Séquençage de la microflore bactérienne dans le sang périphérique: notre expérience avec des patients infectés par le VIH

Séquençage de la microflore bactérienne transloquée dans le sang périphérique. Notre expérience auprès de patients infectés par le VIH. Je suis Marti junior, et je travaille en tant que maître de conférences à la Clinique des maladies infectieuses et de médecine tropicale de l'Université de Milan en Italie. Nous allons maintenant vous présenter des expériences visant à détecter et à séquencer l'ADN bactérien provenant du sang périphérique de patients infectés par le VIH.

Le tube digestif sain est colonisé par une grande variété de micro-organismes commensaux qui influencent le développement du système immunitaire humorale et cellulaire. La microflore est protégée du système immunitaire par une barrière muqueuse solide, sauf dans plusieurs situations cliniques telles que les infections, les traitements aux antibiotiques, les complications postopératoires, ainsi que chez les patients atteints de carcinome, de pancréatite ou de malnutrition. Une altération du tube digestif se produit.

L'infection par le VIH provoque une altération de la barrière gastro-intestinale, entraînant une défaillance progressive de l'immunité muqueuse et une fuite dans la circulation systémique de bioproduits bactériens, tels que le lipopolysaccharide et des fragments d'ADN bactérien, qui contribuent à l'activation immunitaire systémique, illustrant les phases expérimentales de détection et de séquençage de l'ADN bactérien. Présents dans le sang périphérique de patients infectés par le VIH, nous aurons Camilla ti, une interne en maladies infectieuses Esther, moi, un étudiant en doctorat, et ju MariaI, une chercheuse postdoctorale, tous participant à la clinique de maladies infectieuses et de médecine tropicale à l'Université de Milan. Notre expérience vise à identifier les espèces bactériennes présentes dans des échantillons de sang périphérique provenant de patients infectés par le VIH.

Nous allons utiliser du sang total provenant de sujets infectés par le VIH ainsi que de sujets sains, étant donné que les individus en bonne santé présentent une homéostasie intestinale normale. Nous ne nous attendons pas à observer de microflore transloquée chez ces patients. Le sang total sera prélevé chez les patients, suivi d'une séparation du plasma.

L'ADN sera ensuite extrait afin de réaliser une réaction de PCR à large spectre ciblant le gène ribosomique 16 s du PCIC. Une purification des produits de PCR, suivie d'une analyse par clonage et séquençage, sera effectuée. La première étape de notre expérience consiste à prélever du sang par ponction veineuse, puis à séparer le plasma.

Environ neuf millilitres de sang total sont prélevés dans des tubes contenant de l'EDTA. Les tubes sont placés dans une centrifugeuse à 2000 tr/min pendant 10 minutes. Une centrifugation à température ambiante permet la séparation du plasma.

L'extraction de l'ADN sera désormais effectuée à partir de nos échantillons de plasma. Désinfectez correctement la hotte, les pipettes et le matériel nécessaire à l'expérience afin de garantir l'asepsie. Placez tout le matériel sous les lampes UV pendant au moins 30 minutes. Éteignez les lampes UV, essuyez les gants avec un désinfectant, imbibez quelques essuie-tout d'éthanol et placez-les sous la hotte chaque fois qu'une pointe est jetée. Pendant la procédure d'extraction de l'ADN, essuyez la pipette sur les essuie-tout humides.

Vous êtes maintenant prêt pour l'extraction de l'ADN. L'ADN est extrait à l'aide d'un kit commercial, en suivant les instructions du fabricant. En bref, 350 microlitres de plasma sont placés dans un tube Eppendorf de deux millilitres.

De l'eau ultra-pure est utilisée comme témoin négatif. 10 microlitres de lysosome à une concentration finale de 1 mg par mL sont ajoutés aux échantillons. Les échantillons sont ensuite incubés pendant 30 minutes.

À 37 degrés Celsius, la solution A, le chloroforme et la solution B sont ensuite ajoutés aux échantillons selon les instructions suivant la centrifugation. Trois phases distinctes apparaîtront. Le surnageant est recueilli et ajouté à l'éthanol absolu, permettant la précipitation de l'ADN ; la concentration d'ADN est ensuite mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre.

L'étape suivante consiste en une amplification par réaction de PCR à large spectre du gène ribosomique PRIC 16 s. La PCR est réalisée dans une pièce dédiée. Un mélange de PCR est préparé à l'aide de ces réactifs. Le mélange de PCR est filtré pendant 30 minutes à 500 ×g et à quatre degrés Celsius afin d'éviter toute contamination possible par la polymérase bactérienne tap.

Le mélange de PCR est ensuite divisé en aliquotes, selon le nombre d'échantillons à amplifier. Pensez à prévoir des aliquotes pour les contrôles de réaction négatif et positif.

Le THERMOCYCLAGE est programmé selon les conditions suivantes : 94 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis 94 degrés Celsius, 55 degrés Celsius, 72 degrés Celsius pendant une minute, répété 40 cycles, suivis de 72 degrés Celsius pendant 10 minutes. La durée moyenne est de trois heures.

Les produits de PCR sont visualisés sur un gel d'agarose à 2 %. Il s'agit d'un gel d'agarose à 2 % montrant les produits de PCR. La première lame contient un marqueur de 100 paires de bases.

La deuxième piste, un témoin positif de PCR. La troisième piste contient un témoin négatif de PCR. La quatrième piste montre des échantillons provenant d'un patient séropositif au VIH et la cinquième piste contient une piste d'eau.

La six contient des échantillons provenant d'un individu sain et d'une réaction PCR négative. La bande sept contient de l'eau. La PCR IFICATION est l'étape suivante.

Les produits de PCR sont purifiés à l'aide d'un kit commercial, en suivant les instructions du fabricant. De nombreuses colonnes contenant des filtres sont utilisées pour cette étape. Les résultats de PCR sont enregistrés sur une feuille de travail.

Nous allons maintenant procéder au clonage en utilisant la sélection bleu-blanc, une technique moléculaire permettant de détecter l'insertion réussie d'un ADN dans un vecteur. Le vecteur est ensuite introduit dans des cellules compétentes. Bactéries.

Les cellules compétentes sont cultivées en présence de xal. Si la lation est réussie, la colonie bactérienne sera blanche. Sinon, la colonie sera bleue.

Xal est utilisé pour indiquer si une cellule exprime l'enzyme bêta-galactosidase et pour visualiser la transformation des colonies d'E. coli. L'IPTG induit l'expression de la bêta-galactosidase. Xal et l'IPTG sont étalés sur des boîtes contenant de l'ampicilline. Un mélange de clonage contenant les produits de PCR, SALT et un vecteur d'expression est préparé selon les instructions du fabricant.

Les cellules d'E. coli sont placées sur de la glace. Le mélange de clonage est ensuite ajouté aux cellules, qui sont soumises à un choc thermique. Les plaqettes sont ensuite incubées toute une nuit à 37 degrés Celsius. Après incubation, des colonies blanches et bleues se développent sur les plaqettes.

Les colonies blanches sont positives pour les produits de PCR. Les colonies bleues indiquant une insertion sont négatives pour l'insertion du produit de PCR. Dix colonies blanches et une colonie bleue sont sélectionnées.

Chaque colonie est placée dans deux millilitres de milieu de croissance LB liquide. Les colonies en présence d'ampicilline sont incubées toute la nuit à 37 degrés Celsius. Après incubation, les colonies ayant poussé toute la nuit sont utilisées pour l'extraction du plasmide à l'aide d'un kit de minipréparation commercial.

Des microcolonnes contenant des filtres sont utilisées pour l'étape suivant l'extraction du plasmide. Les plasmides sont ensuite visualisés sur un gel d'AROS à 0,7 %. Il s'agit d'un gel d'AROS à 0,7 % montrant les produits d'une minipréparation. La première voie contient une échelle d'un kilobase.

La deuxième bande contient la colonie témoin bleue. Les bandes trois à douze contiennent des colonies blanches. Les résultats sont enregistrés à l'aide d'une feuille de travail. Le séquençage suit, puis les plasmides sont amplifiés.

Un mélange est préparé en utilisant ces réactifs. Le mélange de PCR est divisé en aliquotes selon le nombre d'échantillons à amplifier. L'amplification thermocyclique est programmée selon les conditions suivantes : 96 degrés Celsius pendant une minute, 96 degrés Celsius pendant 10 secondes, 50 degrés Celsius pendant cinq secondes, 60 degrés Celsius pendant quatre minutes.

Pendant 25 cycles. La durée moyenne est d'environ une heure. Après l'amplification, les produits de PCR sont purifiés à l'aide de colonnes contenant un filtre.

Les produits purifiés sont chargés sur une plaque, qui est ensuite placée dans un séquenceur. Une fois la séquence obtenue, elle est soumise à une recherche BLAST et les espèces bactériennes de chaque colonie sont identifiées. Les colonies présentant une homologie de séquence de 98 % à 100 % sont considérées comme positives.

Il s'agit d'un exemple de séquençage bactérien dans le plasma d'un individu séropositif. Nos résultats montrent que la translocation microbienne dans la maladie à VIH implique une flore polymicrobienne. Nous avons ainsi démontré que les patients infectés par le VIH présentent une flore microbienne microbienne polymicrobienne élevée dans la circulation systémique.

L'ADN bactérien dans le sang périphérique était en dessous de la limite de détection pour nos individus sains séronégatifs pour le VIH, ce qui reflète peut-être l'intégrité du tractus gastro-intestinal. Notre recherche est désormais centrée sur la compréhension et l'investigation du rôle possible de la microflore dans le sang périphérique, dans la physiopathologie immunitaire du VIH et, éventuellement, la réponse au traitement.