Modélisation des métastases du cancer de l’ovaire dans la muqueuse de la cavité péritonéale : une méthode pour établir un modèle 3D in vitro de la muqueuse péritonéale

Le péritoine, ou la membrane qui tapisse la cavité abdominale, constitue des cellules mésothéliales péritonéales soutenues par une couche de tissu conjonctif fibrovasculaire. Les cellules cancéreuses de l’ovaire métastasées adhèrent à cette muqueuse péritonéale et prolifèrent dans des excroissances cancéreuses.

Pour modéliser les métastases du cancer de l’ovaire, commencez par prendre des fibroblastes humains dans un tube conique et mélangez-les avec du collagène - une protéine de la matrice extracellulaire. Déposer la suspension sur une boîte de culture. Incuber pour faciliter la solidification de la matrice de collagène afin d’intégrer les fibroblastes et d’imiter le tissu conjonctif du péritoine.

Ensuite, ajoutez une suspension de cellules mésothéliales sur la couche de fibroblaste-collagène. Incuber la plaque pour permettre aux cellules mésothéliales d’adhérer et de former une monocouche à la surface de la couche de fibroblaste-collagène. Cette culture organotypique 3D imite maintenant la composition et l’architecture d’une muqueuse péritonéale in vivo.

Enfin, ensemencez cette culture organotypique avec des cellules cancéreuses de l’ovaire et incubez pendant la durée souhaitée. Les cellules cancéreuses de l’ovaire libèrent certaines molécules de signalisation qui modifient la couche mésothéliale, améliorant l’adhésion et l’invasion des cellules cancéreuses, imitant les conditions métastatiques in vivo.

Pour libérer les fibroblastes normaux de l’épiploon de la culture, rincez le ballon de culture avec 10 millilitres de PBS suivis de 3 millilitres de trypsine pendant pas plus de 5 minutes. Lorsque les cellules se sont détachées, neutralisez la trypsine avec au moins trois fois le volume du milieu de croissance complet et transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres. Faites tourner les cellules et remettez la pastille en suspension dans 5 millilitres de milieu de croissance complet. Ensuite, comptez les cellules et diluez-les à 2 à 4 fois 10 puissance 10 au troisième fibroblaste pour 100 microlitres de concentration de milieu de croissance complète.

Ensuite, ajoutez 0,5 microgramme par 100 microlitres de collagène I en queue de rat aux cellules et placez 100 microlitres de cellules par puits dans une plaque noire à fond transparent de 96 puits. Ensuite, transférez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire pendant au moins 4 heures ou jusqu’à ce que les cellules adhèrent à la surface de la plaque. Pendant que les fibroblastes de l’épiploon normaux se déposent, détachez le HPMC de leurs flacons de culture et diluez ces cellules à 1 à 2 fois 10 au quatrième HPMC par 50 microlitres de milieu de croissance complet.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de HPMC par puits aux fibroblastes normaux de l’épiploon attachés et retournez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant au moins 18 heures avant l’utilisation expérimentale. Le lendemain, ensemencez les co-cultures organotypiques 3D avec la GFP exprimant des cellules cancéreuses de l’ovaire à partir d’une culture confluente de 80 % à 90 % à la dilution appropriée pour le test en aval souhaité.