Name: Mesure biochimique de lhypoxie néonatale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Découvrez la mesure des marqueurs biochimiques de l'hypoxie néonatale par HPLC et GC/MS. Cette méthode permet d'analyser les métabolites plasmatiques pour le diagnostic et la gestion clinique des nouveau-nés.

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les méthodes décrites ici permettent l&#39;évaluation de l&#39;ischémie hypoxie néonatale. Ce protocole combine les mesures de marqueurs de l&#39;énergie (ATP) la privation, le stress oxydatif, dommage oxydatif, et l&#39;activité enzymatique de gagner une image globale biochimique de la présence ou même le degré d&#39;ischémie hypoxique. Malgré l&#39;utilité de cette méthode, il ya des limites potentielles. Premièrement, il faut environ 1-2 ml de sang pour recueillir suffisamment de plasma pour exécuter tous les tests. ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> 6ml K3E tubes EDTA K3 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 2204061 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse 5702R </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05413319 </td><td> Avec 13 et adaptateur 16MM </td></tr><tr><td> Microtube 1.5ml </td><td> Etats-Unis scientifique </td><td> 1615-5599 </td><td></td></tr><tr><td> 2-aminopurine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3509 </td><td></td></tr><tr><td> Varian Cary 100 spectrophotomètre </td><td> Technologies Agilant </td><td> 0010071500 </td><td></td></tr><tr><td> Savant SpeedVac </td><td> Thermo Scientific </td><td> SC210A-115 </td><td></td></tr><tr><td> Micron dispositif centrifuge de filtre </td><td> Fisher Scientific </td><td> UFC501596 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC-18-S Colonne </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 58931 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC-18-S Supelguard cartouche et titulaire </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 59629 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC </td><td> Eaux </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vial SMGC </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03376607 </td><td></td></tr><tr><td> DL-Allantoïne-5 -13 ° C; 1 -15 N </td><td> CDN isotopes </td><td> M-2307 </td><td> Lot # L340P9 </td></tr><tr><td> MTBSTFA </td><td> Thermo Scientific </td><td> 48920 </td><td></td></tr><tr><td> Pyridine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270970 </td><td></td></tr><tr><td> 5973E CPG / MSD </td><td> Agilent Technologies </td><td> G7021A </td><td> Partie # pour 5975E GC / MS </td></tr><tr><td> 3-Ethoxymethacrolein </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 232548 </td><td></td></tr><tr><td> Hydroxyde de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Dichlorométhane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270997 </td><td></td></tr><tr><td> Le benzène </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401765 </td><td></td></tr><tr><td> Diisopropyléther </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 38270 </td><td></td></tr><tr><td> BHT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1378 </td><td></td></tr><tr><td> Éthanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459844 </td><td></td></tr><tr><td> Phénylhydrazine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P26252 </td><td></td></tr></tbody></table>

mesure biochimique de l&#39;hypoxie néonatale

Biochemical Measurement of Neonatal Hypoxia

L&#39;ischémie néonatale hypoxie est caractérisée par une perfusion sanguine insuffisante d&#39;un tissu ou un manque d&#39;oxygène systémique. Cette condition est pensé pour causer / exacerbent bien documenté troubles néonatals, y compris des troubles neurologiques 1-3. Baisse de la production d&#39;adénosine triphosphate est due à un manque de phosphorylation oxydative. Pour compenser cet état ​​molécules énergétiques privés contenant de fortes liaisons phosphate de l&#39;énergie sont deux dégradées. Cela conduit à des niveaux accrus de l&#39;adénosine qui est ensuite dégradé en inosine, hypoxanthine, la xanthine, et enfin de l&#39;acide urique. Les deux dernières étapes dans ce processus de dégradation sont effectuées par la xanthine oxydoréductase. Cette enzyme existe sous la forme de la xanthine déshydrogénase dans des conditions normoxique mais il est converti en xanthine oxydase (XO) sous hypoxie-reperfusion circonstances 4, 5. Contrairement déshydrogénase xanthine, XO génère du peroxyde d&#39;hydrogène comme sous-produit de dégradation de la purine 4, 6. Ce peroxyde d&#39;hydrogène en combinaison avec d&#39;autres espèces d&#39;oxygène réactif (ROS) produites pendant l&#39;hypoxie, l&#39;acide urique s&#39;oxyde pour former de l&#39;allantoïne et réagit avec des membranes lipidiques pour générer malondialdéhyde (MDA) 7-9. La plupart des mammifères, les humains exemptés, possèdent les uricase, qui convertit l&#39;acide urique en allantoïne. Chez l&#39;homme, cependant, l&#39;allantoïne ne peut être formé par les ROS-oxydation médiée de l&#39;acide urique. Pour cette raison, l&#39;allantoïne est considéré comme un marqueur du stress oxydatif chez les humains, mais pas chez les mammifères qui ont uricase. Nous décrivons des méthodes employant la chromatographie liquide à haute pression (HPLC) et chromatographie en phase gazeuse spectrométrie de masse (GCMS) pour mesurer les marqueurs biochimiques d&#39;ischémie hypoxie néonatale. Le sang humain est utilisé pour la plupart des tests. Le sang des animaux peuvent également être utilisés, tout en reconnaissant le potentiel d&#39;uricase généré allantoïne. Métabolites de purine ont été liés à l&#39;hypoxie dès 1963 et la fiabilité de hypoxanthine, la xanthine, et l&#39;acide urique comme des indicateurs biochimiques de l&#39;hypoxie néonatale a été validé par plusieurs enquêteurs 10-13. La méthode HPLC utilisée pour la quantification de composés purine est rapide, fiable et reproductible. La méthode GC / MS utilisé pour la quantification de l&#39;allantoïne, un marqueur relativement nouveau du stress oxydatif, a été adapté de Gruber et al 7. Cette méthode évite certains artefacts et nécessite de faibles volumes d&#39;échantillon. Les méthodes utilisées pour la synthèse de MMDA ont été décrits par ailleurs 14, 15. GC / MS quantification basée sur MDA a été adapté à partir Paroni et al. et Cighetti et al. 16, 17. Xanthine oxydase a été mesurée par HPLC en quantifiant la conversion de ptérine d&#39;isoxanthopterin 18. Cette approche s&#39;est avérée être suffisamment sensible et reproductible.

Une méthode est décrite pour mesurer les marqueurs biochimiques du hypoxie-ischémie néonatale. L&#39;approche utilise la chromatographie liquide à haute pression (HPLC) et chromatographie en phase gazeuse spectrométrie de masse (GC / MS).

Mesure biochimique de l&#39;hypoxie néonatale

L'hypoxie-ischémie néonatale se caractérise par une perfusion sanguine inadéquate d'un tissu ou par un manque systémique d'oxygène. On pense que cet état...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer des marqueurs biochimiques d'ischémie hypoxique néonatale. Cela est réalisé en prélevant d'abord des échantillons sanguins chez des nourrissons afin d'isoler le plasma. Ensuite, une partie du plasma est filtrée, combinée à un étalon interne, puis analysée pour déterminer les concentrations d'hypoxanthine, de xanthine et d'acide urique par HPLC deux.Des aliquots de plasma supplémentaires sont ensuite traitées de manière différentielle et analysées séparément. Pour la concentration en allantoïne et les taux de MDA sur le GCMS, la dernière étape de la procédure consiste à combiner une partie du plasma avec un substrat afin d'initier la réaction enzymatique après avoir arrêté la réaction. L'activité de la xanthine oxydase peut être déterminée sur une HPLC équipée d'un détecteur fluorescent.En fin de compte, des résultats sont obtenus qui montrent des chromatogrammes des surfaces des pics, pouvant être convertis en concentrations molaires des marqueurs biochimiques souhaités ou de l'activité enzymatique à l'aide de courbes standards. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie et au diagnostic de l'hypoxie-ischémie néonatale, car cette méthode combine des mesures de marqueurs de privation énergétique, de stress oxydatif, de dommages oxydatifs et d'activité enzymatique afin de produire une image biochimique globale de la présence, voire du degré, d'hypoxie-ischémie. Avant le début de cette procédure, un échantillon de sang humain est prélevé chez un nouveau-né immédiatement après la naissance dans un tube EDTA de six millilitres en moins de cinq minutes.Après le prélèvement, centrifuger l'échantillon à quatre degrés Celsius et à 1 500 ×g pendant 10 minutes. Transférer le plasma, présent dans le surnageant, dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et centrifuger pendant 30 minutes. Éliminer le surnageant en prenant soin de ne pas contaminer les échantillons avec des globules rouges.Transférez les échantillons dans des tubes microcentrifuges séparés pour l'analyse de la purine lanine, du MDA et de la xanthine oxydase pour chaque mesure PLC des purines. Transférez 200 microlitres du plasma vers un dispositif de filtration centrifuge. Effectuez une centrifugation du plasma à quatre degrés Celsius et à 14 000 ×g pendant 1,5 heure.Éliminez le filtrat et transférez-le dans un tube de microcentrifugeuse contenant deux aino purine. Veillez à noter le volume de filtrat ajouté au tube de microcentrifugeuse contenant deux AP afin de déterminer avec précision la concentration. Vortexez le tube pendant 10 à 20 secondes.Analyser les échantillons par HPLC comme décrit dans le protocole écrit, en effectuant trois injections de 50 microlitres pour chaque échantillon à partir des chromatogrammes obtenus. Déterminer la concentration de purines dans l'échantillon. Quantifier l'hypoxanthine, la xanthine et l'acide urique en mesurant les aires des pics aux temps de rétention et longueurs d'onde correspondants.Ensuite, quantifiez la surface du pic de deux AP. À partir de ces données, les rapports des surfaces de l'hyperxanthine et de l'acide urique par rapport à deux AP peuvent être calculés. Puis, convertissez ces rapports en concentrations micromolaires à l'aide de courbes standards. Pour effectuer la mesure de la lanine, ajoutez 50 microlitres de l'étalon interne et 100 microlitres d'acétonitrile à 50 microlitres de plasma.Après avoir vortexé une à deux fois le mélange pendant 10 à 20 secondes, centrifuger pendant 10 minutes. Après la centrifugation, retirer le surnageant et le placer dans un flacon GCM S.Séchez le liquide sous un flux d'azote. Une fois le liquide sec, ajoutez 25 microlitres d'agents de silylation M-T-B-S-T-F-A et 25 microlitres de pyridine. Bouchonnez le tube et incubez-le à 50 degrés Celsius pendant deux heures.Transférez ensuite l'échantillon dans un autre flacon pour GCMS équipé d'un insert de 300 microlitres. Analysez les échantillons en GCMS à l'aide d'un échantillonneur automatique. Effectuez la séparation des composés en utilisant de l'hélium comme gaz vecteur à un débit de 1,5 millilitre par minute.Pour commencer l'analyse GCMS, saisissez les paramètres de l'analyse. Réglez la température initiale de la colonne à 100 degrés Celsius et maintenez cette température pendant deux minutes avant de l'augmenter jusqu'à 180 degrés Celsius à une vitesse de 10 degrés Celsius par minute. Maintenez la température pendant quatre minutes, puis augmentez-la jusqu'à 260 degrés Celsius à une vitesse de 20 degrés Celsius par minute.Conserver cette température jusqu'à la fin de l'analyse. Utiliser le système d'échantillonnage automatique pour injecter un microlitre du produit DÉRIVATISÉ en mode fractionnement et effectuer l'analyse entre chaque injection d'échantillon. Faire nettoyer la colonne par le système d'échantillonnage automatique à l’aide de deux injections d’un mélange de M-T-B-S-T-F-A et de pyridine en proportion égale.Pour quantifier un LAN toin, sélectionnez le mode de surveillance des ions et surveillez l'ion du rapport de charge 3 98 pour l'atlanto in et le rapport de charge 400 pour l'atlanto in lourd. Ensuite, convertissez les rapports d'abondance ionique de l'atlanto in à l'atlanto in lourd en concentrations micromolaires de l'atlanto in à l'aide d'une courbe étalon préparée avant la mesure de l'MDA, préparez le butylé hydroxytoluène et des solutions de phénylhydrazine 50 millimolaires comme décrit dans le protocole écrit. AJOUTEZ M-M-D-A-B-H-T et du citrate de sodium à l'échantillon de plasma de 100 microlitres.Diluez le mélange final à 480 microlitres en ajoutant de l'eau distillée désionisée. Dérivez la solution en ajoutant 20 microlitres d'hydrazine phénolique à 50 millimolaire. Après avoir fermé le flacon, incubez la solution sur un agitateur orbital.Après l'incubation, ajoutez un millilitre d'hexane, vortexez le mélange pendant une minute et centrifugez à 3000 tours par minute pendant 10 minutes. Après la centrifugation, transférez la phase organique dans un tube de microcentrifugeuse. Ensuite, concentrez la solution à 100 microlitres par évaporation sous un courant d'azote et transférez-la dans un flacon A-G-C-M-S muni d'un insert de 300 microlitres.Ensuite, analysez les échantillons sur A-G-C-M-S à l'aide du système d'échantillonnage automatique, en effectuant la séparation des composés et la quantification de la MDA comme décrit dans la procédure écrite. Commencez la détection de l'activité de la santhe oxydase en préparant deux vials pour les échantillons de plasma : un destiné à être incubé avec le substrat pendant zéro minute servant de témoin, et un autre à incuber pendant quatre heures.Comme expérience, ajouter du tampon et du substrat à chaque tube. Pré-incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Initier la réaction enzymatique en ajoutant 60 microlitres de plasma à chaque tube.Ajouter immédiatement 300 microlitres d'acide perchlorique à 4 % au tube d'incubation zéro. Inversement, laisser l'autre mélange s'incuber pendant quatre heures à 37 degrés Celsius avant d'arrêter la réaction par l'ajout d'acide perchlorique. Vortexer le tube témoin d'incubation zéro, puis procéder à la centrifugation.Retirer 500 microlitres du surnageant et l'ajouter à un tube contenant 20 microlitres de carbonate de potassium à cinq molaire afin de neutraliser la réaction. Vortexer l'échantillon neutralisé puis centrifuger une deuxième fois. Ensuite, ajouter 350 microlitres de la solution neutralisée à un tube de microcentrifugeuse contenant deux ap. Après une incubation de quatre heures, arrêter la réaction en ajoutant 300 microlitres d'acide perchlorique à 4 %.Poursuivre le traitement de l'échantillon comme effectué pour l'échantillon témoin. Analyser les échantillons sur une HPLC équipée d'un détecteur de fluorescence à balayage. Saisir les paramètres en utilisant ses conditions isocratiques à un débit d'un millilitre par minute.Pour obtenir une séparation et une identification adéquates des pics, régler la longueur d'onde d'excitation du détecteur de fluorescence à 340 nanomètres et la longueur d'onde d'émission à 410 nanomètres pendant trois minutes. Trois injections de 50 microlitres sont effectuées sur la CPG pour chaque échantillon après l'analyse par CPG. Déterminer le rapport entre l'ISO térine et l'AP deux en mesurant les aires des pics sur le spectre du détecteur de fluorescence.Le premier pic du spectre à environ cinq minutes correspond à deux ap. Le deuxième pic, qui est le plus grand, sera terran. Le pic d'ISO antho terin élué en dernier ; obtenez la différence entre les rapports des aires des pics ISO ANTOIN et deux AP aux points temporels de zéro et de quatre heures d'incubation.Utilisez cette valeur pour calculer l'activité de la xanthine oxydase à partir des courbes standards. Un exemple de la quantification par HPLC des composés puriniques est présenté ; les temps de rétention spécifiques et les longueurs d'onde d'émission de l'acide urique, de l'hypoxanthine et de la xanthine permettent la quantification simultanée des composés puriniques. Lorsque le dosage est correctement réalisé, les composés présenteront une séparation adéquate et la forme des pics sera nette et unimodale.Si des bulles d'air sont présentes dans le système HPLC, les temps de rétention varieront et la pression HPLC fluctuera fortement. Si la cartouche de protection doit être changée, la pression augmentera et les pics s'élargiront, devenant unimodaux ou bimodaux, comme illustré dans cet exemple ici. Un exemple de quantification par GCMS de la lanine est présenté, car la lanine massivement dérivée et la lanine dérivée lourde sont connues.Le mode de sélection d'ions peut être utilisé pour identifier ces composés sur le spectromètre de masse. Si le dosage est effectué correctement, deux pics seront observés au même temps de rétention. L'un des pics correspond à l'Alan Toin et l'autre au toin lourd.Les résultats de la quantification du MDA sont similaires à ceux d'Alan Toin, à l'exception près que les deux pics sont observés à des temps de rétention différents. Ici, un pic de rapport de charge mère à 144 pour le MDA et un pic de rapport de charge mère à 158 pour le MMDA sont observés. Un exemple de quantification par HPLC de l'activité de la xanthine oxydase est présenté aux temps d'incubation de zéro minute et de quatre heures.Si le test est correctement réalisé, trois pics doivent être observés avec le détecteur fluorescent : un pour deux ap, un pour Terran et un pour ISO terin. Remarquez que le pic d'ISO terin est plus élevé après un temps d'incubation de quatre heures, en raison de l'activité accrue de l'enzyme santhe oxydase. Étant donné que ce test mesure la fonction enzymatique, des cycles répétés de congélation et de décongélation de l'échantillon peuvent modifier ce résultat.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mesurer précisément plusieurs marqueurs biochimiques de l'hypoxie-ischémie néonatale.

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Ici, nous proposons des méthodes simples pour induire l'hypoxie dans des cultures cellulaires et des tests simples pour évaluer l'état des cultures hypoxiques.

Induction et les essais de l&#39;hypoxie en culture cellulaire

Modèles animaux de grande taille ont de bonnes valeurs de translation dans l'examen de la physiologie et de la pharmacologie de l'asphyxie néonatale. Utilisation porcelets nouveau-nés, nous développons un protocole expérimental pour simuler l'asphyxie néonatale, qui a des avantages de l'étude des paramètres hémodynamiques systémiques et régionales, transport de l'oxygène aux voies biochimiques et pathologiques et des corrélations.

Un modèle porcin de l&#39;asphyxie néonatale

On combine dans le domaine fréquentiel des mesures de spectroscopie dans le proche infrarouge de l'oxygénation cérébrale avec l'hémoglobine diffuses mesures de spectroscopie de corrélation de l'indice de flux sanguin cérébral pour estimer un indice de métabolisme de l'oxygène. Nous avons testé l'utilité de cette mesure comme un outil de dépistage de chevet pour évaluer la santé et le développement du cerveau du nouveau-né.

Non-invasive de mesure optique du métabolisme cérébral et hémodynamique chez les nourrissons

L’encéphalopathie hypoxique-ischémique suite à une asphyxie périnatale peut être étudiée à l’aide de modèles animaux. Nous démontrons les procédures nécessaires à l’établissement d’un modèle porcelet d’encéphalopathie hypoxique-ischémique néonatale.

Un modèle de Porcinet néonatale encéphalopathie hypoxique-ischémique

Cet article décrit la méthodologie de l'administration de courtes périodes de hypoxie intermittente à jour 1-8 rat ou de souris chiots postnatales. Cette approche suscite effectivement un niveau de tissu robuste »d'amorçage effet" sur les cellules progénitrices neurales cultivées qui sont récoltées dans les 30 min d'exposition à l'hypoxie.

Livraison de<em&gt; In Vivo</em&gt; Aiguë intermittente hypoxie néonatale dans Rongeurs au Premier-ventriculaire Zone dérivés de cultures de cellules progénitrices neurales

Le modèle chroniquement instrumentés de fœtus de mouton non anesthésié est utilisée pour étudier le développement du fœtus humain dans la santé et la maladie, car elle permet le placement chirurgical et l'entretien des cathéters et des électrodes, prises de sang répétitif, l'injection d'une substance, un enregistrement de l'activité bioélectrique et l'imagerie in vivo. Nous décrivons les procédures nécessaires pour établir ce modèle.

Instrumentation de Near terme fœtus de mouton pour multivariées chroniques enregistrements non anesthésiés

L’imagerie microcirculatoire (IM) est utilisée pour surveiller la perfusion périphérique chez les nouveau-nés gravement malades ou prématurés. Ce manuscrit et cette vidéo démontrent l’approche optimale pour obtenir des images de haute qualité.

Transcutanée Microcirculatory Imagerie en nouveau-nés prématurés

Ce protocole est conçu pour aider les cliniciens à mesurer l’oxygénation régionale des tissus à différents sites du corps chez les nourrissons et les enfants. Il peut être utilisé dans les situations où l’oxygénation des tissus est potentiellement compromise, en particulier pendant le pontage cardiopulmonaire, lors de l’utilisation de dispositifs d’assistance cardiaque non pulsatile, et dans les nouveau-nés gravement malades, les nourrissons et les enfants.

Comment administrer la spectroscopie proche infrarouge chez les nouveau-nés, les nourrissons et les enfants gravement malades

Nous présentons un protocole pour mesurer la saturation régionale en oxygène (rSO2) chez les patients hémodialysés (MH) à l’aide d’un moniteur de spectroscopie proche infrarouge. La valeur rSO2 est un indice d’oxygénation des tissus. Cette surveillance non invasive et en temps réel pourrait être utile pour confirmer les changements dans l’oxygénation des organes pendant la MH.

Mesure de l’oxygénation des tissus par spectroscopie proche infrarouge chez des patients sous hémodialyse

Ici, nous présentons un protocole pour induire l’hypoxie chez les souris néonatales en les délivrant dans des environnements contrôlés avec des concentrations d’oxygène variables. Des modèles murins soumis à des variations d’oxygène à la naissance ont durablement fait varier l’expression des miARN impliqués dans l’induction de changements phénotypiques comportementaux tels que l’autisme.

L’hypoxie modifie les niveaux de miARN impliqués dans l’hérédité non mendélienne du trouble du spectre autistique chez la souris

Découvrez la mesure des marqueurs biochimiques de l'hypoxie néonatale par HPLC et GC/MS. Cette méthode permet d'analyser les métabolites plasmatiques pour le diagnostic et la gestion clinique des nouveau-nés.

Mesure biochimique de l'hypoxie néonatale

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