Evaluation de développement des glandes mammaires et fonction dans des modèles murins

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer le développement des glandes mammaires chez des souris de type sauvage et mutantes. Cela est réalisé en premier lieu en disséquant une souris afin d'exposer les glandes mammaires. Ensuite, les glandes mammaires sont correctement prélevées et étalées sur des lames en verre, calm lum.

La coloration est ensuite utilisée pour analyser le degré de développement de l'épithélium. Enfin, une analyse des contractions myoépithéliales suite à l'exposition à l'ocytocine est réalisée, INEA J.Ultimement, les résultats obtenus révéleront si les canaux et les alvéoles de la glande mammaire se sont correctement formés, et si l'épithélium myo peut être induit à se contracter et à expulser le lait suite à l'exposition à l'ocytocine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles relatives au développement et à la différenciation de la glande mammaire, telles que l'impact d'une mutation ou d'une invalidation génique sur la morphologie et la fonction de la glande mammaire.

La démonstration visuelle de cette méthode garantit une dissection adéquate de la glande mammaire, car la monture par trou et le dosage fondé sur l'ocytocine exigent des glandes mammaires bien préparées. Une dissection inadéquate de la glande peut entraîner l'absence de certains canaux épithéliaux ou la présence de tissus étrangers tels que la peau ou le tissu musculaire. Au moins un jour avant la dissection, préparez la solution d'alun CalMin en dissolvant un gramme de CalMin et 2,5 grammes de sulfate d'aluminium et de potassium dans 500 millilitres d'eau distillée.

Faites bouillir la solution pendant 20 minutes dans un ballon d'un litre, puis ajustez le volume final à 500 millilitres avec de l'eau. Filtrez la solution à travers un papier Watman et ajoutez quelques grains de thiol comme conservateur. Ensuite, réfrigérez la solution après la coloration.

La solution de carbone alum peut être reversée dans le flacon de stockage et réutilisée plusieurs fois pendant plusieurs semaines. Préparez une solution fraîche lorsque la couleur devient pâle. Pour commencer la dissection de la glande mnésique, sacrifiez une souris par inhalation de dioxyde de carbone.

Évitez la dislocation cervicale si possible, car elle pourrait endommager les gros vaisseaux sanguins du cou et entraîner une accumulation de sang autour du gland mammaire numéro un, rendant ainsi sa dissection plus difficile sur de la mousse de polystyrène enveloppée dans du papier d’aluminium. Placez la souris sur le dos et écartez les quatre membres.

Fixez fermement les quatre membres à l'aide d'aiguilles de calibre 16 à 20. Pulvérisez généreusement la souris avec de l'éthanol à 70 % à l'aide de pinces. Soulevez la peau abdominale au niveau de la ligne médiane et pratiquez une petite incision avec des ciseaux pointus en partant de l'incision.

Couper la peau jusqu'au cou de l'animal en évitant de percer les cavités abdominale ou thoracique. Inciser la peau des membres antérieurs jusqu'à l'incision médiane, formant ainsi une forme en Y. Procéder de la même manière pour les membres postérieurs.

À l'aide de pinces hémostatiques. Décollez délicatement la peau abdominale et thoracique sur les côtés de la souris si nécessaire. Coupez délicatement le tissu conjonctif.

Fixez la peau sur la mousse de polystyrène à l'aide d'aiguilles de calibre 16 à 20, en exposant les glandes mammaires fixées à la face inférieure de la peau. Disséquez une glande à la fois à l'aide de pinces. Soulevez délicatement la glande mammaire d'intérêt et sectionnez entre la glande et la peau à l'aide de petites ciseaux pointus, en partant de l'extérieur vers la colonne vertébrale de l'animal.

Veillez à découper soigneusement afin qu'aucun fragment de peau ou de muscle ne reste sur la glande. Toutes les glandes mammaires peuvent être retirées à l'aide de ce protocole, mais les glandes mammaires abdominales numéro quatre sont les plus adaptées pour un montage complet. Après avoir excisé la glande mammaire de la souris, étalez-la directement sur une lame de verre.

Essayez de l'aplatir autant que possible. En conservant sa forme originale in situ, la glande adhérera bien à la lame. Une fois correctement étirée sous une hotte, fixez la glande en immergeant la lame dans un bocal contenant du car noise.

Fixer pendant quatre heures à température ambiante. En alternative, fixer la glande toute la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, laver le tissu dans de l'éthanol à 70 % pendant 15 minutes.

Ensuite, réhydratez-le progressivement dans l'eau en retirant la moitié de la solution d'éthanol du bocal et en la remplaçant par de l'eau doublement distillée. Incubez pendant cinq minutes. Répétez l'opération trois fois, rincez et laissez dans de l'eau distillée pendant cinq minutes.

Ensuite, colorer la glande au noir de méthylène alumine pendant une nuit à température ambiante. Le jour suivant, retirer la coloration au noir de méthylène pour réutilisation, puis déshydrater progressivement le tissu coloré par des bains d'éthanol successifs de cinq minutes chacun. Puis, clarifier le tissu dans le xylène pendant une nuit. Après clarification, immerger la glande mammaire dans le salicylate de méthyle, en gardant le salicylate de méthyle sous une hotte aspirante jusqu'à ce que les images soient prêtes à être prises. Le développement de la glande mammaire peut être quantifié en comptant le nombre de ramifications ou de branches latérales le long de segments de canaux, en mesurant la longueur des canaux principaux, ou en évaluant le rapport entre la surface du tissu épithélial et celle du tissu adipeux.

Un second essai utilisé pour évaluer le développement et la fonction de la glande mammaire consiste à exposer la glande à l'ocytocine et à évaluer l'éjection du lait dans les canaux épithéliaux. Pour réaliser cet essai, les souriceaux récemment nourris doivent être sevrés de leur mère, et la mère doit être maintenue en isolement pendant une heure. Ensuite, sacrifier la mère et exposer les glandes mammaires comme décrit pour la dissection de la glande mammaire.

Cependant, laissez-les dans l'animal. Commencez le dosage en utilisant une pipette de transfert pour déposer uniformément trois à cinq millilitres de PBS ou de la solution d'ocytocine directement sur la glande mammaire d'intérêt. Pour cette procédure, il est recommandé d'utiliser les glandes thoraciques, en prenant un côté comme témoin et l'autre côté pour tester l'éjection du lait.

Incuber les glandes pendant une minute et éliminer les solutions en les aspirant soigneusement à l’aide d’une pipette de transfert. Surveiller l’entrée du lait dans les canaux en enregistrant une vidéo ou en prenant des images avant et après l’exposition au PBS ou à l’ocytocine. Voici des exemples de mémoire chez la souris. Les montages de glandes montrent des canaux épithéliaux, indiqués par des flèches, et le ganglion lymphatique, marqué par une pointe de flèche, facilement observables dans une glande mammaire entière bien étalée.

Une glande mammaire mal étalée peut se détacher de la lame et s'effondrer, la rendant inutilisable. Une glande mammaire incorrectement excisée peut présenter des parties manquantes ou des fragments de muscle ou de peau résiduels. L'éjection de lait induite par l'ocytocine peut être observée chez les canards épithéliaux après exposition à l'ocytocine.

Cependant, si les canaux sont déjà remplis de lait au début du test en raison d'une période de latence inadéquatement longue après la dernière tétée des petits, l'accumulation supplémentaire de lait dans les canaux après exposition à l'ocytocine est difficile à observer. En revanche, une période de latence courte après la tétée des petits empêchera l'accumulation d'une quantité suffisante de lait dans les alvéoles pour être correctement observée dans les canaux après exposition à l'ocytocine, suite à la dissection des glandes mammaires. Au lieu de monter les tissus en entier ou d'évaluer l'éjection de lait induite par l'ocytocine, les glandes mammaires peuvent être congelées, coupées en cryosections et marquées par immunomarquage pour un grand nombre de protéines résidentes au niveau des glandes mammaires.

Ou, de manière alternative, les glandes peuvent être lysées et préparées pour une immunotransfert sur membrane (western blotting). Ces deux approches permettent d'aborder des questions fondamentales relatives au développement, à la différenciation et à la fonction des glandes dans un grand nombre de modèles murins conçus pour présenter une absence de gènes clés ou des mutations dans des gènes impliqués dans l'arborisation.