Culture de salisphères à partir de tissus de glandes salivaires : une méthode de développement de salisphères à partir de cellules épithéliales dérivées de glandes salivaires humaines

Les salisphères sont des cultures in vitro, auto-agrégées, de cellules épithéliales dérivées de la glande salivaire. Pour cultiver des salisphères, commencez par prélever le tissu des glandes salivaires humaines dans une plaque de culture.

À l’aide de ciseaux, coupez le tissu en petits morceaux. Ensuite, complétez ces morceaux avec une solution de dissociation contenant des enzymes de collagénase et de dispase et incubez. Ces enzymes digèrent la matrice extracellulaire présente dans les tissus.

De plus, triturez pour homogénéiser le tissu. Cette étape libère les cellules épithéliales et les globules rouges dans la solution. Ensuite, utilisez une passoire cellulaire et filtrez l’homogénat de tissu dans un tube conique frais pour éliminer les morceaux de tissu non digérés et les débris. Centrifugeuse pour granuler les cellules.

Après la centrifugation, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans le tampon de lyse des globules rouges. Ce tampon rompt les globules rouges présents dans la suspension cellulaire.

Maintenant, centrifuger pour granuler les cellules épithéliales. Remettez la pastille en suspension dans un milieu de croissance cellulaire épithéliale approprié. De plus, préparez la plaque de culture de salisphère en enrobant son puits d’une matrice à membrane basale liquéfiée ou BMM. Incuber pour permettre à la matrice de se solidifier.

Enfin, ajoutez la suspension de cellules épithéliales dans les puits recouverts de BMM. En présence de milieux de croissance, les cellules épithéliales se fixent à la couche BMM et prolifèrent en salisphères sphériques.

Dans les deux à quatre heures suivant le retrait du patient, sur une plaque de culture, utilisez des ciseaux de dissection stérilisés en autoclave et une pince chirurgicale pour hacher le tissu des glandes salivaires en petits morceaux de 1 à 2 millimètres. Ajouter 6 millilitres de la solution de dispase/collagénase au tissu haché. Ensuite, incubez à 37 degrés Celsius pendant environ 30 minutes à une heure.

Perturber le tissu en pipetant avec la pipette sérologique de 5 millilitres, 15 à 20 fois. Incuber à 37 degrés Celsius pendant encore 30 minutes à une heure. Répétez l’étape de pipetage et d’incubation deux à trois fois de plus ou jusqu’à ce que le tissu ressemble à une boue et puisse facilement passer à travers l’ouverture de la pipette.

Pour enrober les puits de BMM, pipetez lentement 500 microlitres de BMM décongelé pendant la nuit dans chaque puits d’une plaque à 6 puits. Faites tourner lentement la plaque pour répartir uniformément le BMM sur les puits. Ensuite, incubez les plaques revêtues à 37 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes avant de les utiliser pour permettre au BMM de se solidifier.

Transférez la solution de dispase/collagénase contenant du tissu homogénéisé dans un tube conique de 15 millimètres. Lavez une fois la paroi de la plaque avec 6 millilitres de DPBS pour transférer les cellules restantes dans le tube conique. Ensuite, à travers une passoire à cellules en maille de nylon de 70 micromètres, filtrez l’homogénat dans un nouveau tube conique de 50 millimètres pour éliminer les tissus non digérés.

Centrifuger les cellules contraintes pendant 5 minutes à 500 x g. Aspirer le surnageant. Ensuite, mettez en suspension la pastille cellulaire dans 10 millilitres de 1x tampon de lyse GR. Incuber pendant 5 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 20 à 25 millimètres de DPBS pour neutraliser le tampon de lyse des globules rouges et minimiser la lyse des cellules salivaires.

Centrifuger pendant 5 minutes à 500 x g. La pastille de globule blanc indique la lyse complète de tous les globules rouges. Si la pastille est de couleur rouge, répétez le traitement avec un tampon de lyse RB. Aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 1 à 2 millilitres de BEGM, puis transférez les cellules remises en suspension sur des puits recouverts de BMM.

Incuber à 37 degrés Celsius. Une fois plaquées sur BMM, les cellules se formeront en structures sphériques ou salisphères sur une période de deux à trois jours. Les cellules peuvent être maintenues sous forme de salisphères pendant environ cinq à sept jours avant que le BMM ne commence à se dégrader, ce qui permet aux cellules d’accéder et d’adhérer au plastique et de se développer en monocouche.