Name: Induction et les essais de lhypoxie en culture cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Apprenez à induire l'hypoxie en culture cellulaire avec du chlorure de cobalt et à évaluer l'expression de HIF-1 alpha par western blot et détection de luminescence. Ces méthodes permettent d'étudier les réponses cellulaires à l'hypoxie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. L'hypoxie induite par CoCl 2 solutions Hexahydrate de chlorure de cobalt (II) (CoCl 2 • 6H 2 O, MO = 237,9) est un inducteur chimique de hypoxia-inducible factor-1.3 8. Ce produit est soluble dans l'eau (100 mg / ml), ce qui donne une solution claire, rouge. <ol><li> Préparer une solution stock de 25 mM jj eau stérile, (préparer immédiatement avant utilisation) </li><li> Utilisez CoCl 2 à la concentration finale de 100 microns dans votre réguliers milieux de culture cellulaire pour induire une hypoxie. </li><li> Ajoutez les 2 CoCl support contenant vos cellules et incuber les cultures pour les 24 heures dans un incubateur conventionnelle (37 ° C, 5% C0 2). </li></ol> La concentration au-dessus fonctionne pour les lignées cellulaires, nous avons testé, mais chaque lignée cellulaire devrait être testé à différentes concentrations (d'établir une courbe dose-dépendante) ainsi qu'à différents temps d'incubation afin de limiter la toxicité des médicaments liés et d'optimiser le dosage. 2. L'hypoxie induit dans Modulaire Incubateur Chambre <ol><li> Préparer au moins deux cultures cellulaires identiques (double culture). Les cultures cellulaires peuvent être dans des flacons, des plaques ou des boîtes de culture. Pour ouvrir la chambre, ouvrez tout d'abord les deux pinces en plastique blanc situé sur les tubes attachés à la chambre (tubes utilisés pour l'injection / la purge du gaz hypoxique) et ouvrir doucement la pince anneau en acier. </li><li> Communiqué de la pince. Le couvercle et les plateaux peuvent maintenant être supprimés. </li><li> Placez la culture de cellules dans la chambre hypoxique. Également placer une boîte de Petri contenant de l'eau stérile dans la chambre pour procurer une humidification adéquate des cultures. </li><li> Placer la culture "jumeau" de cellules en normoxie comme contrôle. </li><li> Assurez-vous que les plateaux sont sécurisés et ne bouge pas, et puis fermer la chambre avec son couvercle. Positionner correctement le collier bague en acier pour assurer la fermeture hermétique de la chambre et le fermer. </li><li> Pour créer une hypoxie, fixez le tuyau d'un «réservoir d'hypoxie" contenant un mélange de 1% O 2 du gaz. Si vous avez un compteur de débit connecté à votre réservoir de votre chambre sera directement relié à celui-ci (citerne de gaz à débit mètre de chambre). Nous utilisons un débitmètre incorporé dans notre régulateur. </li><li> Il est important pour la plupart, sinon tous retirer l'oxygène présent dans la chambre et dans vos médias, de le faire rincer la chambre en ouvrant le réservoir de gaz à un débit de 20 litres par minutes pour les 7-10 minutes, puis éteindre rapidement la débit de gaz et de fermer complètement la chambre en fermant deux colliers blancs. </li><li> Retour dans la chambre à une installation classique incubateur pour la période de temps désirée. Si vous utilisez de grandes cultures, permettre aux médias dans les cultures à dégazer pour 1 - 2 heures, puis répétez rincer. Les étapes ci-dessus sont basées sur les recommandations du constructeur (Billups-Rothenberg, Inc). Assurez-vous du réservoir de gaz sont correctement sécurisés à tout moment. </li></ol> Notes: <ul><li> Afin d'éliminer l'O 2 contenu dans les médias, il est conseillé de re-gaz de la chambre une fois après 1-3 heures. </li><li> Pour le temps d'incubation plus longue que 48 heures, il est également conseillé de re-gaz de la chambre. </li><li> Les capteurs d'oxygène (électrodes / manomètre) qui permettent des mesures de la O 2 contenu dans les cellules / chambre va fournir une mesure plus précise de l'O intracellulaire / chambre 2 contiennent). </li><li> La culture de cellules à des longueurs différentes de temps pour faire un temps courbe permettrait de déterminer l'expression du temps optimal de HIF-1α dans vos cellules particulières. </li></ul> 3. Evaluation de l'hypoxie <ol><li> HIF-1 α la détection par Western blot. <ol><li> Re-ouvrir votre chambre comme décrit dans la section 2.2 et placer immédiatement vos cultures sur la glace. </li><li> Lyse hypoxie cellules traitées et non traitées avec une solution de SDS à 5% dans les assiettes, puis transférer le lysat cellulaire à des tubes, soniquer, spindown les débris cellulaires et recueillir le surnageant. </li><li> Mesurer la concentration de protéines en utilisant kit BCA, préparer l'échantillon par addition de tampon de chargement et de chauffage à 95 ° C pendant 5 min. </li><li> Electrophorèse des protéines sur un 8% gel SDS-polyacrylamide et le transfert des membranes de nitrocellulose. </li><li> Bloc de la membrane dans du PBS contenant 5% non gras du lait en poudre et 0,1% de Tween 20 à la température ambiante pendant 1 heure ou à 4 ° C pendant la nuit sur le shaker. </li><li> Nuit avec des anti-HIF-1α anticorps monoclonal primaire (1 / 600) dans le même tampon immunoblot à 4 ° C. </li><li> Laver 3 fois en PBS contenant 0,1% de Tween 20 à la température ambiante, 5min à chaque fois et incuber avec HRP-anticorps secondaire (1 / 2000) dans du PBS + 0,1% Tween 20 pendant 45 min. </li><li> Laver 3 fois en PBS contenant 0,1% de Tween 20 à la température ambiante, 5min / heure. </li><li> Utilisez Pierce ECL kit et X-ray du film pour montrer la bande protéique </li></ol></li><li> L'hypoxie responsive element (HRE). HIF-1α régule de nombreux gènes (c.-VEGF, OEB) en se liant à une séquence appelée hypoxie élément régulateur (HRE). En utilisant l'EDH associé à un gène marqueur it est possible de détecter l'activité de HIF 9. Pour utiliser cette méthode, vous devez d'abord vous transfecter des cellules avec un plasmide HRE-luciférase en utilisant une méthode de transfection adapté à vos cellules. Par exemple, nous avons utilisé Lipofectamine 2000. Les cellules transfectées ont besoin d'être au moins 4 heures avant d'être incubés dans l'hypoxie et normoxie. Ce temps permet à l'ADN de pénétrer dans les cellules de sorte que cette première étape n'est pas affecté par l'hypoxie. Le signal de la luciférase est détectée en utilisant un kit Luciferase Assay. <ol><li> Incuber votre EDH cellules transfectées en hypoxie dans la chambre modulaire ou l'utilisation de cellules transfectées HRE-incubées avec CoCl 2, comprennent un contrôle normoxie. </li><li> Après la période d'incubation désirée, retirez le milieu de croissance des cellules. </li><li> Rincer les cellules dans du PBS, enlever le CPE. </li><li> Distribuer 400μl de réactif de lyse 1X dans un plat à la culture et racler les cellules attachées, puis les transférer dans un tube de micro. </li><li> Des débris par centrifugation brève. </li><li> Mélange de 20 pi lysats cellulaires surnageant avec 100 pi de réactif de dosage luciférase et de mesurer la luminescence en utilisant un luminomètre. </li></ol></li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Dans les cellules K562 (lignée cellulaire humaine de leucémie) cultivées dans les deux jours en oxygène est faible, par rapport à la normoxie, hypoxie induit une augmentation de HIF-1α protéine qui a été détectée par western blot (figure 1). Utiliser HRE-luciférase modifiée 293 cellules (embryonnaires lignée cellulaire de rein) cultivées en hypoxie, une augmentation significative de HIF-1α activité n'a été détectée dans les cellules hypoxiques (Figure 2). <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: Augmentation de HIF-1α dans les cellules hypoxiques. K562 ont été la culture en normoxie et hypoxie (chambre hypoxique) pendant 48 heures et analysés par western blot utilisant un anticorps spécifique de HIF-1α. Un anticorps spécifique de l'actine a été utilisée pour le contrôle du chargement. <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: HIF-1α activité. HRE-luciférase modifiée 293 cellules ont été cultivées en hypoxie et normoxie pendant 48 heures puis lysées pour détecter le signal luciférase en utilisant un kit de dosage de la luciférase et un luminomètre. Les résultats sont exprimés comme l'unité de luminescence relatives (RLU).

<ol><li>Swinson, D. E., O'Byrne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+hypoxia+and+epidermal+growth+factor+receptor+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer.</a> Clin Lung Cancer. 7, 250-256 (2006).</li>
<li>van Laarhoven, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+in+relation+to+vasculature+and+proliferation+in+liver+metastases+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Hypoxia in relation to vasculature and proliferation in liver metastases in patients with colorectal cancer.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 64, 473-482 (2006).</li>
<li>Hockel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+pO2+predicts+survival+in+advanced+cancer+of+the+uterine+cervix%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intratumoral pO2 predicts survival in advanced cancer of the uterine cervix.</a> Radiother Oncol. 26, 45-50 (1993).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1+and+human+disease%3A+one+highly+involved+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">HIF-1 and human disease: one highly involved factor.</a> Genes Dev. 14, 1983-1991 (2000).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1%3A+master+regulator+of+O2+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis.</a> Curr Opin Genet Dev. 8, 588-594 (1998).</li>
<li>Tatum, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%3A+importance+in+tumor+biology%2C+noninvasive+measurement+by+imaging%2C+and+value+of+its+measurement+in+the+management+of+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy.</a> Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).</li>
<li>Brahimi-Horn, M. C., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">HIF at a glance.</a> J Cell Sci. 122, 1055-1057 (2009).</li>
<li>Piret, J. P., Mottet, D., Raes, M., Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CoCl2%2C+a+chemical+inducer+of+hypoxia-inducible+factor-1%2C+and+hypoxia+reduce+apoptotic+cell+death+in+hepatoma+cell+line+HepG2%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">CoCl2, a chemical inducer of hypoxia-inducible factor-1, and hypoxia reduce apoptotic cell death in hepatoma cell line HepG2.</a> Ann N Y Acad Sci. 973, 443-447 (2002).</li>
<li>Emerling, B. M., Weinberg, F., Liu, J. L., Mak, T. W., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+regulates+p300-dependent+hypoxia-inducible+factor+1+transcriptional+activity+through+Forkhead+transcription+factor+3a+%28FOXO3a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PTEN regulates p300-dependent hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activity through Forkhead transcription factor 3a (FOXO3a).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 2622-2627 (2008).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La prolifération cellulaire et la viabilité dans des conditions hypoxiques varient beaucoup selon les types de cellules. Par conséquent, vous devriez ajuster le nombre de cellules ou le nombre de plaques cultures vous commencez avec de s&#39;assurer que vous aurez suffisamment de cellules / protéines pour vos expériences. La méthode au chlorure de cobalt a l&#39;avantage d&#39;être peu coûteux et rapide. Ce produit imite l&#39;hypoxie en induisant HIF-1/3α mais peut également réguler d&#39;autres gènes, assurez-vous que ce produit est adapté à votre projet en vérifiant quelles sont les autres effets qu&#39;elle pourrait avoir sur la fonction et le phénotype de vos cellules particulières indépendamment de la «synoptique hypoxique &quot;effet. Un autre médicament également utilisé pour imiter l&#39;hypoxie est mésylate de déféroxamine (DFO, utilisé à une concentration de 100 uM final). L&#39;utilisation de ces médicaments permet à l&#39;expérimentateur d&#39;ouvrir la plaque de culture / plat / flacon de nombreuses fois sans affecter la «condition hypoxique». Le niveau d&#39;oxygène contenue dans le mélange gazeux peut varier en fonction de vos expériences et de types de cellules comme des valeurs hypoxie varient selon les tissus et types cellulaires. En effet, certaines cellules sont hypoxiques dans 5% O 2 ont besoin d&#39;autres moins de 1% d&#39;O 2 à l&#39;hypoxie. 5% de CO 2 est ajoutée au mélange de gaz pour stabiliser le pH des cultures, le reste du gaz est habituellement de l&#39;azote. Chambres hypoxiques ont l&#39;avantage de ne pas utiliser des médicaments qui peuvent alterner le comportement des cellules, indépendamment de la tension d&#39;oxygène. Cependant, tous les types d&#39;expérimentation qui peut être fait que l&#39;oxygène rentre dans la chambre à chaque ouverture et diminue ainsi l&#39;hypoxie. Vous devriez considérer ce facteur dans vos expériences; hypoxie / réoxygénation est une condition spécifique qui peut affecter certains types cellulaires. Une alternative est d&#39;utiliser les postes de travail hypoxie (connecté à des réservoirs de gaz pré-mélangés ou à des systèmes de mélange de gaz) ou plus hypoxie incubateur (chambre de traitement hypoxie avec boîte à gants) qui permet l&#39;expérimentation de changer de support et de manipuler des cellules dans un environnement hypoxique continu. Diverses chambres hypoxiques ont été commercialisés au cours de la dernière décennie et devrait être choisi en fonction de votre laboratoire utilisés, les projets, l&#39;espace, la taille et du budget. Toujours s&#39;assurer du bon usage et l&#39;état de votre chambre afin de garantir des conditions de culture correcte. En général lors de l&#39;utilisation d&#39;une chambre, le niveau d&#39;hypoxie peut être modulée par la sélection des différents mélanges de gaz (soit 1%, 5% à 10% d&#39;oxygène). Concernant la détection de HIF-1α, il est important de savoir que certains lignée de cellules cancéreuses expriment HIF-1α en normoxie. Il est donc essentiel d&#39;utiliser une normoxie de contrôle pour déterminer le niveau basal de HIF dans ces lignées cellulaires. HIF-1α peut également être présent en normoxie de cellules non malignes après stimulation de cellules ou de stress. Cela pourrait également se produire si ces cellules sont affamés, assurez-vous des cultures de cellules sont nourrir correctement et entretenus.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Anti-HIF-1α </td><td> Invitrogen </td><td> 458400 </td></tr><tr><td> Cobalt (II) chlorure </td><td> Sigma </td><td> C8661-25G </td></tr><tr><td> Incubateur Chambre </td><td> Billups-Rothenberg </td><td> MIC-101 </td></tr><tr><td> HRE-luciférase plasmidique </td><td> Adgene </td><td> Plasmidique 26731 </td></tr></tbody></table>

induction et les essais de l&#39;hypoxie en culture cellulaire

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

L&#39;hypoxie est définie comme la réduction ou l&#39;absence d&#39;oxygène dans les organes, tissus ou cellules. Cette diminution de la tension d&#39;oxygène peut être due à une alimentation réduite en oxygène (causes incluent l&#39;insuffisance du réseau de vaisseaux sanguins, des vaisseaux sanguins défectueux, et l&#39;anémie) ou à une consommation accrue d&#39;oxygène par rapport à l&#39;offre (causée par un taux plus élevé soudaine prolifération cellulaire) . L&#39;hypoxie peut être physiologique ou pathologique, comme dans les cancers solides 1-3, etc polyarthrite rhumatoïde athérosclérose, ... Chaque tissus et les cellules ont une capacité différente pour s&#39;adapter à cette nouvelle condition. Pendant l&#39;hypoxie, l&#39;hypoxie inducible factor alpha (HIF) est stabilisée et réglemente divers gènes tels que ceux impliqués dans l&#39;angiogenèse ou le transport d&#39;oxygène 4. La stabilisation de cette protéine est une caractéristique de l&#39;hypoxie, donc la détection de HIF est couramment utilisé pour dépister 5-7 hypoxie. Dans cet article, nous proposons deux méthodes simples pour induire l&#39;hypoxie dans des cultures cellulaires de mammifères et des tests simples pour évaluer l&#39;état de ces cellules hypoxiques.

Ici, nous proposons des méthodes simples pour induire l&#39;hypoxie dans des cultures cellulaires et des tests simples pour évaluer l&#39;état des cultures hypoxiques.

Induction et les essais de l&#39;hypoxie en culture cellulaire

L'hypoxie est définie comme la réduction ou l'absence d'oxygène dans les organes, les tissus ou les cellules. Cette diminution de la tension en oxygène peut être due à un apport réduit en...

L'objectif général de cette procédure est d'induire une hypoxie en culture cellulaire. Cela est réalisé en cultivant d'abord les cellules en présence d'un inducteur chimique du facteur inductible un de l'hypoxie, ou en cultivant les cellules dans un incubateur ou une enceinte hypoxique rempli d'un mélange gazeux spécial. Ensuite, l'hypoxie est détectée en vérifiant le niveau d'expression de HIF-1α dans des extraits protéiques cellulaires, ou en mesurant son activité à l'aide d'un vecteur ENC codant pour des séquences de liaison de HIF-1α.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus montrant une augmentation des niveaux d'expression et de l'activité de HIF-1α par immunotransfert et détection de la luminescence. Je m'appelle Danny U. Je suis chercheur postdoctoral dans le laboratoire de Patrizia Inda. Aujourd'hui, je vais démontrer cette procédure pour induire une hypoxie à l'aide de chlorure de cobalt.Commencez par préparer une solution mère de chlorure de cobalt à 25 millimolaire dans de l'eau doublement distillée stérile. Ajoutez la solution aux cellules et mettez-les en culture à une concentration finale de 100 µM. Incubez les cellules pendant 24 heures à 37 °C et 5 % CO₂ pour induire un état d'hypoxie.À l’aide d’une chambre d’incubation modulaire, préparez au moins deux cultures cellulaires identiques. Toutefois, un triplet pour chaque condition est recommandé. Ouvrez la chambre d’incubation modulaire en commençant par déverrouiller les deux pinces en plastique blanc situées sur les tubes fixés à la chambre, puis retirez le couvercle et les plateaux.Placer la culture cellulaire dans une chambre hypoxique avec une boîte de Pétri contenant de l'eau stérile à l'intérieur de la chambre afin d'assurer une humidification adéquate des cultures. Placer la seconde culture cellulaire en normoxie comme témoin pour induire l'hypoxie. Relier le tube à un réservoir d'hypoxie contenant un mélange gazeux à 1 % d'oxygène.Si un débitmètre est relié à votre réservoir, la chambre sera directement connectée à celui-ci. Nous utilisons un débitmètre intégré à notre régulateur afin d'éliminer tout l'oxygène présent dans la chambre et dans le milieu. Purgez la chambre en ouvrant le réservoir de gaz à un débit de 20 litres par minute pendant quatre à sept minutes.Ensuite, arrêtez rapidement l'écoulement du gaz et fermez complètement la chambre en refermant les deux pinces blanches. Replacez la chambre dans un incubateur classique pendant la durée souhaitée.Si vous utilisez de grandes cultures, laissez le milieu et les cultures atteindre les AGD pendant une à deux heures, puis répétez la ventilation pour évaluer l'hypoxie. En utilisant la détection de HIF-1α par immunotransfert, rouvrez la chambre comme indiqué précédemment et placez immédiatement les cultures sur de la glace. Lysez les cellules traitées en conditions d'hypoxie et les cellules non traitées avec une solution SDS à 5 %.Ensuite, transférez les lysats dans des tubes et soniquez-les pour extraire les protéines, centrifugez afin de tasser les débris cellulaires et récupérez le surnageant. Puis, mesurez la concentration en protéines à l’aide d’un kit BCA. Préparez ensuite un échantillon pour gel en ajoutant du tampon de charge et en chauffant à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.Séparez les protéines sur un gel de polyacrylamide SDS à 8 % et transférez-les sur une membrane de nitrocellulose. Bloquez la membrane dans du PBS contenant 5 % de lait écrémé en poudre et 0,1 % de Tween 20, pendant une heure à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius, sur un agitateur. Incubez le blot toute la nuit avec un anticorps primaire monoclonal anti-HIF-1α dans le même tampon à quatre degrés Celsius.Le lendemain, laver le blot trois fois pendant cinq minutes chacune dans du PBS contenant 0,1 % de Tween 20 à température ambiante, puis incuber avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) dans du PBS contenant 0,1 % de Tween 20 pendant 45 minutes. Laver ensuite trois fois pendant cinq minutes chacune dans du PBS contenant 0,1 % de Tween 20 à température ambiante.Incuber ensuite la membrane dans des solutions de détection chimiluminescentes et l'exposer à un film radiographique pour mesurer l'activité de la luciférase. Retirer le milieu de croissance des cellules cultivées. Rincer les cellules dans du PBS.Ensuite, ajoutez 400 microlitres de réactif de lyse 1 x dans la boîte de culture. Grattez les cellules adhérentes et transférez-les dans un tube microcentrifuge. Pelletez les débris par une brève centrifugation.Mélangez 20 microlitres de surnageant de lyzat cellulaire avec cent microlitres de réactif d'essai de luciférase, puis mesurez la luminescence à l'aide d'un luminomètre. Les cellules K 5 62 ont été cultivées en normoxie ou en hypoxie pendant 48 heures et analysées par immunobuvardage western à l'aide d'un anticorps spécifique de H one alpha. Un anticorps spécifique de l'actine bêta a été utilisé comme contrôle de charge.Les résultats montrent une augmentation de la protéine HIF-1α dans les cellules hypoxiques. Des cellules 293 modifiées exprimant la luciférase sous le contrôle d'éléments de réponse à l'hypoxie (HRE) ont été cultivées en conditions d'hypoxie ou de normoxie pendant 48 heures, puis lysées afin de détecter un signal de luciférase à l'aide d'un kit de dosage de la luciférase et d'un luminomètre. Une augmentation de l'activité de la protéine HIF-1α a également été détectée dans les cellules hypoxiques.Les résultats sont exprimés en luminescence relative. Unités N'oubliez pas que le travail avec des gaz précis peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que la fixation sécurisée de la bouteille d'oxygène au mur ou au banc, l'ouverture et la fermeture correctes de la bouteille d'oxygène, ainsi que le contrôle de la pression doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

induction-and-testing-of-hypoxia-in-cell-culture

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

L'imagerie par bioluminescence des inducible factor-1α activité hypoxie est appliqué pour surveiller le développement intracrânienne hypoxie tumorale dans un modèle de cancer du sein métastatique cerveau de souris.

Dans l&#39;imagerie de bioluminescence in vivo de la tumeur Dynamics hypoxie des métastases cérébrales du cancer du sein dans un modèle murin

Ici, nous décrivons une méthode pour effectuer un siRNA ciblés écran "ubiquitome" pour identifier de nouveaux régulateurs de l'ubiquitine et ubiquitine de la réponse cellulaire médiée HIF1A à l'hypoxie. Ceci peut être adapté à n'importe quelle voie biologique où une lecture robuste de l'activité du rapporteur est disponible.

siRNA contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture

Cet article décrit la méthodologie de l'administration de courtes périodes de hypoxie intermittente à jour 1-8 rat ou de souris chiots postnatales. Cette approche suscite effectivement un niveau de tissu robuste »d'amorçage effet" sur les cellules progénitrices neurales cultivées qui sont récoltées dans les 30 min d'exposition à l'hypoxie.

Livraison de<em&gt; In Vivo</em&gt; Aiguë intermittente hypoxie néonatale dans Rongeurs au Premier-ventriculaire Zone dérivés de cultures de cellules progénitrices neurales

Ce manuscrit présente un modèle in vitro unique de cellules cytotrophoblastes villositaires humaines immunopurifiées cultivées sous hypoxie/réoxygénation. Ce modèle est adapté pour étudier les effets protecteurs de traitements prometteurs, tels que la mélatonine, sur les complications de la grossesse associées à une augmentation du stress oxydatif et à une altération de la fonction placentaire.

Human Trophoblast primaire Culture cellulaire de modèle pour étudier les effets protecteurs de la mélatonine contre l&#39;hypoxie / perturbation induite par la réoxygénation-

Ce manuscrit décrit le développement d’un modèle animal qui permet de tester directement les effets de l’hypoxie tumorale sur les métastases et de déchiffrer les mécanismes de son action. Bien que les expériences décrites ici se concentrent sur le sarcome d’Ewing, une approche similaire peut être appliquée à d’autres types de tumeurs.

Modèle in vivo pour tester l&#39; effet de l&#39; hypoxie sur la tumeur métastase

Nous présentons un nouveau système de chambre hypoxique à utiliser avec des organismes aquatiques tels que des embryons de grenouille et de poisson zèbre. Notre système est simple, robuste, rentable et permet l'induction et le maintien en puissance de l'hypoxie in vivo et jusqu'à 48 h. Nous présentons 2 méthodes reproductibles pour surveiller l'efficacité de l'hypoxie.

Induction de l&#39;hypoxie dans les écrevisses vivantes de grenouille et de poisson zèbre

Nous décrivons ici un protocole co-immunoprécipitation pour étudier les interactions protéine-protéine entre les protéines nucléaires endogènes dans des conditions hypoxiques. Cette méthode convient pour la démonstration des interactions entre les facteurs de transcription et les corégulateurs transcriptionnels à l’hypoxie.

Essai de co-immunoprécipitation des protéines nucléaires endogènes de cellules cultivées dans des Conditions hypoxiques

La distance spatiale est un paramètre clé dans l’évaluation des lésions d’hypoxie / réoxygénation dans un modèle de co-culture de couches cellulaires endothéliales et cardiomyocytaires séparées, suggérant, pour la première fois, que l’optimisation de l’environnement spatial de co-culture est nécessaire pour fournir un modèle in vitro favorable pour tester le rôle des cellules endothéliales dans la protection des cardiomyocytes.

Développement d’un modèle de co-culture cellulaire pour imiter l’ischémie cardiaque / reperfusion in vitro

Nous présentons un nouvel appareil pour mesurer les taux de consommation d’oxygène (OCR) dans les cultures d’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). L’appareil peut mesurer l’OCR pendant des semaines sur des EPR cultivés sur des plaques de culture cellulaire standard avec des milieux standard pendant que les plaques sont dans un incubateur de culture cellulaire standard.

Suivi à long terme des taux de consommation d’oxygène dans des cultures épithéliales pigmentaires rétiniennes hautement différenciées et polarisées

Ici, nous décrivons un protocole in vitro pour modéliser les dommages hypoxiques/réoxygénations dans les cellules épithéliales tubulaires proximales très métaboliques. Ce modèle est conçu pour induire des lésions métaboliques induites par le stress, mesurées par l’expression de marqueurs de lésions des tubules proximaux et l’évaluation de la fonction respiratoire mitochondriale.

Modélisation de l’hypoxie/lésion par réoxygénation dans les cellules épithéliales tubulaires proximales

Apprenez à induire l'hypoxie en culture cellulaire avec du chlorure de cobalt et à évaluer l'expression de HIF-1 alpha par western blot et détection de luminescence. Ces méthodes permettent d'étudier les réponses cellulaires à l'hypoxie.

Induction et les essais de l'hypoxie en culture cellulaire

Explorer plus de vidéos