Hybridation de sonde et amplification de signal dans l’hybridation in situ de l’ARN : une technique de détection de séquences d’ARN spécifiques dans des coupes de tissus

Pour détecter une séquence d’ARN spécifique dans une cellule, commencez par prélever une section de tissu sur une lame de verre. Superposez la section de tissu avec un tampon d’hybridation approprié contenant les sondes d’ARN cibles.

Ces sondes sont des molécules d’ARN en forme de Z ayant une partie de reconnaissance de cible à une extrémité et une séquence de queue à une autre extrémité. Un bras d’espacement relie ces deux extrémités.

Maintenant, incubez la lame dans un four d’hybridation à une température optimale. Les sondes d’ARN en forme de Z pénètrent dans la cellule et s’hybrident par paires avec la séquence d’ARNm cible correspondante.

Retirez la diapositive du four. Immergez la lame dans une solution de lavage pour éliminer les sondes non liées et le tampon d’hybridation en excès.

Ensuite, ajoutez une solution de préamplificateur et incubez. La molécule de préamplificateur se fixe à la séquence de queue de deux sondes Z adjacentes. Cette molécule ne se lie pas à une seule sonde Z, ce qui garantit sa spécificité.

Ensuite, ajoutez le mélange de réactifs de l’amplificateur et incuber. Plusieurs molécules d’amplification s’hybrident dans la séquence unique de préamplificateur.

Enfin, marquez la section de tissu avec les sondes de marquage souhaitées pour détecter la présence d’une séquence d’ARN spécifique dans la cellule.

Pour commencer l’hybridation, tapotez et effleurez les lames pour éliminer tout excès de liquide et remettez-les dans le support de diapositives. Retirez la sonde HPV préchauffée du four et ajoutez environ quatre gouttes pour couvrir entièrement chaque section. Couvrez la plaque avec un couvercle et insérez-la dans le four pendant 2 heures à 40 degrés Celsius. Une fois l’incubation terminée, retirez la plaque du four et retirez la grille coulissante.

Une lame à la fois, retirez rapidement tout excès de liquide et placez la diapositive dans un support à lames immergé dans un plat de coloration rempli de 1x tampon de lavage, en lavant les lames pendant 2 minutes à température ambiante avec une agitation constante, et répétez avec 1x tampon de lavage frais. Tapotez et effleurez pour retirer tout excès de liquide des lames et placez-les à nouveau dans le support de diapositives. Ajoutez environ quatre gouttes d’AMP1 à température ambiante par section pour couvrir entièrement chaque section. Couvrez la plaque avec un couvercle et insérez-la dans le four pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius.

Après avoir retiré la plaque du four, retirez la grille coulissante. En travaillant une lame à la fois, retirez rapidement tout excès de liquide et placez la lame dans le support à lames immergé dans un plat de coloration rempli de 1x tampon de lavage, en lavant pendant 2 minutes à température ambiante avec une agitation constante, et répétez avec 1x tampon de lavage frais.