Génération robuste des hépatocytes comme des cellules embryonnaires humaines à partir populations de cellules souches

L’objectif global de l’expérience suivante est de produire des niveaux homogènes d’hépatocytes humains pour étudier la biologie du foie humain in vitro. Ceci est initié en conduisant des cellules souches embryonnaires humaines ou des ESC humaines vers l’endoderme définitif à l’aide de stimuli physiologiques actifs dans A et WINT trois A.As une deuxième étape, l’endoderme définitif est très efficacement conduit à l’endoderme hépatique. Ensuite, l’endoderme hépatique dérivé de l’ESC humain est affiné in vitro pour produire des hépatocytes humains fonctionnels.

Les résultats de la PCR Western blot, de l’immunofluorescence, de l’Eliza et du métabolisme des médicaments indiquent que cette méthode dérive des hépatocytes à partir de CSE humaines avec une efficacité d’environ 90 %. À l’avenir, cela permettra de prédire avec précision la toxicité des médicaments et de fournir un soutien au foie humain. L’astuce consiste à stimuler la différenciation solaire et la densité centrale des cellules humaines.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la densité cellulaire de base est essentielle pour générer une population cellulaire homogène. Nous avons formé plus de 15 personnes sur quatre sites à l’échelle internationale pour pratiquer cette technique avec succès. Commencer par une culture de cellules souches embryonnaires humaines et propager sur des plaques recouvertes de matrigel avec des fibroblastes embryonnaires de souris milieux conditionnés ORM cm complétés par un FGF basique.

Il est important de caractériser soigneusement les CSE humaines maintenues avant la différenciation hépatique. Par exemple, ces cellules présentent une morphologie ESC humaine. Ils expriment également les marqueurs de cellules souches pluripotentes, OCT quatre et nano, à des niveaux comparables à ceux de la lignée ESC humaine H sept.

De plus, les ESC humains sont positifs pour la SS EEE quatre. Lorsque les ESC E humains atteignent une fluidité de 30 à 60 %, remplacez le ME CM par un milieu de différenciation fraîchement préparé. Pour initier la différenciation hépatique, le milieu doit être remplacé toutes les 24 heures pendant trois jours.

Après trois jours, les cellules prennent une apparence triangulaire lorsqu’elles commencent à se différencier vers un phénotype endodermique. Basculez le support vers la différenciation SR DMSO. Culture moyenne pendant quatre à cinq jours.

Remplacement du support toutes les 48 heures. Après cette période de cinq jours, les cellules commenceraient à prendre un aspect polygonal caractéristique des cellules hépatiques. La différenciation de l’ESC humaine en endoderme hépatique se traduit par une série de changements morphologiques profonds au neuvième jour.

De plus, l’expression d’Octa 4 au cours des neuf jours diminue progressivement. En revanche, les transcrits hépatiques d’une PF et d’une albumine augmentent à partir du septième jour. Continuez en faisant mûrir les cellules et en maintenant le phénotype hépatique dans le milieu final pendant neuf jours avec un milieu frais toutes les 48 heures.

Enfin, surveiller les cellules cultivées par microscopie à contraste de phase pour détecter des changements morphologiques progressifs allant d’une forme triangulaire hérissée à une morphologie hépatique caractéristique affichant un aspect polygonal afin d’évaluer quantitativement le dosage de la fonction de l’endoderme hépatique. Pour le cytochrome P quatre 50 activité enzymatique, en particulier SIP trois A quatre ou SIP un A deux. Premier jour d’incubation 17.

Cellules endodermiques hépatiques dérivées de l’ESC humaine avec le substrat spécifique effectuant des réactions en trois exemplaires. N’oubliez pas d’utiliser un milieu de culture tissulaire comme témoin négatif et d’incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq heures. Recueillir les surnageants et mesurer les niveaux relatifs d’activité enzymatique basale comme indiqué dans les instructions du fabricant.

Maintenant, pour chaque échantillon, calculez l’activité enzymatique par milligramme de protéine telle que déterminée par A-B-C-A-S. Une immunocoloration de cultures typiques dérivées par cette méthode de maturation in vitro de l’endoderme hépatique. Démontrer l’expression homogène de trois marqueurs hépatiques humains, l’albumine, un FP et ein.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de différencier efficacement les cellules souches humaines et apprenantes en hépatocytes. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée au quotidien avec un engagement d’environ deux minutes et demie par million de cellules. Il est très important de vérifier quotidiennement les changements morphologiques pendant le processus de différenciation.