Quantification à base de nanoparticules conjuguées d’anticorps à l’aide de la microscopie à fond noir : une procédure pour capturer et quantifier des exosomes spécifiques à partir de fluides corporels

Les exosomes sont de petites structures entourées d’une membrane qui sont sécrétées par les cellules dans l’espace extracellulaire. Les exosomes sont abondamment présents dans les biofluides.

Pour identifier et capturer des exosomes spécifiques dans les fluides corporels, commencez par prendre une lame d’immunodosage multi-puits. Cette lame est fonctionnalisée avec des protéines qui agissent comme des antigènes et se lient à des anticorps spécifiques.

Complétez la lame avec la solution d’anticorps primaire souhaitée et incuber. Ces anticorps se lient aux antigènes pré-enrobés sur la surface de la lame.

Aspirez la solution restante pour éliminer tous les anticorps non liés. Maintenant, ajoutez un tampon bloquant qui bloque les antigènes libres, empêchant ainsi la liaison non spécifique des exosomes.

Ensuite, retirez le tampon de blocage, chargez les exosomes contenant la suspension sérique sur la lame et incuberez. Cela permet la liaison exclusive d’exosomes spécifiques à la cible aux anticorps primaires capturés.

Ensuite, chargez une suspension d’anticorps secondaires conjugués à des nanoparticules d’or sur la surface de la lame. Ces anticorps se fixent aux exosomes pré-liés et forment un complexe de détection.

Enfin, à l’aide d’une pipette, jetez tous les anticorps secondaires non liés. Visualisez les lames au microscope à fond noir. Les nanoparticules d’or présentes à la surface des exosomes diffusent la lumière et apparaissent sous forme de taches lumineuses sur le fond sombre.

Pour commencer à préparer la lame, diluez les anticorps de capture d’exosomes souhaités à 0,025 milligramme par millilitre dans du PBS. Pipeter 1 microlitre de la solution dans chaque puits d’une lame traitée aux protéines A/G avec du verre de qualité optique. Ensuite, transférez la lame dans une boîte d’humidification pour vous assurer que les puits ne se dessèchent pas pendant l’incubation.

Incuber la lame à 37 degrés Celsius pendant 1 heure pour immobiliser les anticorps de capture. Ensuite, aspirez la solution restante pour éliminer les anticorps non liés. Lavez les puits en ajoutant et en aspirant 1 microlitre de PBS trois fois. Ensuite, chargez rapidement chaque puits avec 1 microlitre de tampon de blocage basé sur PBS et incubez la lame à 37 degrés Celsius pendant 2 heures.

Lors de l’analyse d’environ 15 échantillons, nous devons utiliser une pipette à canal unique pour charger le tampon de travail sur 120 puits en moins de 5 minutes afin d’éviter l’évaporation de l’agent bloquant.

Commencez à préparer une solution de nanotiges d’or conjuguées à des anticorps pendant le blocage des lames. Environ 30 minutes avant que le blocage ne se termine, décongelez rapidement des échantillons de plasma ou de sérum dans un bain-marie à température ambiante. Vortex les échantillons décongelés pendant 30 secondes pour s’assurer que les suspensions sont homogènes. Ensuite, centrifugez les échantillons à 500 x g pendant 15 minutes pour précipiter les agrégats de protéines et autres débris.

Transférez 10 aliquotes d’un microlitre de surnageants dans des tubes frais et effectuez des dilutions individuelles avec du PBS. Mélangez les échantillons dilués par vortex doux ou inversion, selon le cas. Lorsque le blocage des lames est terminé, aspirez le tampon de blocage et lavez les puits trois fois avec des portions de 1 microlitre de PBS. Chargez immédiatement les échantillons dans les puits avec 1 microlitre par puits et 8 répétitions par échantillon.

Chargez les étalons d’exosomes dans les puits appropriés de la même manière. Incuber la lame pendant 12 à 18 heures au réfrigérateur à 4 degrés Celsius. Ensuite, aspirez les puits et lavez chaque puits une fois avec 1 microlitre de PBS. Chargez 1 microlitre de suspension de nanotiges d’or conjuguées à des anticorps dans chaque puits et incubez la lame à 37 degrés Celsius pendant 2 heures.

Ensuite, aspirez la suspension de nanotiges et lavez la lame dans du PBS complété par 0,01 % de Polysorbate-20 pendant 10 minutes à l’aide d’un mélangeur. Ensuite, aspirez les puits et lavez la lame dans de l’eau déminéralisée pendant 10 minutes sur un mélangeur rotatif. Retirez l’eau et laissez la lame sécher à l’air libre dans une boîte de Pétri propre avant de l’amener au microscope à fond noir.