Purification des peptides : une technique basée sur la RP-HPLC pour extraire des peptides à partir de lysats de protéines digérées

Pour isoler et purifier les peptides, commencez par une suspension de lysat de protéines contenant un mélange de peptides digérés.

Traitez le mélange avec de l’acide trifluoroacétique ou un réactif à base de TFA. Ce réactif anionique ou chargé négativement forme un complexe de paires d’ions avec des résidus basiques ou chargés positivement sur les peptides, masquant ainsi leur charge et améliorant l’hydrophobicité des peptides.

Maintenant, assemblez une colonne de chromatographie liquide haute performance en phase inverse, ou RP-HPLC, contenant une phase stationnaire poreuse à base de silice, immobilisée avec des ligands hydrophobes non polaires. Ajoutez un tampon d’équilibrage compatible avec les peptides à la colonne pour préparer la phase stationnaire avant l’application de l’échantillon.

Maintenant, chargez l’échantillon acidifié dans la colonne. À l’intérieur de la colonne, les peptides hydrophobes s’adsorbent sélectivement sur les ligands hydrophobes de la phase stationnaire. Passez un tampon de lavage à travers la colonne pour éluer toute particule non liée ou indésirable.

Ensuite, passez un tampon d’élution organique moins polaire, avec une hydrophobie élevée, à travers la colonne. En raison de leur affinité sélective envers le tampon d’élution, les peptides liés se désorbent de la matrice de colonne.

Prélevez l’éluat contenant le peptide dans la colonne. Lyophiliser l’éluat pour éliminer la teneur en eau et obtenir une poudre sèche de peptides purs et stables.

Pour acidifier l’échantillon, ajoutez environ 20 microlitres d’acide trifluoroacétique à 5 %, ou TFA, par millilitre de lysat. Mélangez bien le tube et utilisez une bandelette de pH pour mesurer le pH. Si nécessaire, ajoutez 5 % de TFA supplémentaire pour ajuster le pH à 2,5. Ensuite, connectez-vous à l’extrémité la plus courte d’une colonne C18 à un collecteur à vide. Après avoir réglé le vide entre 17 et 34 kPa, utilisez 3 millilitres d’acétonitrile à 100 % et une pipette en verre pour mouiller la colonne.

Équilibrez la colonne à l’aide d’une pipette en verre et en appliquant deux aliquotes de 3 millilitres de TFA à 0,1 %. Ensuite, chargez l’échantillon acidifié sur la colonne. Utilisez trois volumes de 3 millilitres de TFA à 0,1 % pour laver la colonne. Ensuite, appliquez 2 millilitres de 40 % d’ACN, 0,1 % de TFA pour éluer l’échantillon et prélevez deux fractions de 2 millilitres dans des tubes de culture en verre. Avec du parafilm, couvrez les tubes d’éluat et utilisez une aiguille de calibre 20 pour percer trois à cinq trous dans le couvercle avant de lyophiliser les échantillons pendant la nuit.