Name: Un débit élevé In situ pour caractériser les modes dexpression dARNm dans les fœtus de souris tractus urogénital (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Apprenez une méthode d'hybridation in situ à haut débit pour visualiser les patterns d'expression d'ARNm dans le tractus urogénital inférieur fœtal de souris. Cette technique efficace permet d'étudier la localisation spatiale et temporelle des transcrits à faible et forte abondance.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Lan Yi, Cancer Institute du New Jersey, de l&#39;assistance technique dans la préparation de paniers de tissu. Ce travail a été financé par les Instituts nationaux de subventions et de santé DK083425 DK070219.

<ol><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+%28Tfm%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22National+Cancer+Institute+Monographs%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li>
<li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li>
<li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li>
<li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

En utilisant la méthode décrite ici, il est possible de détecter des ARNm dans tous les principaux types de cellules et de tissus compartiments de l&#39;LUT foetus de souris mâle et femelle, y compris les plaquettes mésenchymateuses, urothélium, muscle lisse, les bourgeons de la prostate, canal éjaculateur, et le vagin. Les sections 50 microns utilisé dans ce protocole ont l&#39;avantage d&#39;être assez épaisse pour résoudre l&#39;architecture des tissus (tels que les vaisseaux sanguins), mais sont suffisamment minces ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Anticorps anti-digoxigénine, des fragments Fab </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td> Réactif de blocage </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BM Violet AP substrat, précipitant </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td> Albumine de sérum bovin </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td></tr><tr><td> Plaque de culture cellulaire, 24 puits </td><td> Corning </td><td> 3524 </td></tr><tr><td> Digoxigénine 11-UTP </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTP </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td> Lame de rasoir à double tranchant </td><td> Wilkinson Sword </td><td> Modèle classique </td></tr><tr><td> Eliminase RNase remover </td><td> Laboratoires Decon </td><td> 1102 </td></tr><tr><td> Formamide </td><td> Sigma </td><td> F5786-1L </td></tr><tr><td> Kit d&#39;extraction de gel </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> Glutaraldéhyde, solution à 25% dans H 2 O </td><td> Sigma </td><td> G6257-100ML </td></tr><tr><td> L&#39;héparine, le sel de sodium </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td></tr><tr><td> Le peroxyde d&#39;hydrogène, solution à 30% dans H 2 O </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td></tr><tr><td> Lévamisole </td><td> Sigma </td><td> L9756 </td></tr><tr><td> Loctite 404 adhésifs rapidement mis instantanée </td><td> Henkel Corp </td><td> 46551 </td></tr><tr><td> Le chlorure de magnésium </td><td> Fisher Scientific </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> L&#39;acide maléique </td><td> Sigma </td><td> M0375-500G </td></tr><tr><td> Microtubes 1,5 ml </td><td> Research Company Biologix </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Insérez Millicell la culture </td><td> Millipore </td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td> Molecular résine de broyage </td><td> G-Biosciences </td><td> 786-138PR </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde, solution à 4% en tampon phosphate salin </td><td> Affymetrix </td><td> 19943 </td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin, sans Ca &amp; Mg </td><td> MP Biomédical </td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td> Filet de polyester, 33 microns, 12 &quot;x 24&quot; </td><td> Petite Parts Inc </td><td> CMJ-0033-D </td></tr><tr><td> Solution de protéinase K, 20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195-5ML </td></tr><tr><td> Colonnes QIAshredder </td><td> Qiagen </td><td> 79654 </td></tr><tr><td> Solution Q </td><td> Qiagen </td><td> Fourni avec l&#39;ADN polymérase Taq </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma </td><td> R6513 </td></tr><tr><td> Inhibiteur de RNase </td><td> Roche Applied Science </td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RQ1 RNase DNase </td><td> Promega </td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque faible point de fusion d&#39;agarose </td><td> Lonza </td><td> 50101 </td></tr><tr><td> Les moutons de sérum </td><td> Sigma </td><td> S2263-500ml </td></tr><tr><td> Stericup unité de filtre, 0.22μm, polyéthersulfone, 500mL </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> L&#39;azide de sodium, granuleux </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227I-100 </td></tr><tr><td> Le chlorure de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP358-212 </td></tr><tr><td> Dodécyl sulfate de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529-500 </td></tr><tr><td> SSC, 20X solution </td><td> Produits de la recherche internationale </td><td> S24022-4000.0 </td></tr><tr><td> SuperScript III système de synthèse du premier brin </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7 RNA polymérase </td><td> Roche Applied Science </td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> Taq ADN polymérase </td><td> Qiagen </td><td> 201203 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP153-1 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Vibrant microtome avec baignoire spécimen de luxe </td><td> Leica Microsystems </td><td> VT1000A </td></tr><tr><td> Levure ARNt </td><td> Roche Applied Science </td><td> 109495 </td></tr></tbody></table>

un débit élevé in situ</emméthode d&#39;hybridation> pour caractériser les modes d&#39;expression d&#39;arnm dans les fœtus de souris tractus urogénital

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Développement de la partie inférieure tractus urogénital (LUT) est un processus complexe. Cette complexité se manifeste lors de la formation de la prostate de l&#39;urètre fœtus de sexe masculin, qui repose sur les signaux des androgènes et des épithélio-mésenchymateuse 1,2 interactions. Comprendre les mécanismes moléculaires responsables de l&#39;élaboration de la prostate peut révéler des mécanismes de croissance qui sont mal réveillé tard dans la vie pour donner naissance à des maladies de la prostate tels que l&#39;hyperplasie bénigne de la prostate et le cancer de la prostate. Le LUT développement est anatomiquement complexes. Par la prostate de temps en herbe commence le jour après la conception 16.5 (DPC), de nombreux types cellulaires sont présents. Vascularisation, les nerfs et les muscles lisses résident dans le stroma mésenchymateux 3. Ce stroma entoure un épithélium multicouches et donne lieu à la prostate fœtale par androgènes dépendante du récepteur de signaux paracrines 4. L&#39;identité de la stromales androgènes récepteurs réceptif gènes nécessaires pour le développement de la prostate et le mécanisme par lequel les formes de la prostate épithélium canalaire en réponse à ces gènes n&#39;est pas entièrement comprise. La capacité à identifier précisément les types de cellules et de localiser l&#39;expression de facteurs spécifiques en leur sein est impératif de mieux comprendre le développement de la prostate. L&#39;hybridation in situ (ISH) permet pour la localisation des ARNm dans un tissu. Ainsi, cette méthode peut être utilisée pour identifier motif et le calendrier de l&#39;expression de molécules de signalisation et leurs récepteurs, ce qui élucider les régulateurs de la prostate potentiel de développement. Ici, nous décrivons une technique à haut débit ISH pour identifier les modèles d&#39;expression d&#39;ARNm dans la LUT fœtus de souris à l&#39;aide vibrant microtome coupe sections. Cette méthode offre plusieurs avantages sur d&#39;autres protocoles de l&#39;ISH. Exécution ISH, sur coupes fines adhéré à une diapositive est techniquement difficile; cryocoupes ont souvent mauvaise qualité de la structure alors que les deux sections de paraffine et de cryocoupes aboutissent souvent à la résolution du signal faible. Exécution ISH sur les tissus monture entier peut entraîner le piégeage de la sonde. En revanche, notre technique à haut débit utilise coupe épaisse sections qui révèlent l&#39;architecture du tissu détaillés. Microtubes de modification permettre une manipulation facile des sections lors de la procédure ISH. Un maximum de 4 transcrits d&#39;ARNm peut être projeté à partir d&#39;un simple LUT 17.5dpc avec jusqu&#39;à 24 transcrits d&#39;ARNm détectés en un seul passage, réduisant ainsi les coûts et maximiser l&#39;efficacité. Cette méthode permet de multiples groupes de traitement pour être traitées de façon identique et comme une seule unité, éliminant ainsi tout biais d&#39;interprétation des données. La plupart des chercheurs de la prostate pertinemment, cette méthode fournit une localisation spatiale et temporelle de haute et basse transcrits d&#39;ARNm abondance dans l&#39;urètre fœtus de souris qui donne naissance au réseau de la prostate canalaire.

Ici, nous décrivons un débit à haute efficacité<em&gt; In situ</emL&#39;hybridation&gt; (ISH) méthode pour visualiser les modèles de l&#39;expression des ARNm dans le développement du fœtus de souris de la prostate sections de tissu. La méthode peut être facilement adapté à visualiser les profils d&#39;expression des ARNm dans les tissus de la souris ou dans des tissus provenant d&#39;autres espèces.

Un débit élevé In situ</emMéthode d&#39;hybridation> pour caractériser les modes d&#39;expression d&#39;ARNm dans les fœtus de souris tractus urogénital

Le développement des voies urogénitales inférieures (VUI) est un processus complexe. Cette complexité est mise en évidence lors de la formation de la prostate à partir du phallus masculin fœtal...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser les profils d'expression des ARNm dans les tissus fœtaux murins en développement du tractus urogénital inférieur. Cela est réalisé en premier lieu par la synthèse d'une sonde ribo marquée à l'uridine diphosphate digoxigénine à partir d'un modèle généré par PCR. La deuxième étape de la procédure consiste à produire des coupes épaisses à l'aide d'un microtome vibrant.La troisième étape consiste à réaliser une hybridation in situ sur des sections du tractus urogénital inférieur placées dans des paniers sur mesure. Les ARNm sont visualisés par détection immunohistochimique des sondes ribonucléiques liées, à l'aide du substrat précipitant de phosphatase alcaline BM purple. Enfin, la microscopie permet de révéler la localisation spatiale et temporelle des transcrits d'ARNm peu ou fortement abondants dans le tractus urogénital inférieur du fœtus de souris.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'immunohistochimie est que les sondes ribo sont faciles à produire et peuvent être conçues pour reconnaître la plupart des ARNm du génome entier de la souris. Bien que cette méthode permette d'ob

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Ultra-haute ultrasons de fréquence est un outil d'imagerie en temps réel puissant pour examiner les anomalies cardiaques chez les petits animaux. Son caractère non invasif permet de maintenir l'état physiologique de l'embryon. Ici, nous montrons l'utilisation du mode M ultrasons pour mesurer les taux d'embryons de coeur à -18,5 in utero.

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Double Mont entier hybridation in situ d&#39;embryons de poulet début

Apprenez une méthode d'hybridation in situ à haut débit pour visualiser les patterns d'expression d'ARNm dans le tractus urogénital inférieur fœtal de souris. Cette technique efficace permet d'étudier la localisation spatiale et temporelle des transcrits à faible et forte abondance.

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