Évaluation microinjection des ovocytes de souris, la maturation et de ploïdie

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la ploïdie des ovocytes en métaphase deux après une manipulation expérimentale. Commencez par collecter des ovocytes de souris pleinement développés chez des femelles sexuellement matures préparées. Ensuite, micro-injectez les ovocytes avec le matériel choisi afin de perturber la protéine d'intérêt, puis faites mûrir les ovocytes in vitro jusqu'à la métaphase de la méiose deux. Ensuite, stimulez l'étalement des chromosomes dans l'ovocyte par un traitement à la mantro, ce qui entraîne la formation d'un fuseau monopolaire.

En fin de compte, ces résultats peuvent représenter le statut de ploïdie de l'ovocyte par immunofluorescence et microscopie confocale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie de la reproduction et de la ségrégation chromosomique, telles que la compréhension des mécanismes moléculaires menant à une fluidité. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la technique de microinjection est difficile à apprendre, étant donné que plusieurs étapes sont difficiles à transmettre par écrit. Injecter par voie intrapéritonéale des souris femelles sexuellement matures avec cinq UI de gonadotrophine sérique de souris gestantes afin de maximiser le nombre de follicules antraux isolés à partir de chaque souris.

Environ 48 heures après la priming avec la PMSG, réchauffez trois millilitres par souris de milieu de collecte à 37 degrés Celsius et équilibrez. Un millilitre de milieu de culture pendant au moins une heure. Préparez des microgouttes de chacun dans une boîte de Pétri et recouvrez d'huile minérale.

Placez maintenant la boîte contenant le milieu de culture dans l’incubateur et la boîte contenant le milieu de collecte sur un réchauffe-lame. Sacrifiez la souris, disséquez les ovaires et placez-les dans une coupelle en verre contenant du milieu de collecte préchauffé.

À l’aide d’une seringue à insuline d’un millilitre, fixer les ovaires au plat et libérer les follicules antraux en les perforant plusieurs fois avec des aiguilles de calibre 27 fixées ensemble. Sous un microscope de dissection, recueillir les complexes cumulus-oocytes à l’aide d’une pipette en verre commandée par la bouche. Ne recueillir que les follicules antraux de grande taille, et non les follicules préantraux plus petits ni les ovocytes dénudés.

Transférez les complexes dans une micro-goutte de milieu de collecte préparé à l’aide d’une pipette fine légèrement plus grande que le diamètre de l’oocyte. Détachez les cellules du cumulus des complexes. Transférez les oocytes dénudés à l’aide d’une pipette plus grande dans une micro-goutte de milieu de culture.

Laisser les ovocytes se reposer pendant au moins une heure dans l'incubateur avant toute manipulation. Fabriquer les pipettes d'injection en tirant un capillaire en verre au borosilicate à l'aide d'un tireur mécanique. Retirer la chambre de milieu d'une lame à chambre simple.

Pour créer une plateforme de microinjection, déposez une goutte de cinq microlitres de milieu de collecte aussi près que possible d'une goutte de 0,5 microlitre de SIR N-A-C-R-N-A ou d'oligonucléotide pour injection, recouvrez d'huile minérale et placez sur la platine du microscope. Insérez les pipettes d'injection et de maintien dans leurs supports et positionnez-les dans la goutte de milieu de collecte. Activez les bouteilles d'azote reliées au pico-injecteur et à la table anti-vibrations.

Ouvrez l'extrémité de la pipette d'injection en la tapotant doucement contre la pipette de maintien tout en la remplissant de milieu. Transférez cinq à 10 sites oh de l'incubateur à la goutte de milieu de collecte sur la plateforme. Réglez maintenant les paramètres du pico-injecteur pour un volume d'injection de cinq à 10 picolitres tout en appuyant sur clear.

Déplacez l'aiguille d'injection vers la goutte de milieu et remplissez-la. Ramenez-la ensuite vers la goutte de milieu. Utilisez la pipette de maintien pour capturer un ovocyte et aligner l'ovocyte, l'aiguille d'injection et la pipette de maintien selon l'axe des x.

Avec un grossissement plus élevé, avancer la pipette d'injection à travers l'ovocyte, en prenant soin d'éviter le noyau. Une fois que la membrane plasmique est percée, appuyer sur inject ; après l'injection, retirer l'aiguille, relâcher l'ovocyte et répéter l'opération. Une fois tous les ovocytes injectés, les remettre dans l'incubateur pour les maintenir dans le milieu de culture pendant la durée souhaitée, qui varie généralement entre 12 et 24 heures.

Ensuite, lavez les cytes à travers plusieurs gouttes de CZB et transférez-les dans une microgoutte de CZB sous huile, puis incubez pendant 16 heures afin de terminer la maturation jusqu’à la métaphase de la deuxième méiose. Placez 750 microlitres de CZB contenant 100 micromolaire de Mastri dans la cavité d'une boîte de culture organotypique contenant de l'eau dans l'anneau externe. Lavez maintenant les ovules à travers plusieurs gouttes de CZB additionné de mastri, puis transférez-les dans la boîte de culture organotypique et incubez pendant une heure.

Fixez les œufs dans une coupelle de montre contenant du paraformaldéhyde à 2 % dans du PBS pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, transférez les œufs dans une solution de blocage et conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu'au traitement des œufs perméabilisés pendant 15 minutes à température ambiante. Puis rincez à l’aide de plusieurs volumes importants de solution de blocage.

Réalisez le reste de la procédure sur le couvercle d'une plaque de 96 puits protégé de la lumière dans une chambre humidifiée. À température ambiante, transférez les œufs dans des gouttes de 25 microlitres de solution de blocage pendant 15 minutes. Ensuite, pour marquer les centromères, transférez les œufs dans une goutte de solution de blocage contenant un antisérum Crest dilué au 1/40 et incubez pendant au moins une heure.

Ensuite, effectuez trois lavages avec des gouttes de solution de blocage, en incubant 15 minutes à chaque fois. Transférez les œufs dans une goutte de solution de blocage contenant l'anticorps marqué au fluoro quatre et incubez pendant une heure. Lavez deux fois avec la solution de blocage pour détecter les chromosomes.

Incuber dans une dilution au 1/5 000 de cytx vert et monter les échantillons dans cinq microlitres de solution de blocage Vector Shield. Placer quatre petits points de vaseline aux emplacements prévus pour les coins du coverslip afin d'éviter l'écrasement des œufs. Poser le coverslip et sceller avec du vernis à ongles. Conserver dans une boîte à diapositives à quatre degrés Celsius jusqu'au traitement par microscopie confocale. Lors de l'acquisition, avec un objectif 100 x, capturer des pas de 0,4 micromètre dans le plan Z et imagifier toute la région du comptage des centromères en utilisant un logiciel d'analyse d'images tel qu'Image J du NIH. Les œufs de souris euploïdes contiennent 20 paires de kinétochores, donnant un total de 40 points dans cette projection Z d'un œuf en métaphase II. L'ADN est coloré en vert et les kinétochores K sont colorés en rouge.

Les flèches indiquent deux bras chromatidiens distincts, montrant un recouvrement au kinétocore numéro 17 et au numéro 18, suite à la procédure de microinjection. D'autres méthodes, telles que le Western blot, la PCR en temps réel, l'analyse de la configuration du fuseau et de l'alignement des chromosomes, ainsi que la fécondation in vitro, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'effet de la perturbation de votre protéine d'intérêt sur la maturation mitotique et le potentiel de développement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de manipuler les sites d'ancrage et d'évaluer le PLO de la métaphase deux X.