Name: Lisolement des îlots humains à partir des patients partiellement pancréatectomisés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Découvrez l'isolation d'îlots pancréatiques humains à partir de patients pancréatectomisés partiels. Cette méthode par digestion enzymatique et gradient de densité fournit des îlots viables pour l'étude du diabète de type 2.

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Nous tenons à remercier nos nombreux collègues qui ont fourni une aide, des conseils et des intrants essentiels à différents stades du projet. La production de cet article vidéo a été soutenue par des fonds provenant du ministère allemand de l&#39;Education et la Recherche (BMBF) pour le Centre allemand de recherche sur le diabète (DZD, <a href="http://www.dzd-ev.de">http://www.dzd-ev.de</a> ), IMIDIA ( <a href="http://www.imidia.org">http://www . imidia.org</a> ) et l&#39;Hôpital universitaire Carl Gustav Carus à l&#39;Université de Technologie de Dresde. La recherche menant à ces résultats a reçu un financement du Programme de la Communauté européenne septième programme-cadre (FP7/2007-2013) pour l&#39;Initiative Médicaments Innovants sous convention de subvention n ° 115005.

1. Collecte de tissus pancréatiques dans la salle d'opération <ol><li> Le chirurgien effectue une résection partielle du pancréas. </li><li> Après avoir placé le spécimen du pancréas dans une boîte sur la glace, le livrer immédiatement à l'anatomopathologiste. </li></ol> 2. Sélection de tissus pour l'isolement des îlots <ol><li> Le pathologiste sélectionne tissu qui semble douce et saine, tout en conservant les tissus endommagés à des fins diagnostiques. Tissu fibreux et les spécimens offrant moins de 2 g de tissu utilisable sont exclus de l'isolement des îlots. </li><li> Immerger le tissu pancréatique en Euro Collins Solution et livrer sur la glace au laboratoire. </li></ol> 3. L'isolement des îlots humains <ol><li> Peser le tissu pancréatique, puis le placer dans un plat de 10 cm. </li><li> Mettez 150 ml de RPMI médias dans un flacon de 500 ml. </li><li> Dans un flacon de 250 ml, préparer la solution d'enzymes digestives en combinant 130 ml de RPMI médias avec 100 mg / ml et 20 ml de DNase de RI Libérase 5mg/ml. Draw 10 ml de cette solution dans une seringue pour injecter le tissu pancréatique. </li><li> Injecter la solution d'enzymes digestives dans les tissus du pancréas, visant à la dilater de façon homogène. Si cela est empêché par la fibrose, la digestion sera probablement échouer. Ensuite, émincer les tissus dans ~ 4 mm 3 pièces sur la glace. </li></ol> 4. Homme circuit de la digestion du pancréas <ol><li> Assemblez le circuit de digestion comme le montre la figure 1. La direction du flux dans la chambre de Ricordi est dans le bas et dehors au dessus de la chambre. </li><li> Ajouter la solution d'enzymes digestifs restant dans le ballon de 500 ml pour un volume total de 300 ml et insérer un thermomètre. </li><li> Transfert du tissu pancréatique dans la chambre, insérer le treillis (diamètre des pores: 600 um) et trois billes nitrure de silicium (diamètre: 15 mm), à proximité de la chambre et démarrer la pompe avec le flux fixé à 140 ml / min. </li><li> Lorsque la température du circuit atteint 37 ° C, commencer à chronométrer et périodiquement prélever des échantillons afin de déterminer quand arrêter la digestion. Coloration à la dithizone (2 mg / ml) permet la visualisation microscopique des îlots au sein du tissu digéré 4. </li><li> Une fois les îlots sont séparés du tissu acineux environnantes, arrêter rapidement la digestion en plaçant la bobine de chauffage sur la glace et ajouter 200 ml de milieu lavage à froid (900 ml de RPMI 1640 avec 5,5 mM de glucose et 10% de FBS) pour le circuit. </li><li> Recueillir la solution îlot dans 250 ml tubes coniques comme elle sort du tube échantillon. Continuez jusqu'à ce que le circuit est vide. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2962/2962fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Le circuit de pancréas humain la digestion Le circuit pancréas humain de digestion comprend une chambre de Ricordi contenant mailles (diamètre des pores: 600 um) et trois billes de nitrure de silicium (diamètre: 15 mm). Les sorties de la chambre est entraîné dans la fiole de collecte des tissus par la pompe péristaltique (140 ml / min). Les flèches indiquent la direction du flux. Une température optimale pour la digestion enzymatique est maintenue en immergeant le serpentin de chauffage dans un bain d'eau à 37 ° C. 5. Lavage après la digestion <ol><li> Centrifuger les tubes coniques de 250 ml contenant la solution îlot à 1000 rpm, 4 ° C pendant 5 min. </li><li> Jeter le surnageant, resuspendre le culot îlot au milieu de lavage (900 ml de RPMI 1640 avec 5,5 mM de glucose et 10% de FBS) et le distribuer dans des fractions égales à tubes de 50 ml conique. (Facultatif:. Répartir dans des tubes coniques supplémentaires pour améliorer le lavage) Centrifuger à 1000 rpm, 4 ° C pendant 5 min. </li><li> Rejeter le surnageant et les boulettes de détacher doucement en secouant manuel. </li></ol> 6. La purification sur gradient de Ficoll <ol><li> Reprendre le culot avec Ficoll médias à une densité de 1,125 g / ml, pH 7,4 et lentement superposition aliquotes de 10 ml de Ficoll des médias avec des densités de 1,080, 1,060 et 1,037 g / ml. </li><li> Centrifuger les gradients de Ficoll à 2400 rpm, 4 ° C pendant 20 min. </li></ol> 7. Collection Islet et de la Culture <ol><li> Après centrifugation, les composants des tissus différents peuvent être distingués par leur cloisonnement dans le dégradé. </li><li> Jeter la couche supérieure constituée de tissus adipeux et conjonctifs. </li><li> Soigneusement la récolte de la première couche de granulats à l'îlot de 1,037 à 1,060 g / ml d'interphase. Cette couche contient les îlots les plus purs isolés. Recueillir les fractions séparément pour l'isolement efficace. </li><li> Recueillir le second, la fraction moins pur des agrégats à l'îlot de 1,060 à 1,080 g / ml d'interphase. </li><li> Diluer le gradient de Ficoll en ajoutant des médias de lavage (900 ml de RPMI 1640 avec 5,5 mM de glucose et 10% de FBS) à chaque tube conique jusqu'à un volume total de 50 ml. Centrifuger à 1000 rpm, 4 ° C pendant 5 min. </li><li> Jeter le surnageant par aspiration. Faites attention que le culot soit lâche due au gradient de Ficoll. </li><li> Lavez le wi granulése laver les médias (900ml RPMI 1640 avec 5,5 mM de glucose et 10% de FBS) et centrifuger à 1000 rpm, 4 ° C pendant 5 min. Répétez l'aide de milieux de culture des îlots </li><li> Resuspendre les îlots de milieux de culture et de les placer dans l'incubateur avec 5% de CO 2 à 37 ° C pendant 24-48 heures avant traitement ultérieur. </li></ol>

<ol><li>Kahn, S. E., Zraika, S., Utzschneider, K. M., Hull, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+cell+lesion+in+type+2+diabetes%3A+there+has+to+be+a+primary+functional+abnormality%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The beta cell lesion in type 2 diabetes: there has to be a primary functional abnormality.</a> Diabetologia. 52, 1003-1012 (2009).</li>
<li>Deng, S., Vatamaniuk, M., Huang, X., Doliba, N., Lian, M. M., Frank, A., Velidedeoglu, E., Desai, N. M., Koeberlein, B., Wolf, B., Barker, C. F., Naji, A., Matschinsky, F. M., Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+abnormalities+in+the+islets+isolated+from+type+2+diabetic+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Structural and functional abnormalities in the islets isolated from type 2 diabetic subjects.</a> Diabetes. 53, 624-632 (2004).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+method+for+isolation+of+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated method for isolation of human pancreatic islets.</a> Diabetes. 37, 413-420 (1988).</li>
<li>Latif, Z. A., Noel, J., Alejandro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+staining+fresh+and+cultured+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A simple method of staining fresh and cultured islets.</a> Transplantation. 45, 827-830 (1988).</li>
<li>Ehehalt, F., Knoch, K., Erdmann, K., Krautz, C., Jäger, M., Steffen, A., Wegbrod, C., Meisterfeld, R., Kersting, S., Bergert, H., Kuhlisch, E., Bornstein, S., Bonifacio, E., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+turnover+in+islets+from+type+2+diabetic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin turnover in islets from type 2 diabetic patients.</a> Islets. 2, 30-36 (2010).</li>
<li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pancreatic+diabetes+%28type+3c+diabetes%29+underdiagnosed+and+misdiagnosed%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed?</a> Diabetes Care. 31, Suppl 2. S165-S169 (2008).</li>
<li>Meisterfeld, R., Ehehalt, F., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+disorders+and+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Endocrinol+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic disorders and diabetes mellitus.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. 116, Suppl 1. S7-S12 (2008).</li>
<li>Verge, C. F., Gianani, R., Kawasaki, E., Yu, L., Pietropaolo, M., Jackson, R. A., Chase, H. P., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+type+I+diabetes+in+first-degree+relatives+using+a+combination+of+insulin%2C+GAD%2C+and+ICA512bdc%2FIA-2+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Prediction of type I diabetes in first-degree relatives using a combination of insulin, GAD, and ICA512bdc/IA-2 autoantibodies.</a> Diabetes. 45, 926-933 (1996).</li>
<li>Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition%2C+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+and+its+complications.+Part+1%3A+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+provisional+report+of+a+WHO+consultation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet+Med%22%5BJournal%5D)">Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation.</a> Diabet Med. 15, 539-553 (1998).</li>
<li>Marselli, L., Thorne, J., Ahn, Y. B., Omer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+of+Purified+%7Bbeta%7D-Cell+Tissue+Obtained+from+Human+Pancreas+with+Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection.</a> Journal of Clin. Endocrinol. Metab. 93, 1046-1053 (2008).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

En utilisant notre protocole, îlots humains peut être isolé du tissu pancréatique recueilli à partir d&#39;un pancréatectomie partielle. Le succès de ce protocole repose sur le soin apporté à quelques points essentiels. Pour préserver la viabilité des cellules bêta, il est essentiel que l&#39;échantillon soit transporté rapidement sur la glace au laboratoire. En outre, la durée de la digestion des tissus doivent être optimisés de façon empirique en fonction de la teneur de la fibrose des tissus et l&#39;activité enzymatique de la presse. Cela est également vrai pour le degré de force mécanique appliquée manuellement à la chambre de Ricordi. Ainsi pour obtenir un rendement îlot bonne, le protocole est mieux effectuée par un scientifique dédié ou d&#39;un assistant technique. La rupture initiale est la norme à moins que l&#39;équipe est déjà connu dans l&#39;isolement d&#39;îlots. Il ya des différences fondamentales entre notre protocole d&#39;isolement des îlots et la méthode standard isolement d&#39;îlots humains: 1) Bien que nous utilisons des tissus pancréatiques soumis à plusieurs heures d&#39;ischémie pendant l&#39;intervention chirurgicale, il est immédiatement transformé sur place. Ceci est en contraste avec pancréas explanté de mort cérébrale donateurs pour le pancréas / transplantation d&#39;îlots, qui restent ischémique pendant plusieurs heures lors de l&#39;attribution et la livraison au centre d&#39;isolement des îlots. 2) Nous injectons collagénase directement dans le tissu pancréatique, tandis que le protocole standard est pour lui insuffler dans le canal pancréatique. 3) Nous nous séparons les îlots en utilisant un gradient de Ficoll discontinu au lieu de recueillir les îlots à partir d&#39;un gradient de Ficoll continu en utilisant un processeur cellulaire COBE. Dans les cas où le prélèvement chirurgical est trop fibreux ou rares pour isoler un nombre suffisant d&#39;îlots, les tissus peuvent encore être récupérées par microdissection par capture laser (LCM) 10. Cela permet à des données d&#39;expression génique à être récupéré à partir de pratiquement tous les spécimens, même si l&#39;isolement des îlots échoue ou si le rendement est très faible. Malheureusement, LCM ne produisent pas de cellules vivantes pour des études fonctionnelles et leur montant est généralement insuffisante pour l&#39;analyse protéomique. Ainsi, en utilisant LCM en parallèle avec notre protocole digestion par la collagénase pour récupérer les îlots peut être le moyen le plus efficace pour traiter les prélèvements chirurgicaux. Lors de la collecte des tissus pour l&#39;isolement des îlots de pancréatectomies partielle, il est important d&#39;examiner attentivement l&#39;histoire clinique du patient et l&#39;état métabolique. Un patient partiellement pancréatectomisés pourrait être affectée par le type 3c diabète, le diabète secondaire à-dire le désordre du pancréas conduisant à une chirurgie 6. Parmi les 43 patients participant ayant subi cette chirurgie dans notre département en 2010, 32 étaient des non-diabétiques, 5 ont été affectés par le diabète de type 2 et 6 avaient de type 3c diabète. Ces données concordent avec les études précédentes pointant vers métabolisme du glucose et du diabète dans une fraction non négligeable de patients souffrant de cancer du pancréas ou pancréatite chronique 6. Nous avons considéré le diabète comme étant d&#39;origine primaire si elle a été diagnostiqué au moins un an avant l&#39;apparition des symptômes conduisant à 7 chirurgie pancréatique. Les niveaux d&#39;anticorps dirigés contre des autoantigènes îlot devraient également être mesurés pour évaluer une origine auto-immune potentielle du diabète 8. Parce qu&#39;un patient subissant une pancréatectomie pourrait souffrir d&#39;un diabète non diagnostiqué ou d&#39;être intolérants au glucose, tous les patients non diabétiques doivent être soumis à un test oral de tolérance au glucose avant la pancréatectomie 9.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><th> Équipement </th><th></th><th></th></tr><tr><td> 1 ml pipette sérologique (CELLSTAR) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 604181 </td></tr><tr><td> 10 ml pipette sérologique (CELLSTAR) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 607180 </td></tr><tr><td> 25 ml pipette sérologique (CELLSTAR) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 760180 </td></tr><tr><td> Seringue de 10 ml </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 300912 </td></tr><tr><td> 50 ml Seringue </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Seringue 5 ml </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 309050 </td></tr><tr><td> 18 G 1,1 / 2 aiguilles Microlance 3 </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 304622 </td></tr><tr><td> 27 GX1 / 2 aiguilles </td><td> Braun </td><td> 4658300 </td></tr><tr><td> 27 GX3 / 4 Microlance aiguille 3 </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 302200 </td></tr><tr><td> 3 cm de culture cellulaire plat grille 2x2 mm </td><td> Nunc </td><td> 174926 </td></tr><tr><td> 20 cm boîte de culture de tissus </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 6 cm Prise en main facile boîte de Pétri </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 351016 </td></tr><tr><td> 150 ml bouteille de stockage </td><td> Corning Incorporated </td><td> 431175 </td></tr><tr><td> 250 ml Erlenmeyer </td><td> Schott Duran </td><td> 21 217 36 </td></tr><tr><td> 500 ml Erlenmeyer </td><td> Schott Duran </td><td> 21 217 44 </td></tr><tr><td> 250 ml Visser le capuchon du tube conique Bas Centrifugeuse </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> Falcon de 50 ml conique du tube </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> 260 ml Easyflask non-traitées </td><td> Nunc </td><td> 156800 </td></tr><tr><td> Filtre Millex GV Unité Duropore (0,22 um) </td><td> Millipore </td><td> SLGV033RB </td></tr><tr><td> Bouteille vide Top filtre (PSE 70 mm de diamètre Membran, 0,22 um de taille des pores, la taille du cou 45 mm, 500 ml de volume) </td><td> Corning Incorporated </td><td> 431118 </td></tr><tr><td> Densitomètre (Densito 30PX) LWE37463 </td><td> Mettler Toledo </td><td> 51324450 </td></tr><tr><td> Rapide PES Unité filtre 0,2 um </td><td> Nalgene </td><td> 569-0020 </td></tr><tr><td> Batterie de chauffage </td><td> Technologies Inc BioRep </td><td> HC-02 </td></tr><tr><td> Multifuge 4 KS-R </td><td> Heraeus </td><td> 75015680 </td></tr><tr><td> Pompe Typ PD5206 </td><td> Heidolph </td><td> 523-52060-00-2 </td></tr><tr><td> Ricordi chambre (treillis métallique de 600 um de diamètre de pore) </td><td> Technologies Inc BioRep </td><td> Modèle 50-U-01, 0503-001 série </td></tr><tr><td> Préparation stand </td><td> Technologies Inc BioRep </td><td> 50-PS-01 </td></tr><tr><td> O-Rings </td><td> Technologies Inc BioRep </td><td> OU-50-U-01 </td></tr><tr><td> Marbles nitrure de silicium (15 mm de jeu 9) </td><td> Technologies Inc BioRep </td><td> SN-01 </td></tr><tr><td> Tubes Silicon </td><td> Tygon </td><td> R 3603 8,0 X4, 0 mm </td></tr><tr><td> Pinces chirurgicales </td><td> Braun </td><td> BD168R </td></tr><tr><td> Ciseaux chirurgicaux (Aesculap) </td><td> Braun </td><td> BC273R </td></tr><tr><td> Bain-marie MCO 200 </td><td> Grant </td><td> MCO 200 </td></tr><tr><th> Réactifs </th><th></th><th></th></tr><tr><td> Collagénase - RI Libérase&gt; (100 mg) </td><td> Roche </td><td> 11815032001 </td></tr><tr><td> D (+)-Glucose </td><td> Merck </td><td> 1.08337.1000 </td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde (DMSO) </td><td> Merck </td><td> 1.16743.1000 </td></tr><tr><td> Diphénylthiocarbazone (DTZ) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5130 </td></tr><tr><td> DNase I (100 mg) </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Dulbeccos 1xPBS </td><td> Laboratoires AAP </td><td> H15-002 </td></tr><tr><td> Electrolytsolution E154 </td><td> Serumwerk </td><td> 00509 </td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin (FBS) </td><td> Laboratoires AAP </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> Ficoll 400 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F9378 </td></tr><tr><td> Fœtale sérum bovin (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 10270-106 </td></tr><tr><td> 2 - (4 - (2-hydroxyéthyl) - 1-pipérazinyl)-ethansulfons ‰ Ure (HEPES) </td><td> Roth </td><td> 9105.3 </td></tr><tr><td> NaOH 5 M </td><td> pharmacie clinique, hôpital </td><td> - </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine (100x) </td><td> Laboratoires AAP </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> Pipettaid (EXPRESS) </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 357591 </td></tr><tr><td> Potassiumchlorid </td><td> Fluka </td><td> 60132 </td></tr><tr><td> Potassiumdihydrogenphospate anhydre </td><td> JT Baker </td><td> 0241 </td></tr><tr><td> Potassiummonohydrogenphosphate </td><td> JT Baker </td><td> 3246-01 </td></tr><tr><td> Milieu RPMI 1640 [-] D-glucose [+] L-Glutamine </td><td> Gibco </td><td> 11879-020 </td></tr><tr><td> Milieu RPMI 1640 [+] L-Glutamine </td><td> Laboratoires AAP </td><td> E15-840 </td></tr><tr><td> Sodiumhydrogencarbonat </td><td> Merck </td><td> 1.06329.0500 </td></tr></tbody></table> Médias et Solutions Solution de dithizone <ul><li> Dissoudre 100 mg dans 10 ml DTZ DMSO et diluées dans 40 ml de PBS </li><li> Filtre stérile la solution (0,22 um) </li></ul> Solution enzymatique <ul><li> Dissoudre 100 RI Libérase mg dans 20 ml de milieu RPMI 1640 (sans les suppléments) </li><li> Dissoudre 100 mg de DNase dans 1 ml du milieu RPMI 1640 (sans les suppléments) </li><li> Filtre stérile la solution (0,22 um) et de garder l&#39;enzyme sur la glace </li></ul> Lavez les médias (1000ml/5.5mM glucose) <ul><li> Dissoudre 100 ml de FBS (inactivé par la chaleur) </li><li> Ajouter 450 ml de RPMI 1640 (pas de glucose) </li><li> Ajouter 450 ml de RPMI 1640 (11 mM de glucose) </li><li> Filtre stérile la solution (0,22 um) </li></ul> Islet culture médiatique (500ml / 5,5 mM de glucose) <ul><li> Dissoudre 10 ml d&#39;HEPES 1M (pH 7,4) </li><li> Ajouter 50 ml de FBS </li><li> Ajouter 5 ml de pénicilline / streptomycine (100x) </li><li> Ajouter 2,75 ml 1 une solution de glucose M </li><li> Ajouter 432,25 ml de RPMI 1640 (pas de glucose) </li><li> Filtre stérile la solution (0,22 um) </li></ul> Euro Collins Solution <ul><li> 4083 hydrogénophosphate de potassium g </li><li> 70,0 g de glucose </li><li> 2237 g de chlorure de potassium </li><li> 14,80 g de potassium monohydrogénophosphate </li><li> 1680 g d&#39;hydrogénocarbonate de sodium </li><li> 40 ml de solution d&#39;électrolyte (E 154) </li><li> pH 7,4 </li><li> Ajouter de l&#39;eau distillée jusqu&#39;à 2000 ml </li><li> Filtre stérile la solution (0,22 um) </li></ul> Solution mère de Ficoll <ul><li> Ajouter 1000 ml d&#39;Euro Collins solution à 500 g de Ficoll </li><li> Ajouter 8,94 g d&#39;HEPES </li><li> Remuer jusqu&#39;à ce jour au lendemain Ficoll est résolu </li><li> pH 7,4 </li><li> Mesurer la densité </li></ul> Dégradés de Ficoll <ul><li> Calculez le montant de FBS, Euro Collins solution et la solution de Ficoll stock en fonction de la densité </li><li> Combinez les trois solutions et mesurer la densité avec un densitomètre </li><li> Ajouter Euro Collins solution ou la solution de Ficoll stock jusqu&#39;à ce que la densité est ajustée </li><li> Stérile, filtrer la solution (0,22 m) et stocker à 4 ° C </li></ul>

l&#39;isolement des îlots humains à partir des patients partiellement pancréatectomisés

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Les enquêtes sur la pathogenèse de diabète de type 2 et les îlots de Langerhans dysfonctionnement 1 ont été entravés par la disponibilité limitée des îlots de diabète de type 2 à partir de 2 donneurs d&#39;organes. Ici, nous partageons notre protocole pour isoler les îlots de tissu pancréatique humaine obtenue à partir diabétiques de type 2 et les patients non diabétiques ayant subi une pancréatectomie partielle due à des maladies pancréatiques différentes (tumeurs pancréatiques bénignes ou malignes, la pancréatite chronique, et cholédoque ou de tumeurs duodénales) . Tous les patients concernés ont donné leur consentement à cette étude, qui avait également été approuvé par le comité d&#39;éthique local. Les spécimens chirurgicaux ont été immédiatement remis à la pathologiste qui a choisi douce et saine du tissu pancréatique pour l&#39;isolement des îlots apparaissant, en conservant les tissus endommagés à des fins diagnostiques. Nous avons constaté que d&#39;isoler plus de 1.000 îlots, nous avons dû commencer avec au moins 2 g de tissu pancréatique. Également essentiel de notre protocole était d&#39;visiblement distendre les tissus lors de l&#39;injection des médias contenant des enzymes et ensuite on mâche pour faciliter la digestion en augmentant la surface. Pour étendre l&#39;applicabilité de notre protocole d&#39;inclure le cas occasionnels dans lequel une grande quantité (&gt; 15g) de tissu pancréatique humaine n&#39;est disponible, nous avons utilisé une chambre de Ricordi (50 ml) pour digérer les tissus. Pendant la digestion, nous avons manuellement secoué la chambre Ricordi 3 à une intensité qui varie selon éprouvette en fonction de son niveau de fibrose des tissus. Un gradient discontinu de Ficoll a ensuite été utilisée pour séparer les îlots du tissu acineux. Nous avons noté que le culot de tissus devraient être assez petit pour être homogène en suspension dans un milieu de Ficoll avec une densité de 1,125 g / ml. Après isolement, nous avons cultivé des îlots dans des conditions sans stress (pas de secouer ou de rotation) avec 5% de CO 2 à 37 ° C pendant au moins 48 h afin de faciliter leur récupération fonctionnelle. L&#39;application généralisée de notre protocole et de son amélioration future pourrait permettre la récolte en temps opportun de grandes quantités d&#39;îlots humains à partir diabétique et clinique correspond sujets non diabétiques, grandement progresser la recherche du diabète de type 2.

Notre protocole a produit une moyenne d&#39;environ 500 îlots par gramme de tissu pancréatique, bien que ce qui a beaucoup varié entre les préparations en raison principalement de différences dans la fibrose et l&#39;activité de la collagénase. Nous avons atteint une pureté&gt; 90% des îlots par coloration d&#39;abord avec la dithizone lors du traitement des tissus, puis triées à la main les 24 heures après l&#39;isolement. Pour déterminer la qualité des îlots purifiés, nous avons testé pour 25 mM de glucose stimulée par la sécrétion d&#39;insuline dans des conditions statiques pendant 2 heures. Nous avons trouvé la sécrétion d&#39;insuline comparable à celle obtenue à partir des îlots ECIT îlot isolement et centres de transplantation. Comme des îlots isolés de pancréas partiellement pancréatectomisés sont pas destinés à la transplantation d&#39;îlots, l&#39;évaluation de l&#39;IEQ totale n&#39;a pas été considérée comme un facteur critique. Surtout, notre méthode nous a permis d&#39;isoler les îlots pour des études fonctionnelles à partir de 25 patients pancréatectomisés partielle entre 2005 et 2008 5. Ces îlots ont été analysés pour le glucose stimulée par la sécrétion d&#39;insuline et de l&#39;expression des protéines spécifiques par Western blot et immunohistochimie. Les îlots isolés partiellement pancreatecomized pancréas peut aussi être utilisé pour comparer les gènes et les profils d&#39;expression de protéines, de l&#39;apparence ultrastructurale et réponses fonctionnelles des îlots non-diabétiques et diabétiques. Parce qu&#39;il ya plus de patients subissant une pancréatectomie partielle qu&#39;il ya de donneurs d&#39;organes, notre protocole pourrait permettre suffisamment d&#39;échantillons et de données à recueillir pour l&#39;analyse statistique robuste.

L&#39;alimentation de type 2 diabétiques îlots pour la recherche est insuffisant. Ici, nous partageons notre protocole pour isoler les îlots de patients subissant une pancréatectomie partielle. Cette approche représente un lieu unique pour obtenir des îlots de diabétiques de type 2 et cliniquement correspondance des sujets non diabétiques, en nombre suffisant pour les études fondamentales et cliniques.

L&#39;isolement des îlots humains à partir des patients partiellement pancréatectomisés

Les recherches sur la pathogenèse du diabète de type 2 et le dysfonctionnement des îlots de Langerhans 1 ont été entravées par la disponibilité limitée du type 2...

Bonjour, je suis Florian Al du Département de chirurgie de l'Université technique de Triton. Salut, je suis Gregor Cher, également du Département de chirurgie de l'Hôpital universitaire de Grayston.Des recherches sur la biologie et la fonction des paupières sont désespérément nécessaires pour faire progresser notre compréhension de la physiologie des paupières et de la pathogenèse du diabète. Malheureusement, les prélèvements de paupières humaines provenant de patients non diabétiques et de patients atteints de diabète de type deux sont très difficiles à obtenir. La séquence vidéo suivante vous montrera un protocole permettant d'isoler des paupières humaines à partir de patients présentant une optimisation pancréatique partielle.Les îlots ainsi obtenus peuvent fonctionner comme un système in vitro pour l'analyse fonctionnelle. La résection chirurgicale d'un tissu pancréatique humain constitue la condition préalable à l'isolement des îlots humains. Nous nous appuyons sur des patients subissant une résection partielle du pancréas en raison de pathologies pancréatiques spécifiques.En tant que source de tissu pancréatique humain, le chirurgien effectue une incision dans le pancréas et réalise une résection partielle. Ensuite, l'échantillon pancréatique est placé sur de la glace et transporté au service d'anatomie pathologique. Le pathologiste détermine la quantité de tissu pancréatique sain apparemment normal et de consistance molle à prélever.Pour l'isolement des îlots, au moins deux grammes de tissu pancréatique sont nécessaires pour l'isolement. Le tissu est placé dans une solution UCON et transporté sur de la glace jusqu'au laboratoire. La première étape dans le laboratoire d'isolement des îlots consiste à mesurer la masse du tissu pancréatique.L'échantillon est ensuite placé dans une boîte de 10 centimètres de diamètre. Nous avons déjà préparé un flacon de 500 millilitres contenant 150 millilitres de milieu RPMI et un flacon de 250 millilitres contenant 130 millilitres de milieu RPMI. Nous ajoutons ensuite la solution d'enzyme de digestion contenant un millilitre de DNAs et 20 millilitres de collagénase au flacon de 250 millilitres, puis nous la prélevons à l’aide d’une seringue de 10 millilitres.Le tissu pancréatique nettoyé est ensuite distendu par l'injection d'un milieu contenant des enzymes et haché en petits morceaux afin d'augmenter la surface et de faciliter le processus de digestion. Cette étape de hachage est cruciale, car la distension par injection seule ne permet pas une répartition adéquate de l'enzyme dans le tissu. Parallèlement, nous avons monté le circuit de digestion.Comme illustré sur cette figure, le sens de l'écoulement dans la chambre enregistrée est entrant par le bas et sortant par le haut de la chambre. Ensuite, nous ajoutons le milieu contenant l'enzyme restante au flacon de 500 millilitres jusqu'à un volume de 300 millilitres, puis insérons le thermomètre. La chambre enregistrée contient un treillis métallique avec un diamètre de pores de 600 micromètres et des billes en nitrure de silicium libre avec un diamètre de 15 millimètres chacune.Nous transférons le tissu pancréatique dans la chambre, insérons la maille, fermons la chambre et démarrons la pompe à une vitesse de 140 millilitres par minute. Une fois que la température du circuit atteint 37 degrés Celsius, nous commençons à mesurer le temps de digestion. La chambre enregistrée est agitée manuellement selon la composition du tissu.Pour déterminer le moment optimal pour interrompre la digestion, nous prélevons régulièrement des échantillons, effectuons une coloration à la tisone, ce qui permet d'observer au microscope les œillets séparés en rouge. Dès que les œillets semblent séparés du tissu aino, nous arrêtons rapidement la digestion en plaçant la spirale chauffante sur de la glace et en ajoutant 200 millilitres de milieu de lavage froid au circuit. Par la suite, nous recueillons la solution de paupière en transférant l'échantillon dans des tubes Falcon de 250 millilitres jusqu'à ce que le circuit soit vide.La procédure de lavage suivante commence par une étape de centrifugation à 1000 tr/min à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. À l'étape suivante, nous éliminons le surnageant, resuspendons le culot dans la solution de milieu de lavage et répartissons celle-ci en fractions égales dans des tubes coniques de 50 millilitres. Le lavage se poursuit par une autre étape de centrifugation à 1000 tr/min à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Étape facultative : nous répartissons la palette dans des tubes coniques supplémentaires au-delà des quatre tubes initiaux, en fonction de la taille de la palette. Afin d'améliorer le lavage, nous éliminons à nouveau le surnageant et desserrons délicatement la palette pour séparer la paupière du tissu aine. Les densités tissulaires différentes des deux parties permettent l'application d'un gradient fécal.Tout d'abord, nous resuspendons le culot dans un milieu fécal de densité 1,125 gramme par millilitre. Le culot doit être suffisamment petit pour permettre une resuspension homogène. Ensuite, nous recouvrons lentement celui-ci avec les milieux fécaux de densités 1,08, 1,060 et 1,037, avec un volume de 10 millilitres chacun.Ensuite, nous centrifugeons les gradients à 2 400 tr/min pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Vous pouvez maintenant distinguer les différents composants séparés selon leurs densités dans les fractions. Tout d'abord, nous éliminons la couche supérieure composée de graisse et de tissu conjonctif.La fraction que nous collectons maintenant est la première couche d'agrégat de paupière aux densités 1,037 et 1,06, qui contient principalement les ocelles isolés. Pour une isolation efficace, il est important de collecter les fractions séparément. Nous collectons ensuite la fraction du second agrégat de paupière à l'interface des densités 1,060 et 1,080, qui contient des ocelles moins purs que la première couche.Ensuite, nous ajoutons le milieu de lavage jusqu'à un volume total de 50 millilitres afin de diluer le gradient fécal et envoyons à la FUT à 1000 tr/min pendant cinq minutes. À quatre degrés Celsius, nous éliminons l'agent SUP par aspiration, car le culot pourrait être très lâche en raison de la température froide. Ainsi, nous devons répéter l'étape de lavage avec le milieu de culture pour paupière à 1000 tr/min pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Dans la dernière étape, nous resuspendons les boutonnières humaines et la culture de boutonnières, le milieu et la culture. Les boutonnières recueillies sont placées dans l'incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures. Après cette étape de culture, les paupières sont prêtes pour un traitement ultérieur.Ce protocole devrait vous permettre d'isoler des paupières humaines à partir de tissu pancréatique après une pancréatectomie partielle. Le transport rapide et à basse température du tissu pancréatique vers le laboratoire d'isolement des paupières est essentiel pour préserver une meilleure viabilité cellulaire. L'équipe d'isolement doit garder à l'esprit que le processus de digestion est une procédure hautement dynamique.La durée du processus de digestion dépend fortement de la composition du tissu. Par exemple, du degré de fibrose et de la capacité d'injecter suffisamment d'enzyme dans le tissu pancréatique. Le réglage individuel de la force mécanique à l'intérieur de la chambre enregistrée et la durée du processus de digestion sont cruciaux pour obtenir un bon rendement en îlots de Langerhans.

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Atteindre de haute qualité et la quantité appropriée d'îlots humains est l'une des conditions préalables importantes pour la transplantation d'îlots de succès. Dans cette vidéo, nous décrire étape par étape les procédures pour l'isolement des îlots pancréatiques humains (partie I: la digestion et la collecte des tissus pancréatiques) en utilisant une méthode modifiée automatisés.

Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie I: La digestion et la perception des tissus pancréatiques

Atteindre de haute qualité et la quantité appropriée d'îlots humains est l'une des conditions préalables importantes pour la transplantation d'îlots de succès. Dans cette vidéo, nous décrire étape par étape les procédures pour l'isolement des îlots pancréatiques humains (partie II: la purification et la culture d'îlots humains) en utilisant une méthode modifiée automatisés.

Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie II: Purification et culture d&#39;îlots humains

Les îlots pancréatiques, également appelés îlots de Langerhans, sont un amas de cellules endocrines qui produisent des hormones pour la régulation du glucose et d’autres fonctions biologiques importantes. Ce protocole explique une méthode pour isoler les îlots pancréatiques en perfusant d’abord la collagénase via l’ampoule de Vater pour digérer le tissu pancréatique exocrine et une centrifugation simplifiée par gradient de densité pour purifier les îlots des souris.

Isolement des îlots pancréatiques par perfusion de collagénase : une méthode enzymatique pour isoler les cellules des îlots pancréatiques

Microdissection laser est une technique qui permet la récupération des cellules sélectionnées à partir des quantités infimes de parenchyme. Nous décrivons ici un protocole pour l'acquisition des îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux être utilisés pour les études transcriptomiques. Notre protocole améliore l'autofluorescence intrinsèque des cellules bêta humaines, facilitant ainsi leur collection.

Protocole amélioré pour la microdissection laser d&#39;îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux

Nous décrivons ici un protocole pour isoler les îlots intacts de souris néonatales. Pancreata ont été partiellement digéré avec de la collagénase, suivi d'un lavage et cueillette à la main. 20 - 80 amas d'îlots peuvent être obtenus par le pancréas de souris nouveau-nés, qui sont appropriés pour de nombreuses études d'îlots.

Isolation efficace des îlots fonctionnels de néonatales Pancréas souris

Ce protocole d'isolement d'îlots a décrit une nouvelle voie d'injection de collagène pour digérer le tissu d'exocrine et une procédure simplifiée de gradient pour purifier les îlots des souris. Il s'agit de la digestion enzymatique, de la séparation/purification des gradients et de la cueillette manuelle des islets. L'isolement réussi peut donner 250-350 îlots de haute qualité et entièrement fonctionnels par souris.

Un protocole simple à haut rendement pour l'isolement des îlettes pancréatiques des souris

Ici, nous présentons un protocole pour produire des données de transcriptome de haute qualité et à grande échelle des cellules simples des îlots pancréatiques humains isolés utilisant une technologie microfluidique de séquençage d'ARN à base de gouttelettes.

Séquençage et analyse de l'ARN unicellulaire des îlots pancréatiques humains

Ici, nous fournissons des détails sur la réalisation de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS) par perfusion à travers le système vasculaire de souris avec un pancréas intact comme technique supplémentaire pour évaluer la fonction pancréatique endocrine avec réduction des facteurs de confusion possibles.

Sécrétion d’insuline stimulée par le glucose par perfusion à travers le système vasculaire de souris avec un pancréas intact

Cette étude a développé une méthode simplifiée pour extraire efficacement les îlots primaires fonctionnels et les cellules acinaires du pancréas de la souris, offrant un outil précieux pour étudier la communication intercellulaire dans la pathogenèse du diabète induit par la pancréatite aiguë.

Une méthode simple et rapide pour l’isolement simultané des îlots primaires et des cellules acinares pancréatiques primaires à partir de souris

Ce protocole décrit une méthode standardisée pour la prélèvement chirurgical, la digestion enzymatique et la purification par gradient de densité des îlots pancréatiques de rat Lewis, permettant des préparations à haut rendement et à haute pureté pour une utilisation directe dans des études de transplantation ou in vitro .

Isolement et purification des îlots pancréatiques à partir de rats de Lewis grâce à la digestion enzymatique et à la séparation par gradient de densité

Découvrez l'isolation d'îlots pancréatiques humains à partir de patients pancréatectomisés partiels. Cette méthode par digestion enzymatique et gradient de densité fournit des îlots viables pour l'étude du diabète de type 2.

L'isolement des îlots humains à partir des patients partiellement pancréatectomisés

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