Modélisation Neural signalisation immunitaire de migraine épisodique et chronique utilisant Dépression épandage In Vitro

Le but de cette vidéo est d’illustrer comment les cultures de tranches d’hippocampe peuvent être utilisées pour déchiffrer la signalisation immunitaire neuronale qui module la susceptibilité à la propagation de la dépression, la cause sous-jacente la plus probable de l’aura migraineuse et peut-être de la migraine. La propagation de la dépression est facilement évoquée dans les cultures de tranches d’hippocampe. Étant donné que les cultures sont conservées in vitro pendant des semaines, le comportement des types de cellules individuelles peut être mesuré, imité et modulé sur de longues périodes.

Ceci est particulièrement important pour l’étude de la signalisation immunitaire neuronale. Étant donné que les coupes de cerveau de l’hippocampe matures atteignent un état immunitaire quiescent, les réponses immunitaires de la propagation de la dépression peuvent être évaluées sans les effets potentiellement confondants de l’anesthésie à l’aide de techniques modernes de biologie moléculaire. La détection sensible de la signalisation des cytokines d’aussi peu que 50 cellules à environ 90 000 cellules dans une tranche peut être déterminée en conséquence.

Les cultures de tranches de cerveau de l’hippocampe sont parfaitement adaptées au développement de nouvelles thérapies immunitaires neuronales pour soulager la migraine. Je m’appelle Yian Berg et je suis Aya Puss et Heidi Mitchell du laboratoire de Richard Craig et du département de neurologie du centre médical de l’Université de Chicago. Aujourd’hui, nous allons démontrer l’utilisation de l’hippocampe du rat, des poux, des cultures et l’étude de la signalisation immunitaire de bas niveau de la dépression propagée.

La propagation de la dépression est un événement neuronal paroxystique qui est déclenché par une explosion d’activité synaptique accrue qui est ensuite rapidement suivie d’une perte transitoire de toute activité. De plus en plus de preuves montrent qu’une signalisation immunitaire de bas niveau peut influencer et en retour être influencée par l’activité synaptique dans le cerveau. Nous émettons l’hypothèse que les cytokines modulent la susceptibilité à la propagation de la dépression et, par conséquent, de l’aura migraineuse et peut-être aussi de la migraine.

Les procédures que nous décrivons ici sont conçues pour minimiser l’activation potentiellement confondante des cellules immunitaires et augmenter notre capacité à détecter la signalisation immunitaire de bas niveau. Cela nous permet de détecter le plus large éventail de signalisation immunitaire neuronale et ses interactions avec la propagation de la dépression. Pour commencer cette procédure, fabriquez des électrodes de terre en coupant des tubes de verre à des longueurs de 4,5 millimètres.

Ensuite, polissez brièvement au feu les sections coupées aux deux extrémités. Ensuite, portez à ébullition 100 millilitres d’une molaire de chlorure de potassium, ajoutez-y 3,5 grammes de gélose et 0,5 gramme d’EDTA. Remuez continuellement le mélange pour produire une solution jaune claire.

Placez un morceau de tube flexible court sur chaque tube de verre. Ensuite, aspirez la solution chaude de chlorure de potassium agri dans le tube de verre et sur une courte distance dans le tube flexible. Relâchez l’aspiration et laissez la gélose au chlorure de potassium s’égoutter lentement par l’extrémité ouverte du tube de verre.

Au fur et à mesure que la gélose s’égoutte, touchez un morceau de glace avec l’extrémité du tube de verre ouvert, ce qui incitera la gélose à se gélifier à l’extrémité de l’électrode et non à se geler après s’être retirée dans le tube de verre. Une fois que la gélose est gélifiée, retirez doucement le tube flexible sans modifier la position de l’agra. Dans les tubes en verre, mettez 0,5 millilitre d’une molaire de chlorure de potassium dans chaque puits d’un support de tube à centrifuger de 1,5 millilitre.

Placez ensuite l’extrémité de chaque tube en verre de chlorure de potassium afil dans des puits individuels pour garder les pointes humides. Ensuite, tenez un fil d’argent de calibre 15 de 80 centimètres de long avec un hémostat. Nettoyez chacun des quatre côtés en raclant le fil à travers une planche d’émeri maintenue au comptoir.

Après cela, coupez le fil en longueurs de quatre centimètres. Mettez-les dans un flacon à scintillation rempli d’eau de Javel pendant 20 à 30 minutes. Afin de placer une couche ferme d’argent à chlorure d’argent sur la surface d’argent nettoyée, pliez le fil en deux et insérez-le dans le tube de verre rempli de gélose au chlorure de potassium en laissant environ quatre à six millimètres exposés.

Enduisez ensuite l’extrémité du tube de verre contenant le fil d’argent et une petite partie du fil avec de la glu, une colle résistante à l’eau et flexible pour empêcher la gélose au chlorure de potassium de sécher, répétez l’opération pour toutes les électrodes et laissez sécher la colle pendant la nuit. Après l’étirage, conservez les électrodes dans des flacons à scintillation contenant cinq millilitres d’une molaire de chlorure de potassium et 25 milligrammes d’EDTA. Environ cinq à six électrodes par flacon à quatre degrés Celsius.

Fabriquez des électrodes d’enregistrement avec des tubes en verre de silicate avec des filaments. Ensuite, fabriquez une électrode stimulante en coupant une longueur d’environ 20 centimètres de méridium de platine recouvert de téflon. Ensuite, pliez la longueur en deux, attachez les extrémités libres en un nœud carré lâche, en laissant environ deux centimètres du nœud aux extrémités du fil.

Fixez le nœud dans le mandrin d’une perceuse électrique posée sur une table tout en tenant l’autre extrémité du fil avec un hémostat. Allumez et éteignez brièvement la perceuse jusqu’à ce que le fil soit bien tordu. Pour fixer les fils torsadés en méridium de platine aux fils conducteurs, collez d’abord le fil torsadé en méridium de platine sur une paillasse et déposez une flaque d’acide chlorhydrique concentré sur une extrémité libre du fil torsadé.

Placez ensuite l’extrémité dénudée sur un fil conducteur adjacent à l’extrémité du fil torsadé et appliquez de la chaleur à l’aide d’un fer à souder à pointe fine, puis soudez jusqu’à ce que les deux fils soient fermement attachés. Glissez une courte longueur de gaine thermorétractable sur la connexion du fil exposé et rétractez-la avec un feu thermique. Polissez la pointe d’une pipette de 15 centimètres de long et guidez le fil du méridien de platine torsadé le long de la pipette.

Utilisez un époxy hydrofuge pour sceller les deux extrémités de l’électrode. Enfin, fixez des fiches bananes aux extrémités du fil conducteur pour la connexion à l’isolateur de stimulus sous observation stéréoscopique. Placez la pointe de l’électrode dans le PBS et recherchez les bulles produites par l’électrolyse provenant uniquement de l’extrémité coupée des pointes d’électrode si des bulles proviennent des côtés des fils torsadés.

Coupez l’électrode transversalement à l’aide d’une lame de rasoir à un seul tranchant pour rétablir l’isolation intacte aux axes longs des fils. Lors du dépannage pour résoudre les effets de stimulus abbérant, essayez de faire une pointe d’électrode fraîchement coupée. Une autre étape importante consiste à préparer les boîtes d’enregistrement, qui se composent d’un insert de culture en tranches et d’une boîte de culture de 35 millimètres qui repose sur deux tiges de verre de 1,0 x 12 millimètres espacées d’environ 1,0 centimètre.

Les tiges de verre sont fixées à la base du plat en chauffant les tubes de verre, puis en les pressant dans la base avec une pince. Pour les conditions d’enregistrement statiques, ajoutez 1,5 millilitre de support dans la parabole. Ensuite, trempez un morceau de coton stérile de 10 millimètres de large et de trois à quatre centimètres de long.

Dans 1,0 millilitres de support, pliez le coton en deux le long de l’axe long et placez-le le long de la paroi intérieure de l’insert. Avec des pinces stériles, le coton humide aide à maintenir l’humidité de la vaisselle. Trois morceaux de tube compressibles de quatre millimètres de long sont également espacés autour de l’insert.

Couvrez hermétiquement le plat d’un film de polychlorure de vinyle pour permettre l’échange gazeux. Ensuite, coupez autour de sa paroi verticale médiane avec une lame de rasoir à un seul tranchant pour enlever l’excès de chlorure de polyvinyle. Le film évoque un potentiel d’environ trois champs avec des impulsions de 100 microsecondes à 0,2 hertz, en commençant par un courant d’environ un à cinq microampères suffisant pour déclencher une réponse.

Déplacez l’électrode d’enregistrement par incréments le long de l’axe long du neurone paramétallique jusqu’à ce que le potentiel de champ soit maximal. Ensuite, augmentez le courant avec une électrode d’enregistrement à cette position et notez la réponse maximale en courant d’environ 10 à 20 microampères. Enfin, utilisez l’intensité de stimulus demi-maximale pour les expériences afin de déterminer le seuil de propagation de la dépression trans synaptique.

Basculez le paradigme de stimulation pour évoquer manuellement des rafales uniques de 100 microsecondes par impulsion à 10 hertz. Augmentez progressivement l’intensité du courant par poussée de stimulus jusqu’à ce que la dépression propagée soit déclenchée. Rapport le seuil de dépression propagée dans les lums déclenche la dépression propagée toutes les neuf minutes pendant une heure.

Enregistrez environ trois zones de changements de potentiel rapides et de potentiels lents via des systèmes de traitement du signal numériques séparés. Après la dernière dépression étalée, remettez l’insert de culture dans des conditions d’incubation normales et marquez le couvercle de la boîte de culture. Pour noter la culture qui a connu la propagation de la dépression, changez de milieu tous les trois à quatre jours jusqu’à la récolte de la culture.

Commencez cette procédure en diluant la sélectine ISO à 20 microgrammes par millilitre dans un milieu de croissance. Ensuite, incubez les cultures en tranches dans des conditions d’incubation normales quatre à 10 heures avant l’imagerie, allumez la caméra du microscope, la lumière UV, le contrôle de la température et les gaz au moins une heure avant l’imagerie. Ensuite, configurez le logiciel de métamorphose pour l’imagerie, puis placez l’insert dans une boîte de culture de 35 millimètres avec deux tiges de verre d’un millimètre au fond.

Insérez ensuite trois morceaux de tube en caoutchouc de deux millimètres entre les parois de l’insert et de la boîte de culture. Pour stabiliser davantage l’insert, placez un morceau de coton de 10 millimètres de large imbibé d’un millilitre supplémentaire de support à l’intérieur de l’insert. Pour maintenir un environnement humidifié, couvrez hermétiquement le haut de la boîte de culture avec une pellicule de chlorure de polyvinyle.

Pour éviter la perte de liquide, assurez-vous que l’imagerie se concentre sur la couche de cellules paramétalliques CA trois. Notez l’orientation des tranches en prenant des photos de phase à cinq x 10 x et 20 x dans la fenêtre de mise au point fine, réglez la plage actuelle sur huit et la précision sur un clic pour trouver la mise au point pour garantir une image nette dans la fenêtre d’acquisition en accéléré. Sélectionnez l’intervalle de temps d’une minute et la durée de six heures pour capturer avec précision les mouvements microgliaux.

L’imagerie ne doit pas être moins d’une fois par minute à la fin du film. Vérifier les lésions cellulaires par CY talk dépistage pour les expériences PCR. Immergez la culture en tranches dans deux à trois millilitres d’ARN et stockez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à trois jours jusqu’à ce qu’ils soient transformés.

Pour récolter, retirez les tissus étrangers à l’aide d’un couteau en verre, mettez les tranches dans des ARN individuels. Tubes à centrifuger de 1,5 millilitre sans ADN contenant 0,5 millilitre de solution saline tamponnée au phosphate stérile. À l’aide d’un pinceau à pointe fine, les échantillons de rotation de 10 000 tr/min pendant une minute de manière stéréotypée afin que toutes les tranches adhèrent au même côté de leurs tubes.

Retirer le surnageant PBS et remettre l’échantillon en suspension dans 500 microlitres de triol. Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius ou conservez-les sur de la glace jusqu’à l’extraction de l’ARN Les changements d’expression des protéines dus à l’inactivation de l’ARN SI peuvent être évalués de manière sensible en améliorant l’immunocoloration DAB traditionnelle via l’intensification de l’argent et la quantification métrique densi ultérieure. Le paradigme d’enregistrement électrophysiologique de la culture en tranches est illustré dans lequel une microélectrode d’enregistrement est placée dans la couche de neurones paramétalliques CA trois et une électrode de stimulation bipolaire est placée dans le gyrus denté.

Voici un exemple des potentiels de champ CA trois évoqués par la stimulation du gyrus denté, qui est utilisé pour établir la réponse demi-maximale ici montre les réponses potentielles de champ CA trois à des rafales de 10 hertz restantes qui ont été progressivement augmentées d’une intensité pour finalement déclencher une dépression propagée. En bas à droite. On voit ici une cellule immunitaire vitale exemplaire.

Cette imagerie démontre pour la première fois qu’une fraction de la microglie se déplace sur de longues distances selon un schéma de recherche optimal, comme l’indique le rouge, connu sous le nom de vols de Levy, qui sont inversement proportionnels à l’activité synaptique. L’amplification précoce de l’ADNC permet la détection de l’IFN gamma dans les cultures de tranches d’hippocampe. Initialement, le CT d’un gène de référence RPL 13 A était de 20,5 et l’IFN gamma était indétectable sur la gauche.

Cependant, après l’amplification de Preem indiquée à droite, l’IFN gamma a été facilement détecté à 29.0. Avec RPL 13 A enregistré à 14,1 pour indiquer une augmentation de 12 fois de l’amplification du signal, la confirmation immunohistochimique d’une efficacité est montrée ici. L’intensification différenciée de l’argent de la peroxydase diamine benzine immunocoloration est utilisée pour quantifier la réduction significative de la production de cyclophiline B dans les cultures de tranches d’hippocampe traitées par siRNA Une fois maîtrisées.

Les techniques décrites dans cette vidéo peuvent être réalisées sur plusieurs jours. Nous tenons à souligner que nos cultures de coupes d’hippocampe se rapprochent étroitement de leurs homologues in vivo et sont idéales pour étudier la signalisation immunitaire et la propagation de la dépression. Cependant, il est essentiel de maintenir un environnement immunitaire quiescent dans des conditions de contrôle et de simulacre.

Pour minimiser l’activation immunitaire confondante, les cultures doivent être maintenues dans des conditions stériles. Ils ne doivent pas être exposés à des perturbations chimiques, mécaniques ou thermiques excessives. Étant donné que la signalisation physiologique des cytokines se produit au niveau femto-molaire, des techniques de mesure très sensibles et reproductibles doivent être appliquées.

Nous utilisons la technologie PCRA et des techniques protéomiques sensibles. Enfin, les cytokines sont à la fois pléiotropes et redondantes. En conséquence. Les cibles de cytokines multiplexes mesurées au fil du temps sont utiles pour étudier comment la signalisation immunitaire module la susceptibilité à l’entorse, à la dépression et, par extension, à la migraine.