Introduction à l'échographie destruction des microbulles ciblées Technique

UTMD signifie destruction ciblée par ultrasons des microbulles. L'UTMD peut être utilisé pour diriger la délivrance spécifique de molécules bioactives, notamment des gènes thérapeutiques, vers des organes cibles accessibles aux ultrasons, tels que le cœur et le foie. Dans la technique UTMD, des molécules bioactives telles que des plasmides chargés négativement ou des vecteurs d'ADN codant pour un gène d'intérêt sont ajoutées aux enveloppes cationiques d'agents de contraste à base de microbulles lipidiques ; les microbulles liées au vecteur peuvent ensuite être administrées par voie intraveineuse ou directement dans le ventricule gauche du cœur.

Dans les animaux de plus grande taille, elles peuvent également être administrées à l’aide d’un cathéter coronaire avec ou sans période de séjour. L’administration ultérieure depuis la circulation vers un organe cible se produit de manière optimale par cavitation acoustique à la fréquence de résonance des microbulles. Il semble probable que l’énergie mécanique générée par la destruction des microbulles entraîne la formation transitoire de pores dans les cellules endothéliales ou entre celles-ci au niveau de la microvasculature de la région ciblée.

En raison de cet effet de sauna parion, l'efficacité de la transfection dans et à travers les cellules endothéliales augmente, et les vecteurs codant pour le transgène peuvent être déposés dans le tissu cible environnant. L'ADN plasmatique restant dans la circulation est rapidement dégradé par les nucléases présentes dans le sang lors de la préparation des microbulles. Un aliquot d'une solution mère de microbulles préparée contenant du glucose, du chlorure de sodium tamponné au phosphate, de la phosphatidylcholine diol glycérique trois et du diol glycérique trois.

La phosphatidyléthanolamine est d'abord incubée à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes. La solution de microbulles réchauffée est ensuite transférée dans un microtube de 1,5 millilitre contenant du glycérol et entre un et deux milligrammes d'ADN plasmidique purifié codant pour un construct d'expression du gène d'intérêt. Du chlorure de sodium tamponné au phosphate est ajouté jusqu'à un volume final de 500 microlitres.

L'air contenu dans le microtube est ensuite remplacé par du gaz d'octafluoropropane. Le microtube est ensuite agité vigoureusement dans un amalgamateur dentaire pendant 20 secondes. Avant la première utilisation, l'étalonnage de l'équipement est nécessaire : le transducteur de cavitation UTMD de un mégahertz doit être calibré afin de garantir un indice mécanique et une fréquence de répétition d'impulsions appropriés.

Un transducteur submergé d'un mégahertz est relié à un générateur de forme d'onde par l'intermédiaire d'un amplificateur de puissance. Le transducteur est placé dans un récipient en plastique rempli d'eau, orienté directement vers un hydrophone, qui a été connecté à un oscilloscope via un amplificateur de charge. La fréquence, l'amplitude, le cycle de salve et l'amplification de puissance de la forme d'onde peuvent tous être modifiés afin d'obtenir le cycle de travail approprié et l'indice mécanique optimal pour faire caviter les microbulles. Dans ce dispositif, nous avons étalonné le système à un indice mécanique équivalent à environ 1,3 à un mégahertz pour la délivrance de microbulles et UTMD avant la délivrance des microbulles et U-T-M-D-C 57 BL six souris sont anesthésiées par injection intrapéritonéale de 100 milligrammes par kilogramme de kétamine et de 5 milligrammes par kilogramme de xylazine.

L'administration des microbulles s'effectue par voie intraveineuse, soit par injection directe dans le ventricule gauche du cœur, soit par cathétérisation de la veine caudale, cette dernière méthode étant décrite ultérieurement pour l'injection cardiaque directe. Un volume allant jusqu'à 100 microlitres de la solution de microbulles chargée en ADN plasmatique est injecté à l'aide d'une aiguille de calibre 30 insérée dans l'espace intercostal antérieur du quatrième espace intercostal, sous visualisation échographique, dans le ventricule gauche du cœur. Le bolus de solution de microbulles résultant de l'injection intraventriculaire gauche est visualisé à l'aide d'un transducteur ultrasonore à haute fréquence de VisualSonics, placé en position fixe sur le thorax de la souris selon une vue en long-axe.

Immédiatement après l'injection, la destruction des microbulles est effectuée pendant environ cinq minutes, à l’aide d’un second transducteur de petite taille et de basse fréquence (1,0 mégahertz), placé directement au-dessus de l’organe ciblé afin de concentrer la destruction sur cette région. Les ultrasons sont appliqués au foie avec une fréquence de répétition d’impulsions de 1,0 mégahertz, un indice mécanique équivalent à environ 1,3 à 1,5, et une période de répétition d’impulsions de 100 millisecondes tous les 20 cycles, ou bien l’impulsion peut être synchronisée sur l’ECG de la souris selon un train de trois images d’ultrasons tous les quatre à six cycles cardiaques. Pour la méthode d’administration des microbulles par voie veineuse caudale, la souris est anesthésiée de la même manière qu’avec une seringue contenant le plasmide.

Les microbulles liées à l'ADN sont connectées à un cathéter veineux de calibre 27 inséré dans la veine de la queue. Le cathéter est introduit dans le tiers distal de l'une ou l'autre des veines latérales situées le long de la queue de la souris. La seringue contenant les microbulles est placée dans une pompe d'infusion qui administrera automatiquement un volume prédéfini uniforme de solution sur une durée prédéterminée.

L'analyse de la bioluminescence de l'UTMD permet d'évaluer l'efficacité de la livraison d'ADN plasmatique médiée par l'UTMD selon diverses méthodes, en fonction des gènes codés dans le vecteur. En particulier, l'imagerie in vivo de la bioluminescence constitue une méthode permettant de surveiller la présence et la durée de l'expression génique chez des souris transfectées avec un plasmide codant un gène rapporteur de bioluminescence tel que la luciférase.

Le système d'imagerie in vivo Enogen est utilisé pour la bioluminescence. Des images sont généralement prises chez toutes les souris le premier jour suivant la transfection médiée par UTMD, et l'imagerie est répétée tous les trois à quatre jours jusqu'à ce que l'expression du gène de bioluminescence ne soit plus détectable visuellement par le système. Pour préparer les souris à l'imagerie bioluminescente, celles-ci reçoivent d'abord une injection intrapéritonéale de la sonde rapporteur luciférase Lucifer.

Les souris sont ensuite anesthésiées. Environ trois minutes plus tard, on laisse la biodistribution du substrat de luciférine se produire pendant environ 10 minutes avant de placer l'animal ou les animaux dans la chambre d'imagerie Xeno Gen et de réaliser une acquisition d'image corporelle complète. Pendant l'acquisition, les photons émis par la réaction bioluminescente de la luciférase sur la luciférine sont détectés par le système après chaque prise d'image.

À l'aide du système d'imagerie in vivo Xeno, le logiciel du système est utilisé pour mesurer et quantifier la région luminescente visible d'intérêt.