Essai de discrimination de la population du côté cancéreux : une méthode pour isoler des cellules souches cancéreuses à l’aide d’un test d’efflux de colorant de Hoechst

Une tumeur contient une petite fraction de cellules souches connues sous le nom de population latérale. Ces cellules sont chimiorésistantes, ce qui les rend responsables de la rechute du cancer.

Pour isoler la population latérale de cellules cancéreuses, commencez par ajouter Hoechst - une solution de colorant fluorescent - à la fiole contenant la suspension de cellules cancéreuses. À l’intérieur des cellules cancéreuses normales, les molécules de Hoechst pénètrent dans le noyau et se lient à la région riche en A-T de l’ADN, ce qui entraîne une forte fluorescence dans ces cellules.

En revanche, la population latérale contient une forte concentration de transporteurs ABC - des pompes d’efflux qui éliminent rapidement les molécules de colorant de la cellule. Cet efflux actif de molécules de colorant rend la population latérale fluorescente à faible intensité.

Maintenant, prenez une autre fiole de cellules cancéreuses traitées à Hoechst et ajoutez-y du vérapamil. Cette fiole agit comme un contrôle car Verapamil bloque les transporteurs ABC. Cette étape entraîne une réduction de l’efflux de Hoechst et conserve le colorant à l’intérieur des cellules de population latérales.

Ensuite, contre-colorez les cellules des deux flacons à l’aide d’iodure de propidium. L’iodure de propidium pénètre exclusivement dans le noyau des cellules mortes et s’intercale entre les bases de l’ADN. Cela conduit à une fluorescence élevée dans les cellules mortes.

Enfin, triez les cellules à l’aide d’un trieur de cellules activé par fluorescence ou FACS. Le FACS sépare les cellules tumorales hautement fluorescentes et retenant Hoechst et les cellules mortes des cellules de population latérales à faible fluorescence.

Pour sélectionner une population latérale de cellules souches cancéreuses par test d’efflux de colorant Hoechst, étiquetez d’abord un tube conique « Hoechst » et un autre « Hoechst et vérapamil ». Ensuite, laver une culture cellulaire HNSCC avec du PBS stérile, suivi de l’ajout de 1 millilitre de trypsine-EDTA. Après 3 minutes à 37 degrés Celsius, arrêtez la réaction avec un milieu de culture cellulaire frais et comptez les cellules. Diluer la culture à 1 fois 10 à la septième cellule par millilitre dans un milieu de lignée cellulaire parentale complet.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres dans le tube « Hoechst et Verapamil » et 4 millilitres de cellules dans le tube « Hoechst ». Ensuite, mélangez doucement 10 microlitres de solution de chlorhydrate de vérapamil de 5 millimolaires dans l’échantillon « Hoechst et vérapamil », suivi de 5 microlitres de Hoechst par 1 fois 10 à la sixième cellule des deux tubes. Ensuite, couvrez les échantillons de papier d’aluminium et placez-les à 37 degrés Celsius. Après 90 minutes avec un mélange doux toutes les 15 minutes, centrifugez les tubes et remettez les granulés en suspension dans 2 millilitres de PBS.

Après une deuxième centrifugation, remettre en suspension la pastille « Hoechst et Verapamil » dans 500 microlitres d’iodure de propidium dans PBS et la pastille « Hoechst » dans 4 millilitres de même. Maintenant, filtrez les échantillons à travers des filtres cellulaires de 70 microns dans des tubes FACS pour éliminer tous les agrégats et placez les échantillons sur de la glace à l’abri de la lumière. Ensuite, chargez l’échantillon « Hoechst » sur le cytomètre en flux et ouvrez la fenêtre « Feuille de travail globale » dans le logiciel du cytomètre en flux. Cliquez sur « Dot Plot » pour créer un graphique sur la feuille de calcul globale et faites un clic droit pour sélectionner les paramètres de diffusion vers l’avant et sur le côté.

Créez un pointage de la même manière avec une dispersion latérale large par une hauteur de diffusion latérale, puis cliquez sur « Polygon Gate » pour créer une région P1 dans le deuxième graphique, pour sélectionner les cellules simples et pour discriminer les doublets. Ensuite, créez une zone de Hoechst rouge à côté d’un graphique à points bleu de la zone de Hoechst et faites un clic droit sur les cellules pour mettre en évidence la population P1. Ensuite, créez une région P2 pour sélectionner la population de cellules du côté du colorant Hoechst négatif qui apparaît sous la forme d’une arme latérale à gauche de la population principale de cellules et collectez 10 000 événements d’échantillon « Hoechst ».

Pour confirmer que la porte P2 représentant la population latérale est correctement positionnée, collectez également 10 000 événements d’échantillonnage « Hoechst et Verapamil ». La population latérale devrait disparaître. Ensuite, triez la population latérale de cellules négatives au colorant Hoechst dans un tube conique de 15 millilitres contenant 1 millilitre de milieu complet de cellules souches cancéreuses. À la fin du tri, faites tourner les cellules et remettez en suspension la pastille de population latérale dans 1 millilitre de milieu cellulaire complet frais de type tige cancéreuse. Ensuite, comptez les cellules et ensemencez-les au nombre approprié dans un nouveau flacon de culture cellulaire.