JoVE Encyclopedia of Experiments
Recherche sur le cancer
0 vues • 2:59 min • April 30th, 2023
Les sphéroïdes sont des agrégats cellulaires sphériques tridimensionnels in vitro qui imitent le microenvironnement tumoral in vivo et aident à étudier la progression tumorale. Pour préserver ces sphéroïdes en les encastrant, commencez par prendre un tube stérile contenant des sphéroïdes dans un tampon souhaité.
Traitez les sphéroïdes avec du paraformaldéhyde. Le paraformaldéhyde réticule les protéines cellulaires, ce qui permet de stabiliser et de préserver la structure cellulaire. Centrifugez les sphéroïdes et retirez le surnageant contenant du paraformaldéhyde. Remettez la pastille sphéroïde en suspension dans le tampon.
Ensuite, préparez la concentration souhaitée de solution de gel d’agarose fondue. Faites une goutte de gel d’agarose sur une lame de microscope. Maintenir la lame sur un bloc chauffant pour éviter la solidification de l’agarose.
À l’aide d’une micropipette à large orifice, prélevez les sphéroïdes du tube. Pipetez soigneusement les sphéroïdes au centre de la goutte de gel d’agarose sans toucher la lame de microscope. Par la suite, incubez la lame à une température appropriée pour permettre à l’ECM de se solidifier et de piéger les sphéroïdes à l’intérieur.
Transférez délicatement la goutte semi-solide de la lame de microscope dans une cassette de tissus. Stocker les sphéroïdes intégrés dans de l’éthanol jusqu’à ce qu’une analyse plus approfondie soit effectuée en aval.
Pour commencer, fixez les sphéroïdes dans une hotte le premier jour, comme indiqué dans le protocole texte. Le deuxième jour, placez le gel d’agarose dans un bécher rempli d’eau dans un four à micro-ondes pour le chauffer, et gardez le gel au chaud sur une plaque chauffante de paillasse réglée à 60 degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
Lavez les sphéroïdes deux fois dans la hotte en utilisant 1 millilitre de PBS glacé par lavage. Ensuite, aspirez la majeure partie du PBS. Préparez une pointe de pipette de 20 microlitres en la coupant en pente pour obtenir une pointe plus pointue avec un trou plus grand.
Après cela, faites une goutte de gel d’agarose sur une lame de microscope. Placez la lame sur un bloc chauffant chaud pour éviter que l’agarose ne se solidifie. À l’aide de la pointe de pipette modifiée, attrapez autant de sphéroïdes que possible dans un volume de 15 à 20 microlitres.
Injectez soigneusement les sphéroïdes au centre de la goutte de gel d’agarose, en veillant à ne pas toucher la lame du microscope. Incuber à température ambiante ou à 4 degrés pendant 5 à 10 minutes pour laisser durcir la goutte de gel d’agarose. Lorsque la goutte de gel s’est quelque peu solidifiée mais qu’elle est encore assez molle, utilisez un scalpel pour la pousser soigneusement de la lame du microscope dans une cassette de tissu en plastique. Transférez la cassette de tissu dans un bécher rempli d’éthanol et conservez-la à température ambiante.