nous avons produit des lentivirus écotrope avec titre suffisamment élevé pour transduire supérieure à 90% de cellules exprimant le récepteur humain exposé au virus, de valider l&#39;efficacité de cette approche. Lentivirus est souvent concentrés par ultracentrifugation; cependant, ce processus prend plusieurs heures et peuvent produire des aérosols infectieux à l&#39;homme les chercheurs biomédicaux. Comme alternative, les particules virales peuvent être de manière plus sûre sur les cellules sédimentées par complexation avec le sulfate de chondroïtine et de polybrène (CS / PB). Cette technique augmente le titre fonctionnelle virale jusqu&#39;à 3 fois dans des cellules exprimant de façon stable des récepteurs rétrovirus murin, avec le temps et le coût ajouté négligeables. La transduction des fibroblastes dermiques humains (HDFS) est améliorée en utilisant au maximum CS / PB concentrations d&#39;environ 4 fois inférieure à la valeur optimale antérieurement pour des lignées cellulaires cancéreuses, ce qui suggère que la concentration du polymère doit être adaptée pour le type de cellules cibles d&#39;intérêt. Nous avons donc décrire l&#39;utilisation du bromure de tétrazolium-methylthiazolyldiphenyl (MTT) pour le dosage de la toxicité de polymère dans un type de cellules nouvelles. Nous observons la viabilité équivalent de HDFS après transduction virale en utilisant soit la complexation polymère ou la dose standard de polybrène (PB, 6 pg / ml), indiquant un minimum de toxicité aiguë. Dans ce protocole, nous décrivons l&#39;utilisation de lentivirus écotrope de la surexpression d&#39;oncogènes dans les cellules humaines, la réduction des risques de biosécurité et d&#39;augmenter le taux de transduction. Nous démontrons également l&#39;utilisation de polymères pour améliorer la complexation transduction tout en évitant les aérosols formant centrifugation des particules virales.

Les lentivirus sont un précieux outil de recherche pour explorer la fonction des gènes, mais les chercheurs peuvent souhaiter éviter la production de l&#39;encodage des lentivirus pantropique connus ou soupçonnés oncogènes. Comme alternative, nous présentons un protocole de sécurité pour l&#39;utilisation de lentivirus écotrope sur des cellules humaines modifiées pour exprimer des récepteurs mSlc7a1 écotrope.

Transduction des cellules humaines avec des polymères complexés Lentivirus écotrope pour Enhanced biosécurité

Les études sur la biologie des cellules souches et des cellules tumorales nécessitent souvent la transduction virale de cellules humaines avec des oncogènes connus ou suspectés, ce qui soulève des problèmes de sécurité majeurs pour...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'insérer des oncogènes ou d'autres gènes potentiellement dangereux dans des cellules humaines à l'aide d'un lentivirus écotrope. Cette opération est réalisée en produisant un lentivirus pantrope, codant pour le récepteur du rétrovirus murin, ainsi qu'un lentivirus écotrope codant pour le gène d'intérêt. Les cellules sont d'abord transduites avec le récepteur du rétrovirus murin, ce qui les rend sensibles à la transduction par le virus écotrope. Ensuite, les cellules sont transduites avec le virus écotrope afin d'introduire l'oncogène, en utilisant une complexation polymérique avec du polybrène et du sulfate de chondroïtine pour améliorer l'efficacité de la transduction. Les résultats obtenus montrent une transduction sélective des cellules humaines par le lentivirus écotrope, comme en témoignent la microscopie fluorescente et les analyses FACTS.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la transduction par rétrovirus gamma, est que les particules lentivirales peuvent transduire de manière plus efficace de nombreux types cellulaires, y compris les cellules non divisantes telles que les cellules souches. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le cancer et les cellules souches, notamment à mieux comprendre la fonction de gènes candidats oncogènes. Avant de commencer cette procédure, consultez l'agent de sécurité de votre établissement et suivez les consignes de sécurité recommandées.Commencez avec une culture de cellules 293T saines et en prolifération rapide, manipulées dans une hotte de culture tissulaire. Dans des conditions aseptiques, resuspendez cinq fois 10 puissance 6 cellules 293T dans 10 millilitres de milieu 293T sans antibiotique. Transférez la suspension cellulaire dans une plaque de culture tissulaire de 10 centimètres et incubez-la toute la nuit dans une incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Le lendemain, commencez la transfection en fin d'après-midi. Prélevez d'abord un aliquot d'Optum ainsi que les plasmides de transfert, d'emballage et d'enveloppe, puis laissez-les atteindre la température ambiante. Pipetez 375 microlitres d'optimum dans un tube microcentrifuge, puis ajoutez 25 microlitres de réactif de transfection FU gene HD. Veillez à ce que le réactif FU gene soit pipeté directement dans le milieu et ne touche pas la paroi du tube.Ensuite, dans un deuxième tube de microcentrifugeuse, mélanger cinq microgrammes du plasmide de transfert, 3,75 microgrammes du plasmide d’emballage et 1,25 microgramme du plasmide d’enveloppe dans la quantité requise d’OptiMEM pour obtenir un volume final de 100 microlitres. Puis ajouter le mélange OptiMEM/Fuji au tube contenant le mélange de plasmides et incuber à température ambiante pendant 20 à 30 minutes. Pendant les dernières minutes de l’incubation, aspirer très doucement le milieu du plateau contenant les cellules 293T et le remplacer par 10 millilitres de milieu 293T frais sans antibiotique.Enfin, ajoutez goutte à goutte le mélange de plasmide du gène FU dans le milieu de la plaque de 10 centimètres. Placez la plaque dans une étuve à culture cellulaire réglée à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, et incubez toute la nuit. Le jour suivant, aspirez très délicatement le milieu de la plaque et remplacez-le par du milieu 2 9 3 T frais sans antibiotique.Ensuite, remettez la plaque dans l'incubateur de culture tissulaire et incubez-la pendant deux jours supplémentaires. Trois jours après la transfection, aspirez le milieu contenant le virus à partir de la plaque et filtrez-le à l’aide d’un filtre de 0,45 micron à faible liaison aux protéines. Après filtration, serrez le virus pour obtenir un virus concentré, puis effectuez des dilutions sérielles d’un virus témoin fluorescent dans un milieu frais sans antibiotique contenant six microgrammes par millilitre de polybrene, et utilisez ces dilutions pour transduire les cellules de la lignée cellulaire appropriée. Le jour suivant, dans une plaque de 24 puits, remplacez le milieu par du milieu frais sans antibiotique, puis poursuivez l’incubation pendant deux jours supplémentaires afin de permettre aux cellules d’exprimer la protéine fluorescente.Utilisez les données obtenues pour déterminer la fraction de cellules transduites pour chaque dilution virale. Calculez ensuite le titre en unités transformantes par millilitre, en vous basant sur les dilutions qui produisent moins de 15 % de transduction, afin de minimiser les événements de transduction multiples. On suppose que les titres des autres lentivirus non fluorescents produits en parallèle sont similaires à celui du virus fluorescent.Pour transduire les cellules cibles, commencez par sélectionner une multiplicité d'infection supérieure à deux afin de garantir que la majorité des cellules seront transduites. Diluez d'abord le surnageant viral à la multiplicité d'infection requise dans un milieu de culture complet frais, supplémenté avec six microgrammes par millilitre de polybrene, jusqu'à un volume final d'un millilitre.Aspirez le milieu d'une plaque de 35 millimètres contenant les cellules cibles et ajoutez un millilitre de surnageant viral dilué. Incubez dans l'incubateur de culture tissulaire pendant 24 à 48 heures afin d'obtenir une expression suffisante du récepteur SLC7A1 si désiré. Utilisez une sélection antibiotique avec la blasticidine pour sélectionner les cellules transduites de façon stable exprimant SLC7A1, conformément aux instructions décrites dans la procédure écrite.Pour commencer la détermination de la toxicité, préparez une solution mère de 20 milligrammes par millilitre de sulfate de chondroïtine et une solution mère de 20 milligrammes par millilitre de poly cerveau dans de l'eau, puis filtrez de manière stérile. Les solutions mères en excès peuvent être conservées à moins 20 degrés Celsius jusqu'à utilisation.Ensuite, déterminez le nombre de cultures cellulaires en plaques de 96 puits nécessaire pour évaluer avec précision la toxicité du complexe polymère. À l'aide du test au MTT, au moins six concentrations de sulfate de chondroïtine et de poly green doivent être testées en triplets. En outre, incluez des cellules non traitées et des cellules cultivées sans sérum.Un milieu doit être inclus afin de fournir une référence pour des cellules saines et de contrôler respectivement l'arrêt de la croissance. Une fois le nombre de puits requis déterminé, ensemencer 5 000 cellules cibles dans chaque puits d'une plaque de 96 puits, parallèlement à des cellules ensemencées dans une plaque de 24 puits pour une analyse microscopique ou fondée sur des faits de l'efficacité de la transduction dans chaque condition expérimentale, puis laisser les deux lots de cellules croître pendant la nuit. Le lendemain, prélever un aliquot de la solution mère de sulfate de chondroïtine et un aliquot de la solution mère de polybrain. Ensuite, diluez le virus codant pour la GFP dans un milieu sans antibiotique contenant six microgrammes par millilitre de polybrain à une multiplicité d'infection suffisante pour transduire environ 10 à 50 % des cellules cibles par puits. Assurez-vous qu'il y a suffisamment de virus dilué pour chaque condition testée ainsi que pour les puits témoins sur chaque plaque. Étiquetez un ensemble de tubes avec chaque concentration de sulfate de chondroïtine et de polymère polygreen à tester.Ensuite, aliquoter une quantité suffisante de la suspension virale pour chaque condition en triple exemplaire dans les tubes. Puis, prélever au pipetage le volume requis de sulfate de chondroïtine et de solution mère de poly cerveau afin d'obtenir les concentrations d'essai, et ajouter successivement dans chacun des tubes. Immédiatement après l'ajout de sulfate de chondroïtine et de poly vert, agiter brièvement le tube pour homogénéiser.Laisser les mélanges de virus, de chondroïtine sulfate et de polyvert incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Le mélange peut devenir trouble à mesure que les précipités viraux se forment. Après l'incubation, aspirer le milieu des puits de la plaque de 96 puits.Ensuite, ajouter le mélange de virus, de sulfate de chondroïtine et de polyvert au(x) puits selon le plan prévu. Pipeter également le milieu contrôle et le milieu sans sérum dans les puits appropriés. Répéter le processus pour la plaque de 24 puits et incuber toute la nuit dans l'incubateur de culture tissulaire.Ensuite, aspirez le milieu contenant le virus à partir des plaques et remplacez-le par du milieu frais. Replacez les plaques dans l'incubateur pendant 48 heures. Après 48 heures, retirez la plaque 24 puits et utilisez les faits pour analyser l'efficacité de transduction de chaque concentration de sulfate de chondroïtine et de poly-cerveau.Le lendemain, aspirez le milieu de tous les puits de la plaque 96 puits et remplacez-le par 100 microlitres de solution de MTT. Incubez pendant trois heures dans un incubateur humidifié afin de permettre la réduction du MTT dans les mitochondries des cellules métaboliquement actives. Après trois heures, aspirez la solution de MTT et remplacez-la par 200 microlitres de solution solvant.Incuber la plaque pendant deux heures à température ambiante ou jusqu'à ce que tout le MTT violet formé et le précipité soient dissous. Lire l'absorbance sur un lecteur de microplaque à 570 nanomètres, en soustrayant la mesure de fond à 690 nanomètres. La concentration optimale du polymère produira une amélioration maximale de la transduction, déterminée par des faits, avec un effet minimal sur l'activité métabolique, déterminée par le test au MTT pour hdfs.100 microgrammes par millilitre de sulfate de chondroïtine. Poly brain est la concentration optimale de polymère déterminée par cette méthode. Préparez d'abord suffisamment de mélange de surnageant viral poly green contenant 100 microgrammes par millilitre de sulfate de chondroïtine pour transduire le nombre requis de boîtes de 35 millimètres de cellules HDF exprimant le récepteur SLC seven A one. Incubez le mélange pendant cinq minutes pour permettre la formation des complexes polymériques.Ensuite, aspirez le milieu des cellules cibles exprimant le récepteur et remplacez-le par le mélange viral. Incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après avoir retiré le mélange viral, lavez la surface des cellules deux fois avec du PBS afin d'éliminer les complexes viraux. Une élimination complète n'est pas nécessaire, car aucun effet néfaste sur la santé cellulaire n'a été observé en présence de complexes polymériques résiduels.Cette image de microscope à fluorescence illustre une transduction suffisante de cellules humaines de sarcome exprimant de façon stable SLC seven A one avec un virus tropique, lorsqu'on utilise des vecteurs témoins fluorescents pour surveiller l'efficacité de la transduction. La quantification de la fluorescence par analyse fax révèle une efficacité de transduction supérieure à 90 %. Les taux de transduction des HDFS sont généralement plus faibles, car les cellules n'ont pas été activées ni sélectionnées pour l'expression du récepteur ; les titres de lentivirus atropique mesurés sur S-L-C-H-S-C représentent généralement 10 à 20 % de ceux du virus pseudotypé VSV. Le test de viabilité MTT permet une détection sensible de l'arrêt de croissance dans les cellules cibles, comme observé ici, après transduction avec le virus en présence de concentrations de sulfate de chondroïtine.Des concentrations de poly cerveau allant jusqu'à 800 microgrammes par millilitre n'ont aucun effet sur le métabolisme des HDF. Analyse par télécopie des HDF transduits par le virus en présence de diverses concentrations de sulfate de chondroïtine. Le poly vert montre une amélioration de la transduction par rapport au poly vert seul.L'effet d'amélioration maximal se produit à 100 microgrammes par millilitre. Le poly-sulfate de chondroïtine cérébral est plusieurs fois inférieur aux valeurs précédemment rapportées. Ainsi, il est important d'optimiser les conditions de complexation avec le sulfate de chondroïtine pour tout type cellulaire donné.Poly cérébral améliore le titre observé, d'environ trois fois dans S-L-C-H-S-C. En pratique, cela produit un effet plus marqué sur l'efficacité de transduction à de faibles concentrations de virus qu'à des concentrations plus élevées, ce qui est très probablement dû à la présence de multiples cellules transduites et à la saturation des récepteurs à des concentrations élevées de virus. La transduction avec un virus tropique est spécifique des cellules exprimant le récepteur rétroviral neuronal.Lors de la transduction de cellules humaines non modifiées à l'aide d'un virus tropique, une fluorescence supérieure au fond non réduit n'a pas été observée, comme le montre l'analyse par microscopie. Les HDFS ne montrent aucune transduction en l'absence de récepteur, tandis que la pré-transduction avec récepteur donne lieu à des cellules fluorescentes. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de se rappeler de vérifier que le virus ne transduira pas les cellules humaines modifiées.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser un lentivirus trophique pour délivrer des gènes potentiellement dangereux à des cellules humaines, y compris l'utilisation de la complexation par polymère pour améliorer la transduction.

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Transduction des cellules humaines avec des polymères complexés Lentivirus écotrope pour Enhanced biosécurité

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