Un débit élevé In situ pour caractériser les modes d'expression d'ARNm dans les fœtus de souris tractus urogénital

L'objectif général de cette procédure est de visualiser les profils d'expression des ARNm dans les tissus fœtaux murins en développement du tractus urogénital inférieur. Cela est réalisé en premier lieu par la synthèse d'une sonde ribo marquée à l'uridine diphosphate digoxigénine à partir d'un modèle généré par PCR. La deuxième étape de la procédure consiste à produire des coupes épaisses à l'aide d'un microtome vibrant.

La troisième étape consiste à réaliser une hybridation in situ sur des sections du tractus urogénital inférieur placées dans des paniers sur mesure. Les ARNm sont visualisés par détection immunohistochimique des sondes ribonucléiques liées, à l'aide du substrat précipitant de phosphatase alcaline BM purple. Enfin, la microscopie permet de révéler la localisation spatiale et temporelle des transcrits d'ARNm peu ou fortement abondants dans le tractus urogénital inférieur du fœtus de souris.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'immunohistochimie est que les sondes ribo sont faciles à produire et peuvent être conçues pour reconnaître la plupart des ARNm du génome entier de la souris. Bien que cette méthode permette d'obtenir des informations sur les profils d'expression des ARNm durant le développement urinogénital fœtal de la souris, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes organiques, espèces et stades de développement. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car l'incorporation du tissu dans l'auger peut être difficile à maîtriser, et de légères variations d'orientation peuvent entraîner des résultats incohérents. Au moins un jour avant la préparation du tissu, retirez et jetez la membrane d'une plaque de culture cellulaire milli de 12 millimètres de diamètre, tout en conservant l'anneau restant qui servira de moule ; faites tremper les anneaux toute la nuit dans une solution d'inhibiteur d'ARNs.

Le jour du protocole, disséquer un tractus urogénital inférieur de souris qui a été réhydraté avec du méthanol à concentration progressive. Après des lavages au PBS Tween, jeter environ les deux tiers de la vessie et conserver le tissu restant du tractus urogénital inférieur dans du PBS Tween. Placer ensuite un moule annulaire traité sur une lame de microscope en verre et le remplir avec une solution à 4 % d'agarose à bas point de fusion à 62 degrés Celsius, puis laisser refroidir pendant environ deux minutes.

À présent, bloquez par assèchement le tissu du tractus urogénital inférieur et immergez-le dans la solution d'agarose. Utilisez une pince pour orienter le tissu de manière à ce qu'il soit suspendu à mi-chemin entre le haut et le bas de l'anneau. Incubez le montage à quatre degrés Celsius jusqu'à ce que l'agarose soit solidifiée.

Avant de découper le tissu, préparez un scalpel Wilkinson personnalisé en le rinçant avec des solvants, puis de l'eau. Séparez la lame double dans le sens de la longueur en deux lames simples. Ensuite, soutenez la lame Wilkinson avec une lame de microtome.

Pour ce faire, commencez par couper la lame de microtome à la longueur de la lame Wilkinson. Ensuite, à l’aide d’un adhésif Lock Tite, collez la lame de microtome sur la lame Wilkinson en la décalant d’environ trois à quatre millimètres par rapport au bord tranchant. Fixez maintenant la lame renforcée sur le microtome vibrant et réglez l’angle de la lame à 35 degrés.

Préparez le bain pour spécimen de luxe en remplissant le récipient avec du PBS et en disposant de la glace pilée humide autour. Avant de monter le tissu inclus dans le bouchon, retirez-le du moule en anneau et séchez légèrement la surface inférieure. Collez ensuite la surface séchée sur le disque de montage à l’aide d’un adhésif Loctite.

Insérez le disque dans le vibrotrancheur et réglez l'épaisseur de coupe à 50 micromètres, la vitesse à deux et l'amplitude de la lame à quatre. Pendant la coupe des sections tissulaires, utilisez une pince effilée pour transférer chaque section dans une plaque de culture de 24 puits remplie d'un demi-millilitre de PBS tween glacé. Après la section, retirez la majorité de l'arros autour de chaque section tissulaire à l'aide de ciseaux à ressort avant de commencer l'hybridation INI ; les sections peuvent être conservées jusqu'à 48 heures à quatre degrés Celsius dans du PBS tween contenant deux millimolaires d'azoture de sodium.

Tout d'abord, fabriquez des paniers d'échantillons personnalisés en découpant le fond d'un tube de microcentrifugeuse à la graduation de 100 microlitres. Chauffez le bord du tube à la flamme jusqu'à ce que le plastique devienne souple. Ensuite, appuyez fermement le plastique ramolli sur un carré de treillis métallique.

Laisser durcir et couper l'excès de treillis. Terminer les paniers en utilisant une aiguille chauffée de calibre 18 pour percer deux trous dans chaque couvercle de tube. Préparer un plateau destiné à accueillir les paniers d'échantillons en perçant 24 trous de 12 millimètres espacés régulièrement dans le couvercle d'une plaque de 24 puits.

Chaque trou doit être positionné directement au-dessus d'un puits avant de commencer à préchauffer une chambre d'hybridation couverte, remplie d'un demi-pouce d'eau du robinet à 60,5 degrés Celsius. Commencez l'hybridation in situ en ajoutant deux millilitres de PBS tween dans chaque puits de la plaque de culture à 24 puits. Couvrez cette plaque avec le couvercle préparé chargé de paniers.

Transférez maintenant les sections tissulaires dans les paniers à température ambiante avec agitation, incubez les sections dans une solution de peroxyde d'hydrogène à 6 % avec du PBS contenant du Tween, puis effectuez une série de lavages au PBS avec Tween, une incubation avec la protéinase K, une autre fixation et d'autres lavages. Pour terminer la préparation des échantillons, ajoutez deux millilitres du tampon de pré-hybridation préchauffé dans chaque puits et incubez la plaque à l'intérieur de la chambre d'hybridation chauffée pendant au moins une heure. Démarrez l'hybridation en ajoutant 0,5 microgramme de sonde RIBA marquée à chacun.

Ensuite, poursuivre l'incubation toute la nuit dans la chambre d'hybridation chauffée. Le jour suivant, laver les tissus avec la solution un en passant progressivement à la solution deux, puis traiter avec les ARN. Laver ensuite dans la solution trois, suivis de lavages dans du TBS tween et du tampon de blocage des tissus, tandis que les tissus s'incubent dans le tampon de blocage des tissus.

Commencez une incubation d'au moins deux heures de l'anticorps anti-dig dans du tampon d'absorption des anticorps à quatre degrés Celsius après la période d'incubation. Centrifugez la solution d'anticorps à 10 000 tr/min pendant une minute. Pour éliminer les substances insolubles, ajoutez la Senna à deux millilitres de solution d'anticorps tamponnée.

Retirez maintenant le tissu du tampon de blocage et incubez-les dans la solution d'anticorps préparée. Conservez-les toute la nuit dans une chambre d'hybridation à quatre degrés Celsius le troisième jour de la procédure. Lavez les tissus plusieurs fois dans du TBST avec l'ole.

Ensuite, à l’aide d’une pipette en verre pour pâtes, transférez soigneusement les tissus dans des tubes de microcentrifugation propres. Lavez les tissus pendant 10 minutes avec un millilitre de NTM vide.

Ensuite, remplacez la solution par du TMT contenant du MBM lava sole violet. Placez les tubes à l’obscurité et, au cours des jours suivants, surveillez le développement de la couleur et changez la solution selon les besoins. Une fois le développement complet de la couleur obtenu, rincez brièvement les tissus avec du TMT contenant du lava so, puis incubez-les toute la nuit à quatre degrés Celsius dans du PBS contenant du paraformaldéhyde.

Le lendemain, décolorez et lavez les tissus. Les sections sont désormais prêtes à être observées en imagerie. Le tissu du tractus urogénital inférieur a été inclus dans de l'agar de manière à ce que la ligne médiane urétrale soit parallèle à la surface plane du bouchon d'agar.

Cette orientation a produit des sections sagittales. Des paniers à échantillons fabriqués sur mesure ont protégé les sections de tissu délicates contre la poussière et les particules. Pendant la procédure d'hybridation in situ en plusieurs jours dans C deux.

Ils ont également empêché la perte de sections quelconques. Il est difficile de limiter la coloration de fond pendant les longues incubations nécessaires à la détection des ARNm peu abondants. Toutefois, l'ajout d'azoture de sodium et la filtration ultérieure semblent avoir réduit la coloration de fond.

De plus, aucune différence visible dans la coloration de fond n'a été observée lorsque les échantillons ont été incubés dans la solution de développement de la couleur pendant des périodes prolongées. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six jours si elle est correctement exécutée. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'immunohistochimie peuvent être effectuées afin de déterminer si le profil d'expression des ARNm correspond au profil d'expression des protéines.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment visualiser les profils d'expression des ARNm et le développement du tractus génital inférieur chez la souris.