Cibler les neurones Bulbe olfactif Utiliser combiné In Vivo L'électroporation et de Gal4-Based Enhancer Piège Lignes Zebrafish

Cette méthode illustre comment la combinaison d'une électroporation in vivo discrète dans le temps et l'espace avec des lignées transgéniques de poisson zèbre permet de cibler sélectivement des régions de l'embryon en développement pour l'expression de transgènes. Commencez avec des poissons transgéniques cal TA4 obtenus par la méthode du piège à activateurs, afin de restreindre l'expression génique et les types cellulaires d'intérêt. Dans ce cas, au moment précis du développement du bulbe olfactif, injectez le plasmide rapporteur GFP à l'extrémité antérieure du prosencéphale in vivo, puis réalisez une électroporation pour faciliter la livraison de l'ADN. Les résultats obtenus par imagerie de fluorescence in vivo indiquent une localisation précise du transgène à un moment spécifique et au cours d'un processus particulier du développement.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'injection de plasmide au stade d'une seule cellule, est que l'expression est ciblée vers des types cellulaires spécifiques au sein d'une région précise du cerveau en développement. Utilisez la lignée transgénique de poisson zèbre créée par une méthode de piégeage d'enhancer médiée pour induire l'expression à la fois du facteur de transcription calt A four et de la protéine rapportrice M cherry dans des régions spécifiques du cerveau en développement. Mettez en place l'accouplement de poissons adultes hétérozygotes pour l'insert transgénique avec des poissons de type sauvage afin d'obtenir environ 50 % de descendants transgéniques.

Traitez maintenant les embryons transgéniques avec une solution de 100 micromolaire de phénilthréa, en commençant entre six et huit heures après la fécondation, afin d'inhiber la formation du pigment et de faciliter l'imagerie fluorescente. À 24 à 28 heures post-fécondation, transférez les embryons dans de l'eau d'œuf sans PTU et, sous un microscope fluorescent, identifiez les embryons transgéniques par l'expression de M-cherry dans le micro-onde. Préparez une solution à 0,5 % d'agarose à bas point de fusion dans du tampon d'électroporation additionné de trica, puis équilibrez la solution.

Dans un incubateur à 34 à 37 degrés Celsius, déposez une grande goutte, d’environ 500 microlitres de la solution agro, au centre d’une boîte de Pétri de 60 millimètres. À l’aide de pinces fines, retirez la membrane corienne des embryons transgéniques. Transférez les embryons libérés dans une boîte de Pétri contenant du tampon d’électroporation additionné de 0,02 % d’anesthésique trica pendant deux minutes.

Transférez maintenant six à huit embryons anesthésiés dans la goutte préparée d'aros à l'aide de pointes de pipette Michael modifiées. Positionnez les embryons de manière à ce qu'ils soient tous orientés dans la même direction et alignés en une rangée verticale. Immobilisez les embryons en place en solidifiant l'aros à l'aide d'une grande boîte de Pétri contenant deux à trois millimètres de glace.

Inondez la boîte avec du tampon d'électroporation contenant du trica, en veillant à ce que la solution recouvre complètement la goutte d'aros solidifiée. Préparez le plasmide d'expression de la GFP purifié avec du colorant rouge de phénol pour l'injection. Fabriquez ensuite des pipettes de microinjection en utilisant une pointe de pipette micro loader.

Ajoutez un à deux microlitres de solution plasmidique d'ADN dans la pipette d'injection, puis montez et fixez fermement la pipette chargée dans le porte-pipette du système d'injection sous pression. Reculez brusquement la pipette chargée en l'insérant rapidement à travers un essuie-tout kim imprégné jusqu'à ce que des impulsions de pression provoquent la libération par POF de la solution rouge d'ADN, la pipette étant orientée vers l'extrémité antérieure du cerveau en développement. Injectez la solution d'ADN plasmidique dans les ventricules du cerveau en développement par injection sous pression.

Forcez l'ADN à pénétrer dans la région adjacente au bulbe olfactif en formation. Injectez l'ADN jusqu'à ce que le colorant rouge soit clairement visible à l'extrémité antérieure du ventricule du prosencéphale. Passez immédiatement à l'étape d'électroporation afin d'éviter la diffusion et la dilution de l'ADN.

Régler le stimulateur SD nine pour produire des impulsions uniques d'électroporation de cinq millisecondes, à 70 volts. Placer les électrodes de sorte que l'électrode positive soit située adjacente à l'extrémité intérieure de l'embryon, tandis que l'électrode négative se trouve postérieure à la tête de l'embryon.

Initier manuellement huit impulsions d'électroporation à l'aide d'un seul interrupteur moteur du stimulateur SD nine. Espacer chaque impulsion d'une seconde. Laisser les embryons se récupérer pendant au moins 10 minutes.

À l’aide de fines pinces, tracer maintenant délicatement le contour des embryons en évitant tout contact direct avec les embryons eux-mêmes. Ensuite, libérer les embryons de l’agar. Remettre les embryons dans de l’eau d’œufs et les conserver à 28 degrés Celsius jusqu’à l’analyse de l’expression de la GFP.

Transférez les embryons dans de l’eau pour œufs contenant 0,02 % d’anesthésique trica pendant plusieurs minutes comme précédemment, mais au centre d’une plus petite boîte de Pétri de 35 millimètres. Ajoutez une grande goutte d’une solution à 0,5 % d’agarose à bas point de fusion dans de l’eau pour œufs contenant de la trica. Ajoutez ensuite un embryon anesthésié à cette goutte d’agarose en utilisant des embouts de pipette micro-loader coupés.

Positionner l'embryon à la verticale afin de faciliter une vue dorsale du cerveau en développement sous un microscope droit. Solidifier les aros sur de la glace et utiliser des embouts de micro-pipette coupés pour maintenir l'orientation de l'embryon. Enfin, inonder la boîte avec de l'eau d'œuf additionnée de trica, en veillant à ce que la solution recouvre entièrement la goutte d'aro solidifiée.

Cet exemple combine la résolution temporelle de l'électroporation in vivo avec une expression spécifique à un type cellulaire, médiée par des lignées transgéniques pièges à enhanceurs, afin de cibler le bulbe olfactif en développement. La lignée transgénique piège à enhanceurs présente une expression constitutive de m-cherry et de calt A quatre dans le cervelet du cerveau postérieur, le prosencéphale et le bulbe olfactif chez les embryons à cinq jours post-fécondation. Importamment, quatre jours après électroporation, les cellules exprimant la GFP montrent des projections axonales typiques des cellules mitrales du bulbe olfactif.

Cette comparaison des signaux provenant de M Cherry et de l'exposition réduite de GFP démontre que les corps cellulaires exprimant GFP sont effectivement localisés dans le bulbe olfactif à l'aide de constructions d'ARN court en épingle (short hairpin RNA). Cette procédure peut également être utilisée pour induire une perte de fonction dans des types cellulaires spécifiques du cerveau en développement.