Name: Débit analyse par cytométrie de cellules immunitaires dans aortes murin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 15 s
Description: Découvrez une méthode de cytométrie en flux pour analyser les leucocytes aortiques et adventitiels chez la souris. Cette technique permet de caractériser les sous-populations immunitaires dans l'athérosclérose.

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Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé de subvention: PO1 HL55798 (à KL) et l&#39;American Heart Association Scientifique de subvention au développement 0525532U (EG).

<ol><li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-2341 (2000).</li>
<li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammatory+mechanisms+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis.</a> Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).</li>
<li>Hansson, G. K., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+in+atherosclerosis%3A+a+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword.</a> Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).</li>
<li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+influx+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Leukocyte influx in atherosclerosis.</a> Curr Drug Targets. 812, 1239-1248 (2007).</li>
<li>Bonanno, E., Mauriello, A., Partenzi, A., Anemona, L., Spagnoli, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+atherosclerotic+plaque+cells+from+human+carotids%3A+a+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study.</a> Cytometry. 39, 158-165 (2000).</li>
<li>Liu-Wu, Y., Svenningsson, A., Stemme, S., Holm, J., Wiklund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+macrophage-derived+foam+cells+from+human+atherosclerotic+lesions+by+using+a+%22mock%22+FL3+channel+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of macrophage-derived foam cells from human atherosclerotic lesions by using a "mock" FL3 channel in flow cytometry.</a> Cytometry. 29, 155-164 (1997).</li>
<li>Galkina, E., Kadl, A., Sanders, J., Varughese, D., Sarembock, I. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+recruitment+into+the+aortic+wall+before+and+during+development+of+atherosclerosis+is+partially+L-selectin+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent.</a> J Exp Med. 203, 1273-1282 (2006).</li>
<li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li>
<li>Smith, E., Prasad, K. M., Butcher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+interleukin-17A+results+in+reduced+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Blockade of interleukin-17A results in reduced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice.</a> Circulation. 121, 1746-1755 (2010).</li>
<li>Eid, R. E., Rao, D. A., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17+and+interferon-gamma+are+produced+concomitantly+by+human+coronary+artery-infiltrating+T+cells+and+act+synergistically+on+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells.</a> Circulation. 119, 1424-1432 (2009).</li>
</ol>

Ici, nous présentons une méthode cytométrie en flux à base de l&#39;enquête de la composition des cellules immunitaires des aortes murines. L&#39;avantage majeur de cette méthode est la capacité d&#39;analyser l&#39;aorte cellules immunitaires à un niveau simple cellule et de caractériser l&#39;état d&#39;activation des leucocytes aortique. Cette méthode n&#39;est pas limitée aux aortes murines et nous (données non publiées) et d&#39;autres 10 a utilisé cette approche pour analyser des spécimens humains tels ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Matériau </td><td> Nombre de catalogue </td><td> Société </td></tr><tr><td> Collagénase XI </td><td> C7657 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> H3506 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> DNase I, de type 2 </td><td> D4527 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Collagénase I </td><td> C0130 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Collagénase II </td><td> LS004174 </td><td> Worthington Biochemical Corporation </td></tr><tr><td> Élastase </td><td> LS002292 </td><td> Worthington Biochemical Corporation </td></tr></tbody></table>

débit analyse par cytométrie de cellules immunitaires dans aortes murin

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

L&#39;athérosclérose est un processus inflammatoire chronique des navires de taille moyenne et grande taille qui se caractérise par la formation de plaques constituées de cellules de la mousse, les cellules immunitaires, les cellules vasculaires endothéliales et musculaires lisses, les plaquettes, la matrice extracellulaire, et un noyau riche en lipides avec une nécrose extensive et fibrose des tissus environnants. 1 Le bras innée et adaptative de la réponse immunitaire sont impliqués dans l&#39;initiation, le développement et la persistance de l&#39;athérosclérose. 2, 3 Il existe un important corpus de preuves que différents sous-ensembles des cellules immunitaires, telles que les macrophages, dendritiques cellules, les lymphocytes T et B, sont présents dans les aortes des souris saines et l&#39;athérosclérose sujettes 4. En outre, les cellules immunitaires se trouvent dans l&#39;adventice aortique entourant ce qui suggère un rôle important de ce tissu dans l&#39;athérogenèse. 2 Depuis quelque temps, la détection quantitative des différents types de cellules immunitaires, leur état d&#39;activation, et la composition cellulaire dans la paroi aortique a été limitée par RT-PCR et les méthodes immunohistochimiques pour l&#39;étude de l&#39;athérosclérose. Peu de tentatives ont été faites pour réaliser la cytométrie en flux utilisant aortes humaines, et un certain nombre de problèmes, comme une autofluorescence élevée, ont été rapportés 5,6. Homme plaques d&#39;athérosclérose ont été digérés par la collagénase 1, et les cellules libres ont été recueillies et colorées pour CD14 + / CD11c + pour mettre en évidence des cellules spumeuses macrophages dérivés. Dans cette étude, une &quot;maquette&quot; canal a été utilisé pour éviter les faux positifs coloration. 6 matériaux nécrotiques s&#39;accumulent au cours du processus de digestion donner lieu à une grande quantité de débris qui génère une autofluorescence élevées dans les échantillons de l&#39;aorte. Pour résoudre ce problème, un panneau de contrôles positifs et négatifs a été proposée, mais seulement double coloration pourrait être appliqué dans ces échantillons. Nous avons développé un nouveau flux cytométrie méthode basée sur 7 pour analyser la composition des cellules immunitaires et de caractériser l&#39;activation, la prolifération, la différenciation des cellules immunitaires dans l&#39;aorte saine et l&#39;athérosclérose sujettes. Cette méthode permet l&#39;étude de la composition des cellules immunitaires de la paroi aortique et ouvre des possibilités d&#39;utiliser un large éventail de méthodes immunologiques pour les enquêtes sur les aspects immunitaires de cette maladie.

Cet article présente une cytométrie en flux à base méthode pour étudier la composition immunitaire des aortes. Le document montre aussi une technique supplémentaire qui permet d&#39;examiner l&#39;adventice environnante et paroi de la cuve séparément. Cette méthode ouvre des possibilités d&#39;effectuer des analyses phénotypiques des leucocytes aortique et appliquer plusieurs tests immunologiques pour les études de l&#39;athérosclérose.

Débit analyse par cytométrie de cellules immunitaires dans aortes murin

L'athérosclérose est un processus inflammatoire chronique des vaisseaux de taille moyenne et grande, caractérisé par la formation de plaques composées de cellules écumeuses...

L'objectif principal de l'expérience suivante est de caractériser la composition et le phénotype des leucocytes infiltrant l'aorte et l'adventice par cytométrie en flux. Cela est réalisé en isolant d'abord une aorte athéroscléreuse, puis, dans une deuxième étape, en séparant l'adventice environnante de l'aorte et en préparant des suspensions cellulaires uniques à partir des deux tissus.Ensuite, des suspensions uniques de cellules marquées par fluorescence permettent d'obtenir des résultats différenciant des sous-populations spécifiques de leucocytes provenant du tissu adventitiel et de la paroi aortique, révélant ainsi la diversité des leucocytes infiltrant l'aorte durant l'athérogenèse, ainsi que la faisabilité de l'isolement des leucocytes du tissu adventitiel aortique par analyse cytométrique en flux de suspensions uniques de cellules. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'immunohistochimie, réside dans la possibilité d'examiner et de phénotyper les leucocytes à l'aide de plusieurs marqueurs provenant d'une seule aorte. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant les médiateurs cellulaires de l'inflamma

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous décrivons des procédures pour quantifier et caractériser les lésions athéroscléreuses dans des modèles murins en utilisant une section de précision du sinus aortique et de l’aorte ascendante combinée à une analyse histochimique et immunohistochimique.

Analyse quantitative et caractérisation des lésions d&#39;athérosclérose dans le murin aortique Sinus

Cet article fournit une méthodologie détaillée pour identifier et quantifier les sous-ensembles de lymphocytes T fonctionnels présents dans les ganglions rénaux murin, l'aorte et lymphatiques par coloration intracellulaire et cytométrie de flux. Le modèle de l'angiotensine II hypertension induite a été choisi pour expliquer, étape par étape, les procédures et les principes fondamentaux de la cytométrie de flux et de coloration intracellulaire.

Intracellulaires Coloration et cytométrie de flux pour identifier lymphocytaires sous-ensembles au sein murin Aorte, Reins et les ganglions lymphatiques dans un modèle de l&#39;hypertension

Le présent document décrit un procédé de mesure alloréactivité dans une population mixte de cellules T en utilisant la cytométrie de flux d'imagerie.

Mesure de cellules T alloréactivité basés sur l&#39;imagerie cytométrie en flux

Cet article décrit une méthode pour analyser le contenu de la cellule immunitaire du tissu adipeux par l’isolement de cellules immunitaires dans le tissu adipeux et l’analyse ultérieure à l’aide de cytométrie en flux.

Caractérisation des cellules immunitaires dans les tissus adipeux humains à l’aide de cytométrie en flux

Ce protocole présente une méthode simple et efficace pour isoler, identifier et quantifier les cellules immunitaires qui résident dans le myocarde de souris pendant l’état d’équilibre ou d’inflammation. Le protocole associe la digestion enzymatique et mécanique pour la génération d’une suspension de cellule unique qui peut être davantage analysée par cytométrie en flux.

Isolement et Identification des cellules immunitaires extravasculaires du coeur

Nous vous proposons un protocole normalisé afin de caractériser la composition cellulaire des stades des lésions athéroscléreuses murines y compris des méthodes systématiques de dissection animale, incorporation de tissus, coupes, coloration et analyse des artères brachiocéphalique atheroprone muscle lisse cell lineage traçage souris.

Analyse quantitative de la Composition cellulaire dans les lésions athérosclérotiques avancées de Muscle lisse Cell Lineage-Tracing souris

Ici, nous présentons un protocole pour la coloration d'immunofluorescence pour observer les cellules endothéliales de l'aorte de souris directement. Cette technique est utile lors de l'étude du phénotype cellulaire et moléculaire des cellules endothéliales dans différents schémas de flux et dans le développement de l'athérosclérose.

Utilisation de la coloration en immunofluorescence pour observer directement les cellules endothéliales vasculaires

Ici, nous décrivons un protocole détaillé et reproductible de cytométrie de flux pour identifier les sous-ensembles monocytes/macrophage et t-cell utilisant des essais de coloration extra- et intracellulaire dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial, utilisant un modèle chirurgical établi de l’arthrose murine.

Analyse de cytométrie de flux des sous-ensembles de cellules immunitaires dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial dans un modèle d’arthrose

L’isolement de cellules à partir d’implants disséqués et leur caractérisation par cytométrie en flux peuvent contribuer de manière significative à la compréhension du schéma de réponse immunitaire contre les implants. Cet article décrit une méthode précise pour l’isolement de cellules d’implants disséqués et leur coloration pour l’analyse par cytométrie en flux.

Cytométrie en flux à haute dimensionnalité pour l’analyse de la fonction immunitaire de tissus implantaires disséqués

Dans cette étude, nous présentons un protocole efficace et reproductible pour isoler les populations immunitaires du système respiratoire murin. Nous fournissons également une méthode pour l’identification de toutes les cellules immunitaires innées et adaptatives qui résident dans les poumons de souris saines, en utilisant un panel de cytométrie en flux à base de 9 couleurs.

Analyse cytométrique en flux pour l’identification des cellules immunitaires innées et adaptatives du poumon murin

Nous rapportons ici un protocole pour la quantification et la différenciation des lymphocytes B myocardiques en fonction de leur emplacement dans l’espace intravasculaire ou endothélial en utilisant la cytométrie de flux.

Quantification et analyse basées sur la cytométrie en flux des cellules B myocardiques

Découvrez une méthode de cytométrie en flux pour analyser les leucocytes aortiques et adventitiels chez la souris. Cette technique permet de caractériser les sous-populations immunitaires dans l'athérosclérose.

Débit analyse par cytométrie de cellules immunitaires dans aortes murin

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