Fabrication de matrice extracellulaire à partir d’un modèle murin : une procédure efficace pour préparer une matrice extracellulaire de langue décellularisée à partir d’une langue murine

La matrice extracellulaire ou ECM - le composant non cellulaire de l’environnement tissulaire - est constituée d’un réseau complexe de protéines structurelles et régulatrices et de polysaccharides sécrétés par les cellules. L’ECM fournit un soutien structurel et biochimique aux cellules et régule leur croissance.

Pour préparer la matrice extracellulaire de la langue, commencez par prendre une langue de souris fraîchement récoltée. Lavez-le avec de l’éthanol pour enlever sa couche lipidique.

Ensuite, soumettez-le à une alternance de cycles de congélation et de décongélation. La congélation favorise la formation de cristaux de glace intracellulaires, tandis que la décongélation fait fondre les cristaux de glace, ce qui entraîne la rupture de la membrane cellulaire.

Maintenant, suspendez la langue dans une solution antibiotique pour inhiber la croissance bactérienne. Par la suite, traitez l’organe avec une solution saline hypertonique. En présence d’une forte concentration de soluté, l’eau s’écoule des cellules, ce qui les fait rétrécir. Cette étape contribue à la mort cellulaire et au détachement de la matrice extracellulaire.

Incuber la langue dans un tensioactif non ionique. Le tensioactif solubilise complètement les membranes cellulaires et nucléaires, facilitant la libération du contenu intracellulaire dans la solution.

Enfin, suspendez la langue dans une solution contenant des ions calcium et magnésium, suivie d’un traitement aux nucléases. Les ions calcium et magnésium augmentent l’activité des nucléases pour dégrader les acides nucléiques libres dans la solution.

Conservez le tissu décellularisé de la langue dans un tampon approprié jusqu’à la suite du traitement.

Après avoir isolé les langues des souris euthanasiées selon le protocole textuel, plongez le tissu dans de l’éthanol à 75 % pendant 3 minutes. Ensuite, transférez chaque langue dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre avec 1 millilitre de PBS stérile de 10 millimolaires. Pour effectuer la lyse cellulaire, congelez les langues à moins 80 degrés Celsius pendant 1 heure. Ensuite, décongelez le tissu à température ambiante pendant 45 minutes. Répétez la congélation-décongélation deux fois de plus.

Ensuite, dans une boîte de culture de 3,5 centimètres ou 6 centimètres contenant 75 % d’éthanol, utilisez une aiguille chirurgicale pour charger chaque langue sur un morceau de suture chirurgicale et, avec un petit morceau de papier d’aluminium stérile, enveloppez l’extrémité de la suture. Dans une boîte de culture de 3,5 centimètres ou 6 centimètres, utilisez 3 millilitres de PBS pour rincer chaque langue pendant 30 secondes. Ensuite, dans une bouteille à large ouverture, préparez 90 microgrammes par millilitre d’ampicilline dans 250 millilitres d’eau ultrapure stérile et ajoutez un agitateur.

Abaissez jusqu’à 5 langues dans le flacon jusqu’à ce qu’elles soient à environ 2 centimètres du fond et serrez le bouchon avec une partie de la suture restant à l’extérieur du flacon. Placez la bouteille sur un agitateur magnétique pendant 12 heures. Ensuite, après l’incubation, préparez 250 millilitres de 90 microgrammes par millilitre d’ampicilline dans du chlorure de sodium stérile à 1 molaire. Transférez les langues et la barre d’agitation dans la bouteille et vissez le bouchon. Placez la bouteille sur l’agitateur magnétique pendant 24 heures.

Pour effectuer la lyse cellulaire, préparez 90 microgrammes par millilitre d’ampicilline dans 250 millilitres de Triton X-100 stérile à 2 % dans du PBS. Transférez les langues et le barreau d’agitation dans la bouteille et serrez le bouchon. Ensuite, remuez le flacon pendant 48 heures. Après avoir préparé le chlorure de calcium et le chlorure de magnésium avec de l’ampicilline, déplacez le mouchoir et remuez la barre dans la bouteille et remuez la bouteille pendant 24 heures.

Préparez 1 millilitre de DNase micromolaire 300 dans HBSS dans un tube de microcentrifugation pour chaque échantillon de langue. Transférez les langues dans les tubes avec la même portion de suture suspendue à l’extérieur. Ensuite, incubez le tissu à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Transférez les échantillons dans une bouteille à large ouverture de PBS stérile avec de l’ampicilline et placez-le sur l’agitateur pendant 24 heures. Après l’incubation, conservez la matrice extracellulaire de la langue préparée, ou TEM, dans du PBS stérile à 4 degrés Celsius jusqu’à l’utilisation.