Enquêter Outer motilité cellulaire cheveux avec une combinaison de stimulation externe champ électrique alternatif et analyse d'images à haute vitesse

L'objectif général de cette procédure est de présenter une méthode fiable pour étudier les réponses motrices des cellules ciliées externes, ou OHC, notamment l'électromotilité, la motilité lente et la flexion aux fréquences acoustiques. Cette approche consiste tout d'abord à prélever des os temporaires de cobayes, de souris ou d'autres animaux mammifères, puis à ouvrir la bulle pour exposer la cochlée. La deuxième étape consiste à immerger la cochlée dans le milieu Lebovits L 15, à retirer la région apicale de l'enveloppe osseuse, le ligament spiral et le vaisseau en forme de paille, puis à extraire l'organe de Corti.

Après une incubation de cinq minutes de l'organe de Corti dans une solution de collagénase à un milligramme par millilitre, celui-ci est transféré dans la chambre d'enregistrement à l'aide d'une seringue Hamilton de 50 microlitres, et les cellules sont dissociées en les faisant passer plusieurs fois à travers l'aiguille. La chambre d'enregistrement est ensuite placée sous le microscope pour stimuler les cellules à l'aide d'un champ électrique alternatif externe et enregistrer en vidéo les réponses motiles des cellules ciliées externes isolées à l'aide d'une caméra à grande vitesse. Enfin, la motilité électromécanique, la motilité lente et la flexion des cellules ciliées externes aux fréquences acoustiques peuvent être évaluées par analyse d'image assistée par ordinateur.

Commencez cette procédure par la récolte des os temporaux de cobayes, de souris ou d'autres modèles animaux mammifères. Ensuite, ouvrez les os temporaux à l'aide d'une pince coupante. Afin d'exposer le cochlée, retirez soigneusement l'excès d'os tout en conservant intacte la capsule osseuse du cochlée, puis immergez-la dans du L15 vivant.

Sous le microscope, ouvrez la région apicale du cochlée. Retirez le séparateur, les VASIs et le ligament spiral à l’aide de la pointe d’un scalpel, d’un curet microscopique ou d’une pince fine. Retirez l’organe de Corti du modiolus cochléaire à l’aide de la pince.

Placez ensuite le cochlée dans un milligramme par millilitre de collagénase à température ambiante pendant cinq minutes. Si des cellules ciliées de la région basale du cochlée sont nécessaires, retirez la capsule osseuse recouvrant la base du cochlée à l’aide de la pince et séparez la spirale de l’os temporal en utilisant la lame de scalpel. Avant de retirer l’organe de Corti, transférez l’organe de Corti dans la chambre d’enregistrement à l’aide d’une seringue Hamilton de 50 microlitres. Dissociez ensuite les cellules en les faisant passer par le bout de l’aiguille.

Voici le schéma du générateur de champ électrique alternatif externe et des connexions avec le système de capture d'images, les circuits de commande et les logiciels spécialement mis en œuvre au centre technique de l'Institut de l'Oreille de la Maison. Le dispositif expérimental utilisé dans cette expérience comprend un microscope inversé Axia vert 1 3 5 TV équipé d'un système d'illumination alternatif à LED et de deux micro-manipulateurs électroniques. Trois rapports de caméra sont associés au microscope : une caméra photo tron ultra-rapide contrôlée par PC, modèle fast cam X 10 24 PCI, installée sur le téléport, qui offre une haute résolution et permet de capturer des images à des fréquences élevées atteignant 100 000 images par seconde.

Les images fournies par la caméra haute vitesse sont directement observées sur l'écran de l'ordinateur. Une caméra CCD ordinaire supplémentaire, montée sur le porte-oculaire, est connectée à un moniteur haute résolution. Un appareil photo numérique classique monté sur le porte-avant permet la capture d'images fixes. Un logiciel maison fonctionnant sur le même ordinateur contrôle le déclenchement de la caméra haute vitesse, le système d'éclairage et le montage du champ électrique alternatif externe.

Les deux électrodes, constituées de deux fils d'argent de 0,25 millimètre de diamètre avec une distance entre les pointes de 0,8 millimètre sur un micromanipulateur électrique. Ensuite, étalonner le champ électrique à l'aide d'une électrode externe. Cette électrode mesure le potentiel électrique en différents points, générant une carte du champ électrique.

Si une cellule ciliée externe isolée unique est placée entre les extrémités des électrodes, avec son axe longitudinal parallèle au champ électrique alternatif appliqué, elle se déplace en s'allongeant et en se raccourcissant à la même fréquence que le champ électrique. Par exemple, on observe ici une cellule stimulée à 50 hertz et enregistrée à 1000 images par seconde. Cette image suivante montre une cellule stimulée à quatre kilohertz et enregistrée à 18 000 images par seconde.

Si la cellule est placée perpendiculairement au champ, un autre type de réponse par flexion des cellules ciliées externes peut être observé et étudié. Cette cellule, par exemple, fléchit lorsqu'elle est stimulée à 50 hertz par un champ électrique perpendiculaire à son axe le plus long. Les cellules ciliées externes peuvent présenter des changements de forme en réponse à une stimulation non électrique.

Cette réponse est appelée mobilité lente et peut également être étudiée à l'aide de cette technique. Sélectionnez différentes stimulations parmi les quatre protocoles distincts. Le premier est une fréquence unique continue.

Remarquez que le mode de stimulation, la fréquence, l'amplitude et le type d'onde peuvent être sélectionnés, comme indiqué par les cercles rouges avec le logiciel de commande maison. Le second protocole de stimulation est une fréquence unique en salves, dans lequel la durée des salves et les intervalles entre les salves sont réglables. Le troisième est un balayage linéaire dans lequel les fréquences initiale et finale sont ajustables.

Le quatrième protocole de stimulation est la stimulation multiple, qui permet la combinaison de différents modes de stimulus. Après avoir sélectionné les paramètres correspondants, le logiciel de contrôle configure le système et permet à l'opérateur d'initier, en cliquant sur un seul bouton à l'écran de l'ordinateur, l'enregistrement vidéo synchronisé avec la lumière et la stimulation des cellules. Dans ce film, les cellules ciliées externes isolées montrent des changements de longueur ou de courbure lorsqu'elles sont stimulées par un champ électrique alternatif externe, parallèle ou transversal respectivement à leur axe longitudinal.

Les réponses des cellules ciliées externes sont analysées hors ligne à l'aide de la fonction de suivi des caractéristiques du logiciel Pro Analysts. On observe ici une cellule ciliée externe stimulée à une fréquence de 50 hertz et enregistrée à 1000 images par seconde. Le logiciel fournit la distance entre deux points image par image, comme illustré ici pendant le raccourcissement de la cellule. La distance entre les points sélectionnés au sommet, indiqués en rouge comme plaque cuticulaire, et à la base de la cellule, indiqués en vert comme pôle basal, est plus petite et augmente lors de l'allongement de la cellule. Le logiciel effectue une analyse image par image des variations de la longueur de la cellule ciliée externe.

Le panneau situé en bas de l'image montre la trace du mouvement. Dans cet exemple, la longueur totale variable est d'environ 6,5 pixels. Voici un exemple illustrant que le bord de la cellule peut être détecté et que la surface de la coupe optique peut être mesurée automatiquement à l'aide de la fonction de suivi de contour avec le logiciel pro analys.

Dans cette expérience, des microsphères en polystyrène sont ajoutées de façon aléatoire à la solution bain et s'attachent fermement à la membrane plasmique. Différentes microsphères peuvent être sélectionnées simultanément et le logiciel peut automatiquement les suivre toutes image par image. De cette manière, les cellules peuvent être divisées en sections, et la mobilité de chaque section peut être évaluée indépendamment.

En sélectionnant les microsphères situées sur les bords latéraux de la cellule, on peut évaluer indépendamment les variations de l'image de la longueur de chaque segment ainsi que les changements d'angle d'un segment par rapport à l'autre. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est effectuée correctement.

Bien sûr, un temps supplémentaire est nécessaire pour l'analyse hors ligne des films enregistrés. Toutefois, avec un logiciel adéquat, cette analyse peut être réalisée en environ trois heures supplémentaires par film. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier les réponses motrices des cellules ciliées externes, incluant l'électromotilité, la motilité lente et la flexion aux fréquences acoustiques.