Name: Mesure biochimique de lhypoxie néonatale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Découvrez la mesure des marqueurs biochimiques de l'hypoxie néonatale par HPLC et GC/MS. Cette méthode permet d'analyser les métabolites plasmatiques pour le diagnostic et la gestion clinique des nouveau-nés.

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<li>Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+human+plasma+xanthine+oxidase+activity+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Appl%22%5BJournal%5D)">Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography.</a> J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).</li>
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<li>Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+15N+isotopic+enrichment+and+concentrations+of+allantoin+and+uric+acid+in+urine+by+gas+chromatography%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry.</a> J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les méthodes décrites ici permettent l&#39;évaluation de l&#39;ischémie hypoxie néonatale. Ce protocole combine les mesures de marqueurs de l&#39;énergie (ATP) la privation, le stress oxydatif, dommage oxydatif, et l&#39;activité enzymatique de gagner une image globale biochimique de la présence ou même le degré d&#39;ischémie hypoxique. Malgré l&#39;utilité de cette méthode, il ya des limites potentielles. Premièrement, il faut environ 1-2 ml de sang pour recueillir suffisamment de plasma pour exécuter tous les tests. ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> 6ml K3E tubes EDTA K3 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 2204061 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse 5702R </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05413319 </td><td> Avec 13 et adaptateur 16MM </td></tr><tr><td> Microtube 1.5ml </td><td> Etats-Unis scientifique </td><td> 1615-5599 </td><td></td></tr><tr><td> 2-aminopurine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3509 </td><td></td></tr><tr><td> Varian Cary 100 spectrophotomètre </td><td> Technologies Agilant </td><td> 0010071500 </td><td></td></tr><tr><td> Savant SpeedVac </td><td> Thermo Scientific </td><td> SC210A-115 </td><td></td></tr><tr><td> Micron dispositif centrifuge de filtre </td><td> Fisher Scientific </td><td> UFC501596 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC-18-S Colonne </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 58931 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC-18-S Supelguard cartouche et titulaire </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 59629 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC </td><td> Eaux </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vial SMGC </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03376607 </td><td></td></tr><tr><td> DL-Allantoïne-5 -13 ° C; 1 -15 N </td><td> CDN isotopes </td><td> M-2307 </td><td> Lot # L340P9 </td></tr><tr><td> MTBSTFA </td><td> Thermo Scientific </td><td> 48920 </td><td></td></tr><tr><td> Pyridine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270970 </td><td></td></tr><tr><td> 5973E CPG / MSD </td><td> Agilent Technologies </td><td> G7021A </td><td> Partie # pour 5975E GC / MS </td></tr><tr><td> 3-Ethoxymethacrolein </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 232548 </td><td></td></tr><tr><td> Hydroxyde de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Dichlorométhane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270997 </td><td></td></tr><tr><td> Le benzène </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401765 </td><td></td></tr><tr><td> Diisopropyléther </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 38270 </td><td></td></tr><tr><td> BHT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1378 </td><td></td></tr><tr><td> Éthanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459844 </td><td></td></tr><tr><td> Phénylhydrazine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P26252 </td><td></td></tr></tbody></table>

mesure biochimique de l&#39;hypoxie néonatale

Biochemical Measurement of Neonatal Hypoxia

L&#39;ischémie néonatale hypoxie est caractérisée par une perfusion sanguine insuffisante d&#39;un tissu ou un manque d&#39;oxygène systémique. Cette condition est pensé pour causer / exacerbent bien documenté troubles néonatals, y compris des troubles neurologiques 1-3. Baisse de la production d&#39;adénosine triphosphate est due à un manque de phosphorylation oxydative. Pour compenser cet état ​​molécules énergétiques privés contenant de fortes liaisons phosphate de l&#39;énergie sont deux dégradées. Cela conduit à des niveaux accrus de l&#39;adénosine qui est ensuite dégradé en inosine, hypoxanthine, la xanthine, et enfin de l&#39;acide urique. Les deux dernières étapes dans ce processus de dégradation sont effectuées par la xanthine oxydoréductase. Cette enzyme existe sous la forme de la xanthine déshydrogénase dans des conditions normoxique mais il est converti en xanthine oxydase (XO) sous hypoxie-reperfusion circonstances 4, 5. Contrairement déshydrogénase xanthine, XO génère du peroxyde d&#39;hydrogène comme sous-produit de dégradation de la purine 4, 6. Ce peroxyde d&#39;hydrogène en combinaison avec d&#39;autres espèces d&#39;oxygène réactif (ROS) produites pendant l&#39;hypoxie, l&#39;acide urique s&#39;oxyde pour former de l&#39;allantoïne et réagit avec des membranes lipidiques pour générer malondialdéhyde (MDA) 7-9. La plupart des mammifères, les humains exemptés, possèdent les uricase, qui convertit l&#39;acide urique en allantoïne. Chez l&#39;homme, cependant, l&#39;allantoïne ne peut être formé par les ROS-oxydation médiée de l&#39;acide urique. Pour cette raison, l&#39;allantoïne est considéré comme un marqueur du stress oxydatif chez les humains, mais pas chez les mammifères qui ont uricase. Nous décrivons des méthodes employant la chromatographie liquide à haute pression (HPLC) et chromatographie en phase gazeuse spectrométrie de masse (GCMS) pour mesurer les marqueurs biochimiques d&#39;ischémie hypoxie néonatale. Le sang humain est utilisé pour la plupart des tests. Le sang des animaux peuvent également être utilisés, tout en reconnaissant le potentiel d&#39;uricase généré allantoïne. Métabolites de purine ont été liés à l&#39;hypoxie dès 1963 et la fiabilité de hypoxanthine, la xanthine, et l&#39;acide urique comme des indicateurs biochimiques de l&#39;hypoxie néonatale a été validé par plusieurs enquêteurs 10-13. La méthode HPLC utilisée pour la quantification de composés purine est rapide, fiable et reproductible. La méthode GC / MS utilisé pour la quantification de l&#39;allantoïne, un marqueur relativement nouveau du stress oxydatif, a été adapté de Gruber et al 7. Cette méthode évite certains artefacts et nécessite de faibles volumes d&#39;échantillon. Les méthodes utilisées pour la synthèse de MMDA ont été décrits par ailleurs 14, 15. GC / MS quantification basée sur MDA a été adapté à partir Paroni et al. et Cighetti et al. 16, 17. Xanthine oxydase a été mesurée par HPLC en quantifiant la conversion de ptérine d&#39;isoxanthopterin 18. Cette approche s&#39;est avérée être suffisamment sensible et reproductible.

Une méthode est décrite pour mesurer les marqueurs biochimiques du hypoxie-ischémie néonatale. L&#39;approche utilise la chromatographie liquide à haute pression (HPLC) et chromatographie en phase gazeuse spectrométrie de masse (GC / MS).

Mesure biochimique de l&#39;hypoxie néonatale

L'hypoxie-ischémie néonatale se caractérise par une perfusion sanguine inadéquate d'un tissu ou par un manque systémique d'oxygène. On pense que cet état...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer des marqueurs biochimiques d'ischémie hypoxique néonatale. Cela est réalisé en prélevant d'abord des échantillons sanguins chez des nourrissons afin d'isoler le plasma. Ensuite, une partie du plasma est filtrée, combinée à un étalon interne, puis analysée pour déterminer les concentrations d'hypoxanthine, de xanthine et d'acide urique par HPLC deux.Des aliquots de plasma supplémentaires sont ensuite traitées de manière différentielle et analysées séparément. Pour la concentration en allantoïne et les taux de MDA sur le GCMS, la dernière étape de la procédure consiste à combiner une partie du plasma avec un substrat afin d'initier la réaction enzymatique après avoir arrêté la réaction. L'activité de la xanthine oxydase peut être déterminée sur une HPLC équipée d'un détecteur fluorescent.En fin de compte, des résultats sont obtenus qui montrent des chromatogrammes des surfaces des pics, pouvant être convertis en concentrations molaires des marqueurs biochimiques souhaités ou de l'activité enzymatique à l'aide de courbes standards. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie et au diagnostic de l'hypoxie-isché

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