Une In Vitro Système d'étude dormance tumorale et le commutateur à la croissance métastatique

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer en temps réel et de manière haut débit l'effet d'agents potentiels sur la dormance des cellules tumorales et/ou l'émergence depuis cette dormance, en utilisant le présent essai in vitro pour modéliser la dormance tumorale ou le passage à une croissance métastatique. Ceci est réalisé en cultivant d'abord des cellules tumorales dormantes et/ou métastatiques dans un système tridimensionnel d'extrait de membrane basale, ou système BME, adapté à une plaque de 96 puits. Lorsqu'elles sont cultivées dans ce système 3D, les cellules métastatiques entrent dans une phase transitoire, dormante ou quiescente.

En revanche, les cellules tumorales dormantes in vivo entrent dans un état de quiescence prolongé. Dans le système de culture en 3D, les cellules métastatiques peuvent ensuite être traitées par des agents candidats afin d'empêcher leur passage de la quiescence à la prolifération. Alors que les cellules tumorales dormantes peuvent être traitées par des agents candidats susceptibles d'induire leur passage de la quiescence à la prolifération.

Le comportement prolifératif des cellules dormantes et métastatiques suite au traitement sera évalué en ajoutant le réactif du kit d'essai de prolifération cellulaire Cell Titer 96 Aqueous One Solution aux points temporels souhaités, puis en analysant les résultats à l'aide d'un lecteur de plaque ELIZA. Les résultats obtenus montrent l'effet du traitement sur la prolifération cellulaire des cellules tumorales, qu'elles soient dormantes ou métastatiques, selon un essai de prolifération cellulaire dans le système 3D. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la métastase, telles que les facteurs et mécanismes cellulaires qui maintiennent les cellules tumorales disséminées dans un état de dormance, ainsi que les facteurs et mécanismes cellulaires qui induisent le passage de la dormance tumorale à la métastase clinique Thaw.

Le facteur de croissance Qualtrics a réduit le BME dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant la nuit, la veille de la réalisation du test de prolifération. Ensuite, le jour du test, sélectionnez une culture de cellules tumorales dormantes ou métastatiques pour l'expérience. Puis, placez une plaque de 96 puits sur un plateau de glace à l'intérieur d'une hotte ou d'une cabine.

Ensuite, utilisez un distributeur équipé d'une seringue pour recouvrir chaque puits de la plaque de 50 microlitres de BME décongelé et glacé. Veillez à ce qu'aucune bulle ne se forme dans les puits. Placez la plaque de 96 puits recouverte de BME dans une enceinte d'incubation humide contenant 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, placez un flacon de trypsine à 37 degrés Celsius pour la réchauffer pendant que la plaque recouverte de BME incube.

Aspirez le milieu des cellules tumorales. Rincez les plaques de culture avec 10 millilitres de PBS. Ensuite, aspirez le PBS et ajoutez deux millilitres de trypsine préchauffée aux plaques de culture.

Incuber les plaques pendant cinq minutes. Ajouter cinq millilitres de DMEM à forte teneur en glucose, complété avec 10 % de FCS et des antibiotiques, dans un tube conique de 15 millilitres. Pendant ce temps.

Après l'incubation, transférez les cellules détachées dans l'éprouvette de 15 millilitres et comptez les cellules. Ensuite, centrifugez le nombre total de cellules à cultiver dans une centrifugeuse de culture tissulaire pendant cinq minutes à 1500 G à température ambiante. Aspirez soigneusement le surnageant.

Laissez un peu de milieu, car dans la plupart des cas, le culot n'est pas visible. Ensuite, tapez doucement le fond du tube pour vous assurer d'obtenir une suspension monocellulaire. Puis, resuspendez le culot avec 100 microlitres de milieu d'essai pour tout lot de deux fois 10 à la puissance trois cellules.

Triturer les cellules plusieurs fois à l’aide d’une pipette de cinq millilitres afin de garantir le maintien d’une suspension monocellulaire. Déposer 100 microlitres de suspension cellulaire par puits dans la plaque BME revêtue de 96 puits pour la plaque de contrôle de dévaluation du fond. Ajouter en outre 100 microlitres par puits de milieu d’essai à seulement quelques puits de la plaque BME revêtue de 96 puits. Incuber ensuite les plaques, aspirer l’ancien milieu et nourrir les cellules avec du nouveau milieu d’essai tous les quatre jours.

Pour évaluer la prolifération cellulaire, ajouter 20 microlitres de la solution aqueuse Cell Titer 96 provenant d'un kit de dosage de la prolifération cellulaire par puits à chaque plaque de 96 puits à analyser au point temporel expérimental souhaité. Incuber les plaques pendant deux heures. Ensuite, à l'aide d'un lecteur de plaque ELISA, enregistrer l'absorbance des puits expérimentaux et des puits de fond à 490 nanomètres en prévision de l'immunofluorescence.

Coloration des molécules de signalisation cellulaire et des cellules tumorales : décongeler une BME dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant la nuit précédant la coloration. Le jour de la coloration, placer un système de lame en verre à huit chambres sur un bac à glace à l'intérieur d'une hotte ou d'une cabine. Ensuite, utiliser une pipette de 200 microlitres pour recouvrir chaque puits du système de lame en verre avec 50 microlitres de BME glacée.

Veillez à ce que le BME soit réparti uniformément et qu'aucune bulle ne se forme dans les puits. Incubez les lames recouvertes pendant 20 minutes. Sélectionnez une lignée cellulaire tumorale dormante ou métastatique.

Récupérez les cellules en utilisant la trypsine comme décrit précédemment. Ensuite, regroupez le nombre total de cellules à cultiver dans un tube conique de 15 millilitres. Faites maintenant centrifuger les cellules, aspirez soigneusement le surnageant à nouveau, en laissant un peu de milieu derrière.

Pour le culot, secouez doucement le fond du tube conique de 15 millilitres afin d'obtenir une suspension unique de cellules. Resuspendez le culot avec 400 microlitres de milieu d'essai pour chaque groupe de cinq fois 10 à la puissance 3 cellules. Pipetez plusieurs fois les cellules avec une pipette de 5 millilitres afin de maintenir une suspension monocellulaire, puis déposez 400 microlitres de solution cellulaire par puits dans chacune des huit chambres revêtues de BME.

Ensuite, incuber le système de lame en verre, aspirer le milieu ancien et alimenter les cellules avec un nouveau milieu d'essai tous les quatre jours aux points temporels expérimentaux souhaités. Aspirer la couche supérieure du milieu et ajouter 200 microlitres de fixateur supplémenté en triton, puis incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, aspirer le fixateur supplémenté en triton et ajouter 200 microlitres de fixateur seul, puis incuber à température ambiante pendant 25 minutes supplémentaires.

Aspirez de nouveau le fixatif, puis ajoutez maintenant 400 microlitres de PBS à chaque puits. Incubez la plaque pendant encore 10 minutes à température ambiante. Ensuite, aspirez le PBS et ajoutez 400 microlitres de PBS contenant 0,05 % compris entre 20 et incubez pendant 10 minutes supplémentaires.

Aussi à température ambiante. Bloquez ensuite les cellules avec 200 microlitres de solution de blocage. Incubez alors les cellules à température ambiante pendant une heure ; après l'incubation, aspirez la solution de blocage et ajoutez 200 microlitres d'anticorps primaire dilué dans la solution de blocage à chacun.

Incuber correctement les lames avec l'anticorps primaire toute la nuit à quatre degrés Celsius le jour suivant. Aspirer l'anticorps, puis laver les puits trois fois en ajoutant 400 microlitres de PBS pendant 15 minutes, puis en aspirant la solution après chaque étape. Après avoir aspiré le PBS du dernier lavage, ajouter 200 microlitres d'un anticorps secondaire conjugué à la rodamine rouge.

Ensuite, recouvrez le système de lame à huit chambres avec du papier d'aluminium et incubez une heure à température ambiante. Puis, lavez les puits trois fois avec du PBS comme précédemment, après le troisième lavage, montez les lames dans un milieu de montage beta shield avec dpi.

Enfin, faites sécher les lames pendant 40 minutes à température ambiante et à l'abri de la lumière. Voici un exemple d'analyse de prolifération des cellules tumorales dormantes D 2.0 R et métastatiques D two A one en culture 3D. Les cellules D 2.0 R restent dormantes tout au long de la période expérimentale de 14 jours en culture, tandis que les cellules fortement métastatiques D two A one demeurent dormantes uniquement pendant quatre à six jours de culture, après quoi elles commencent à proliférer durant la phase initiale de dormance.

De nombreuses cellules restent solitaires en culture 3D, comme illustré ici sur une photo représentative d'une culture du jour quatre, tandis que d'autres cellules non prolifératives forment des stéroïdes multicellulaires. La transition des cellules D deux A un d'un état dormant à un état prolifératif en culture 3D est montrée ici sur cette image d'une culture du jour 12. Elle est associée à des changements morphologiques cellulaires spectaculaires sur cette figure.

Un exemple d'agent empêchant les cellules D two A one de passer d'un état dormant à un état prolifératif est illustré par le traitement des cellules D two A one avec un inhibiteur spécifique de la kinase de la chaîne légère de la myosine. Maintenir les cellules D two A one dans un état dormant comme indiqué sur cette figure. Une augmentation significative de la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine dans les cellules D two A one en rouge, suivie d'une réorganisation des filaments d'actine F formant des fibres de stress d'actine en vert, se produit lors de leur transition de la dormance (jours un à quatre) vers la prolifération.

Jour sept. Toutefois, le blocage de l'activité de la kinase de la chaîne légère de la myosine dans les cellules D deux A un par SHRA ou par le médicament ML sept maintient les cellules D deux A un dans un état dormant et entraîne l'inhibition de la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine, de l'F act et de l'organisation des fibres de stress, comme on le voit ici. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mettre en place le système de modèle in vitro pour étudier la dormance tumorale et le passage à une croissance métastatique.