Name: Génération robuste des hépatocytes comme des cellules embryonnaires humaines à partir populations de cellules souches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Découvrez une méthode efficace pour générer des hépatocytes fonctionnels à partir de cellules souches embryonnaires humaines. Cette technique permet d'obtenir des hépatocytes avec un rendement d'environ 90 % pour étudier la biologie hépatique in vitro.

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Dr Hay a été soutenue par une bourse de RCUK, le Dr West a été soutenu par le Département de chirurgie, le Dr Medine a été soutenu par une subvention du Fonds de base BHF, M. Baltasar Lucendo-Villarin a été soutenue par une MRC Studenship doctorat. Dr Zhou a été soutenu par une bourse du gouvernement chinois.

<ol><li>Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+a+new+era+for+hepatology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology.</a> J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).</li>
<li>Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+Screening+of+Polymer+Libraries+to+Define+Novel+Substrates+for+Functional+Hepatocytes+with+Inducible+Drug+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism.</a> Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).</li>
<li>Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+Functional+Hepatocyte+Like+Cells+in+Immune+Compromised+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice.</a> Liver International. 31, 254-262 (2011).</li>
<li>Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocyte+Like+Cells+and+their+Potential+in+Toxicity+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening.</a> Toxicology. 278, 250-255 (2010).</li>
<li>Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Stem+Cell+Derived+Hepatic+Endoderm+in+Human+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).</li>
<li>Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Comparison+between+Conditioned+Media+and+Serum+Free+Media+in+Human+Embryonic+Stem+Cell+Culture+and+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation.</a> Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).</li>
<li>Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+Future+Challenges+in+Stem+Cell-Derived+Liver+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).</li>
<li>Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Differentiation+of+hESCs+to+Functional+Hepatic+Endoderm+Requires+ActivinA+and+Wnt3a+Signalling%5BTitle%5D)+AND+%22+Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).</li>
<li>Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inhibitory+Role+of+Stromal+Cell+Mesenchyme+on+Human+Embryonic+Stem+Cell+Hepatocyte+Differentiation+is+Overcome+by+Wnt3a+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment.</a> Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous avons développé un modèle simple, homogène et hautement reproductibles in vitro pour générer des niveaux évolutifs du CLH humaine. Notre modèle a été validé par un certain nombre de laboratoires externes collaborent. Nous avons régulièrement de caractériser des cellules souches dérivées CLH utilisant notre boîte à outils dans la maison de marqueurs spécifiques de développement et des tests fonctionnels du foie (dont la plupart sont disponibles dans le commerce). Les étapes essentielles dans notre processus...

Plaques revêtement Matrigel et flacons <ol><li> Matrigel (10 ml, BD Biosciences, RU); conserver à -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); conserver à 4 ° C. </li><li> Plaques de culture tissulaire (6 puits, 12 puits, Corning, Royaume-Uni) </li><li> Flacon de culture de tissus (25 cm2 ventilé, Corning, Royaume-Uni) </li></ol> Entretien CSEh <ol><li> Moyenne de fibroblastes de souris embryonnaires conditionné (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, États-Unis); conserver à -20 ° C. </li><li> BSA solution (50 ml, Sigma Aldrich, Royaume-Uni); conserver à 4 ° C. </li><li> L&#39;homme facteur de croissance basique des fibroblastes (100 ug, Peprotech, Etats-Unis); conserver à -20 ° C. </li></ol> CSEh repiquage avec de la collagénase <ol><li> Ainsi Confluent ou un flacon de CSEh. </li><li> Puits Matrigel enduits ou des flacons, le cas échéant. </li><li> Phosphate saline tamponnée (-MgCl 2, CaCl-2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); stocker à température ambiante. </li><li> Collagénase IV (1 g, Gibco, InvitrOgen, Royaume-Uni); conserver à 4 ° C. </li><li> Moyenne de fibroblastes de souris embryonnaires conditionné (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, États-Unis). </li><li> L&#39;homme facteur de croissance basique des fibroblastes (100 ug, Peprotech, Etats-Unis). </li></ol> La différenciation des CSEh au endoderme hépatique <ol><li> RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); conserver à 4 ° C. </li><li> Supplément B27 (10 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); conserver à -20 ° C. </li><li> Activine A (2 ug, Peprotech, Etats-Unis); conserver à -20 ° C. </li><li> Recombinant Wnt3a la souris (2 ug, R &amp; D Systems, États-Unis); conserver à -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); conserver à 4 ° C. </li><li> KO-SR (500 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); conserver à -20 ° C. </li><li> Non-acides aminés essentiels (100 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); conserver à 4 ° C. </li><li> β-mercaptoéthanol (10 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); conserver à 4 ° C. </li><li> DMSO (Sigma Aldrich, Royaume-Uni); stocker à température ambiante </li><li> Leibovitz L-15 milieu de culture (500 ml, SIGMune Aldrich, Royaume-Uni); conserver à 4 ° C. </li><li> Bouillon tryptose phosphate (100 ml, Sigma Aldrich, Royaume-Uni); conserver à 4 ° C. </li><li> Fœtale sérum bovin, inactivé par la chaleur (500 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); conserver à -20 ° C. </li><li> Hydrocortisone 21-hémisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, Royaume-Uni); conserver à -20 ° C. </li><li> Insuline (pancréas de bovin) (100 mg, Sigma Aldrich, Royaume-Uni); conserver à -20 ° C. </li><li> L-glutamine (100 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); conserver à -20 ° C. </li><li> L&#39;acide ascorbique (25 g, Sigma Aldrich, Royaume-Uni); conserver à -20 ° C. </li><li> Human HGF (10 ug, Peprotech, Etats-Unis); conserver à -20 ° C. </li><li> Recombinant Human oncostatine M (OSM) (50 mg, R &amp; D Systems, États-Unis); conserver à -20 ° C. </li><li> Seringue conduit l&#39;unité filtre de 0,22 um (Millipore, Royaume-Uni) </li></ol> Caractérisation de l&#39;endoderme hépatique CSEh dérivées Immunocoloration <ol><li> Tampon phosphate salin (-MgCl 2, CaCl-2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); STOre à la température ambiante. </li><li> PBST, PBS composé avec 0,1% de Tween 20 (Sigma-Aldrich, Royaume-Uni). </li><li> Paraformaldéhyde (PFA) (Sigma-Aldrich, Royaume-Uni) est constituée en PBS, stocker à -20 ° C. </li><li> Le glycérol (Sigma-Aldrich, Royaume-Uni), de stocker à température ambiante. </li><li> Tris Base (Sigma-Aldrich, Royaume-Uni), de stocker à température ambiante. </li><li> Éthanol </li><li> Sérum (ABD Serotech, Royaume-Uni), conserver à -20 ° C. </li><li> Anticorps secondaire, les fluorophores Alexa (Molecular Probes, Invitrogen, Royaume-Uni). </li><li> Mowiol 4-88 (Polysciences Inc, États-Unis) est constitué de Tris HCL et le glycérol comme instructions du fabricant. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni) est ajouté à la solution MOWIOL à une dilution 1:1000. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Les anticorps primaires </td><td></td><td></td></tr><tr><td> * Antigène </td><td> Tapez </td><td> Fournisseur </td><td> De dilution </td></tr><tr><td> ALB </td><td> Monoclonaux de souris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> E-cadhérine </td><td> Monoclonaux de souris </td><td> Millipore </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> α-fœtoprotéine </td><td> Monoclonaux de souris </td><td> Sigma </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> SSEA-4 FITC </td><td> Monoclonaux de souris </td><td> Biolegend </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Monoclonaux de souris </td><td> DAKO </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td colspan="2"> Anticorps secondaire </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris conjugué FITC </td><td> Chèvre monoclonaux </td><td> Invitrogen </td><td> 1 / 400 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Les anticorps utilisés pour CSEh dérivées hépatiques endoderme immunomarquage, les concentrations utilisées, les espèces développées à l&#39;intérieur et les entreprises qu&#39;ils sont achetés. Analyse fonctionnelle de l&#39;endoderme hépatique et de Normalisation (par mg de protéine) <ol><li> p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits et luminomètre (Promega, États-Unis). </li><li value="1"> Blanc fond plat plaque de 96 puits d&#39;essai (BD Biosciences, RU). </li><li> BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, RU). </li><li> Transparent 96 plaque de dosage bien (Iwaki, Royaume-Uni) </li></ol>

génération robuste des hépatocytes comme des cellules embryonnaires humaines à partir populations de cellules souches

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Malgré les progrès dans la toxicité des médicaments de modélisation humaine, de nombreux composés échouent lors des essais cliniques en raison d&#39;effets secondaires imprévus. Le coût des études cliniques sont considérables, il est donc essentiel que plusieurs écrans toxicologie prédictive sont développées et déployées au début du développement de médicaments (Greenhough et al 2010). Hépatocytes humains représentent le modèle actuel de l&#39;or standard pour évaluer la toxicité des médicaments, mais ils sont une ressource limitée qui présentent fonction variable. Par conséquent, l&#39;utilisation de lignées cellulaires immortalisées et des modèles de tissus animaux sont couramment employées en raison de leur abondance. Alors que les deux sources sont informatifs, ils sont limités par la fonction pauvres, la variabilité des espèces et / ou d&#39;instabilité dans la culture (Dalgetty et al 2009). Les cellules souches pluripotentes (PSC) sont une source intéressante alternative d&#39;hépatocytes humains comme des cellules (CLH) (Medine et al 2010). CPP sont capables d&#39;autorenouvellement et de différenciation à tous les types de cellules somatiques dans l&#39;adulte et représentent ainsiune source potentiellement inépuisable de cellules différenciées. Nous avons développé une procédure qui est simple, très efficace, se prêtent à l&#39;automatisation et les rendements fonctionnels CLH humaine (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 et Hay et al 2011). Nous croyons que notre technologie peut conduire à la production évolutive de CLH pour la découverte de médicaments, la modélisation des maladies, la construction d&#39;appareils extra-corporelle et, éventuellement, les thérapies cellulaires de transplantation base.

Cet article se concentrera sur la génération de l&#39;endoderme hépatiques humaines embryonnaires humaines à partir des populations de cellules souches.

Génération robuste des hépatocytes comme des cellules embryonnaires humaines à partir populations de cellules souches

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

L’objectif global de l’expérience suivante est de produire des niveaux homogènes d’hépatocytes humains pour étudier la biologie du foie humain in vitro. Ceci est initié en conduisant des cellules souches embryonnaires humaines ou des ESC humaines vers l’endoderme définitif à l’aide de stimuli physiologiques actifs dans A et WINT trois A.As une deuxième étape, l’endoderme définitif est très efficacement conduit à l’endoderme hépatique. Ensuite, l’endoderme hépatique dérivé de l’ESC humain est affiné in vitro pour produire des hépatocytes humains fonctionnels.Les résultats de la PCR Western blot, de l’immunofluorescence, de l’Eliza et du métabolisme des médicaments indiquent que cette méthode dérive des hépatocytes à partir de CSE humaines avec une efficacité d’environ 90 %. À l’avenir, cela permettra de prédire avec précision la toxicité des médicaments et de fournir un soutien au foie humain. L’astuce consiste à stimuler la différenciation solaire et la densité centrale des cellules humaines.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la densité cellulaire de base est essentielle pour générer une population cellulaire homogène. Nous avons formé plus de 15 personn

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Cet article se concentrera sur le développement de surfaces recouvertes de polymères pour la culture stable à long terme d’hépatocytes humains dérivés de cellules souches.

Stabiliser hépatocellulaire phénotype en utilisant des surfaces synthétiques optimisés

La méthode présentée ici décrit une solution évolutive et de bonnes pratiques de fabrication (BPF) système de différenciation -ready pour générer des cellules hépatocytes humains comme à partir de cellules souches pluripotentes. Il sert comme un système rentable et standardisée pour générer des cellules hépatocytes comme humains pour la recherche fondamentale et appliquée foie humain.

Définition et génération évolutive des cellules hépatocytes-like de pluripotentes humaines Cellules souches

Le protocole présenté ici décrit une plate-forme pour l’identification de petites molécules pour le traitement des maladies du foie. On présente une description étape par étape détaillant comment de CISP se différencient en cellules ayant des caractéristiques d’hépatocytes en plaques à 96 puits et d’utiliser les cellules pour dépister les petites molécules ayant une activité thérapeutique potentielle.

À l’aide de l’homme induit des hépatocytes-comme dérivé de cellules souches pluripotentes for Drug Discovery

Ce protocole décrit une approche semi-automatisée pour produire des cellules semblables à des hépatocytes de cellules souches pluripotentes humaines dans un format de 96 puits plat. Ce processus est rapide et rentable, ce qui permet que la production de qualité assurée des lots de cellules semblables à des hépatocytes pour la recherche humaine fondamentale et appliquée.

Production semi automatisée de Hepatocyte comme cellules de cellules souches pluripotentes

Ce protocole détaille une méthode monocouche, sans sérum, pour générer efficacement des cellules hépatocytes à partir de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) en 18 jours. Cela implique six étapes que les hPSC se différencient séquentiellement en types de cellules intermédiaires tels que la strie primitive, endoderm définitif, prégut postérieur et progéniteurs de bourgeons hépatiques avant de former des cellules hépatocytes.

Différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines en cellules hépatiques

Ce protocole décrit une approche pour produire des hépatosphères à partir de cellules souches pluripotentes humaines à l'aide d'un système de culture défini et de l'auto-assemblage cellulaire. Ce protocole est reproductible dans un certain nombre de lignées cellulaires, rentable et permet la production d'hépatosphères humaines stables pour une application biomédicale.

Production sans sérum d'hépatosphères humaines tridimensionnelles à partir de cellules souches pluripotentes

L’objectif de cet article est de fournir une approche standardisée pour induire la différenciation des progéniteurs hépatiques humains à partir de cellules souches pluripotentes. Le développement de cette procédure avec des formulations de milieux prêtes à l’emploi offre à l’utilisateur un système facile pour générer des cellules hépatiques humaines pour la recherche biomédicale et la traduction.

Spécification du progéniteur hépatique à partir de cellules souches pluripotentes à l’aide d’un système de différenciation défini

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en cellules fonctionnelles de type hépatocytes (CHN) en complétant continuellement l’activine A et le CHIR99021 pendant la différenciation du CSEh en endoderme définitif (DE).

Une méthode efficace pour l’induction de cellules dirigées de type hépatocytes à partir de cellules souches embryonnaires humaines

Nous présentons ici une méthode non génétique pour générer des sphéroïdes hépatiques autologues humains en utilisant des cellules mononucléaires isolées du sang périphérique à l’état d’équilibre.

Sphéroïdes hépatiques humains provenant du sang périphérique pour les études sur les maladies du foie

Ce protocole décrit la génération d’organoïdes hépatiques endodermiques rapides et reproductibles (eHEPO). Avec ce protocole, les eHEPO peuvent être produits en 2 semaines et se développer à long terme (plus d’un an) sans perdre leur différenciation et leur fonctionnalité.

Génération d’organoïdes hépatiques endodermiques fonctionnels

Les systèmes de différenciation des cellules souches pluripotentes (CSP) disponibles en cellules fonctionnelles sont actuellement entravés par des problèmes de variabilité sévère d’une ligne à l’autre et d’un lot à l’autre. Ici, en utilisant la différenciation cardiaque comme exemple principal, nous présentons un protocole pour surveiller et moduler intelligemment le processus de différenciation des CSP basé sur l’apprentissage automatique basé sur l’image.

Une stratégie d’apprentissage automatique basée sur l’image de cellules vivantes pour surveiller la différenciation des cellules souches pluripotentes

Découvrez une méthode efficace pour générer des hépatocytes fonctionnels à partir de cellules souches embryonnaires humaines. Cette technique permet d'obtenir des hépatocytes avec un rendement d'environ 90 % pour étudier la biologie hépatique in vitro.

Génération robuste des hépatocytes comme des cellules embryonnaires humaines à partir populations de cellules souches

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