Haut débit écran surexpression plasmide de levure

L’objectif global de cette procédure est de transformer des cellules de levure avec une bibliothèque de réseaux d’ADN plasmatiques. Ceci est accompli en cultivant d’abord une quantité appropriée de cellules de levure. Les cellules de levure sont ensuite traitées avec de l’acétate de lithium pour les rendre aptes à la transformation de l’ADN.

Ensuite, transformez les cellules e compétentes en les mélangeant avec de l’ADN. La dernière étape de la procédure consiste à sélectionner et à analyser les transformants. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent les effets de l’ADN plasmatique sur les phénotypes de levure grâce à des tests de repérage de levure et/ou à la microscopie.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux protocoles existants, tels que les transformations de levure standard, est qu’elle permet de transformer un grand nombre de plasmides différents en cellules de levure de manière automatisée. Ce protocole de transformation de levure à haut débit est conçu pour 10 plaques de 96 puits, mais peut être augmenté ou réduit en conséquence. Pour les expériences à plus grande échelle, la clé du succès est de garder toutes les plaques et tous les réactifs organisés.

Une fois l’expérience en cours pour éviter toute confusion, un manipulateur de liquide à plaque rapide biobot sera utilisé dans ce protocole Pour commencer l’aliquote, cinq à 10 microlitres d’ADN plasmatique d’une bibliothèque de plasmides de levure en réseau dans chaque puits du tour. Fond 96 plaques de puits. Placez les plaques de puits de 96 puits découvertes à l’intérieur d’une hotte de banc propre pendant la nuit pour qu’elles sèchent.

Ensuite, inoculez 200 millilitres de peptide de levure dextrose ou milieu YPD avec une souche de requête dans une fiole Lin Meyer déflecteur de 500 millilitres, incubez pendant la nuit à 30 degrés Celsius et secouez le lendemain matin. Diluez la souche de requête à une OD 600 de 0,1 dans deux litres de milieu YPD pour une croissance optimale. Cultivez jusqu’à un litre de cultures dans des flacons séparés de 2,8 litres.

Agitez les flacons pendant quatre à six heures à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que les cultures atteignent une DO 600 de 0,8 à 1,0. Lorsque la culture de levure a atteint une DO 600 de 0,8 à 1,0, récoltez les cellules par centrifugation. Remplissez quatre tubes coniques jetables de 225 millilitres avec culture et faites tourner une vitesse de 3000 tr/min pendant cinq minutes dans une centrifugeuse de table.

Videz le surnageant S de chaque tube. Ajoutez plus de culture dans les mêmes tubes et centrifugez à nouveau, en répétant si nécessaire jusqu’à ce que toutes les cellules soient récoltées. Lavez chaque pastille de cellule dans 50 millilitres d’eau distillée de l’autoclave et dépensez par vortex.

Combinez les cellules dans un tube conique de deux cent vingt-cinq millilitres et tournez-les à 3000 tr/min pendant cinq minutes. Après avoir retiré le surnageant S, lavez les cellules dans une solution de cent millilitres d’acétate de lithium. Tournez à nouveau à 3000 tr/min pendant cinq minutes.

Retirez le SNA et remettez en suspension la pastille de cellule dans 70 millilitres de solution d’acétate de lithium. Vortex à grande vitesse pendant environ 30 secondes jusqu’à ce que le plomb soit complètement remis en suspension. Incuber en secouant à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, ajoutez de l’éthanol bêta-me capto à 0,1 molaire d’incubation en secouant à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes supplémentaires. Après l’incubation de 30 minutes, ajoutez deux millilitres d’ADN de spermatozoïde de saumon bouilli et réfrigéré au mélange de cellules. Versez le mélange de cellules dans une plaque à puits unique autoclavable, puis retirez tout précipité qui se forme, car cela peut interférer avec le pipetage en aval.

À l’aide de la plaque rapide biobot, aliquote 50 microlitres de mélange cellulaire dans chaque puits des quatre préalablement préparés. 96 plaques de puits contenant de l’ADN plasmatique ne se mélangent pas. Incuber les plaques à température ambiante pendant 30 minutes sans secouer pendant l’incubation des cellules.

Préparez 200 millilitres de solution d’acétate de lithium PEG DMSO. Combinez 160 millilitres de 50 % de PEG 33, 50 20 millilitres de DMSO et 20 millilitres d’acétate de lithium d’une molaire. Il est important que cette solution soit préparée juste avant utilisation.

Ajoutez 125 microlitres de solution de DMSO d’acétate de lithium PEG à chacun. Bien mélanger en aspirant et en distribuant la suspension cellulaire huit fois. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes sans secouer.

Ensuite, choquez les cellules à 42 degrés Celsius pendant 15 minutes Dans un incubateur sec, n’empilez pas les plaques après le choc thermique, faites tourner les plaques à l’aide d’adaptateurs de centrifugeuse pour accueillir les plaques à 96 puits. Après la centrifugation, retirez la solution PEG en inversant les plaques au-dessus d’un seau à déchets. Ensuite, épongez les assiettes inversées sur du papier absorbant.

Pour éliminer le liquide résiduel, les cellules resteront au fond des puits. Rincez les cellules en ajoutant 200 microlitres de média minimal à chacune. Eh bien, faites tourner les assiettes à nouveau.

Retirez le surnageant en le retournant sur un seau à déchets et en l’épongeant sur du papier absorbant. Ajoutez 200 microlitres de milieu minimal dans chaque puits avec une plaque d’incubation rapide à 30 degrés Celsius pendant deux jours sans secouer. Après deux jours, de petites colonies de cellules devraient commencer à se former au fond de chaque Transformé avec succès.

Eh bien, pour vous préparer au test de sphating, versez d’abord 200 microlitres de média minimal basé sur OSE dans chaque puits d’un nouvel appartement. Fond 96 plaque de puits. Prochain. Mélangez chaque puits de la plaque de transformation en aspirant et en distribuant la suspension cellulaire huit fois avec une plaque rapide.

Inoculez chaque puits de la plaque de raffinage avec cinq microlitres de mélange cellulaire de la plaque de transformation, incubez à 30 degrés Celsius pendant une journée. Le lendemain. De petites colonies doivent être présentes au fond de chacun.

Bien effectuer le test de repérage dans la capuche, stériliser un boulon 96, un réplicateur ou un grenouille par flamme. Mélangez les colonies avec une grenouille, puis repérez les colonies sur des plaques de milieux sélectifs. Après le repérage, laissez les plaques sécher dans la hotte pendant cinq à 10 minutes.

Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours. Voici les résultats représentatifs d’un plasmide de levure sur le criblage d’expression pour identifier les suppresseurs et les amplificateurs de TDP 43.Toxicité. TDP 43 est une protéine humaine qui a été impliquée dans la pathogenèse d’une sclérose latérale myotrophique ou d’une maladie de Lou Gehrig ; l’expression de TDP 43 dans les cellules de levure entraîne l’agrégation et la cytotoxicité.

Ces plaques présentent des colonies avec un plasmide T DP 43 inductible au galactose intégré, qui ont également été transformées avec des plasmides de la bibliothèque d’expression du gène flex ORF. Les colonies ici apparaissent de couleur rouge parce que la souche a une mutation qui entraîne l’accumulation d’un pigment rouge. La plaque de gauche contient du glucose, qui réprime l’expression de T DP 43 ou des plasmides du gène flex.

La plaque de droite contient du galactose, qui induit l’expression de TDP 43 et des O Fs dans les plasmides du gène flex. La pointe de flèche verte indique une colonie transformée avec un plasmide qui supprime la toxicité de TDP 43, comme l’indiquent une croissance plus rapide et des colonies plus denses. La pointe de flèche rouge indique une colonie transformée avec un plasmide qui augmente la toxicité de TDP 43, comme l’indiquent une croissance plus lente et des colonies moins denses.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de transformer une bibliothèque d’ADN plasmatique de cellules.