Pourquoi le test d'hypothèse nulle est-il important pour la validation de la différenciation des podocytes ?

Le test d'hypothèse nulle est essentiel pour déterminer si les modifications observées dans les caractéristiques des podocytes sont dues au protocole de différenciation ou à une variation aléatoire, ce qui soutient une validation rigoureuse des cibles en recherche rénale.

Comment l'isolement de la variable indépendante s'intègre-t-il aux protocoles de différenciation des iPSC en podocytes ?

L'isolement de variables telles que la composition du milieu ou la durée d'incubation permet aux équipes d'attribuer les résultats de différenciation spécifiquement aux modifications du protocole, améliorant ainsi l'optimisation et la reproductibilité en phase de découverte.

Que permettent les mesures quantitatives des podocytes dans les tests de néphrotoxicité ?

L'évaluation quantitative de la morphologie et de la viabilité des podocytes permet une comparaison objective des effets des composés, soutenant ainsi des décisions fondées sur des données dans le criblage de la néphrotoxicité et le développement d'essais.

Pourquoi les exigences de réplication sont-elles essentielles pour les études transversales des podocytes ?

La réplication garantit que la différenciation des podocytes et les résultats des tests sont cohérents entre les équipes et les expériences, facilitant un partage de données fiable et des efforts collaboratifs de recherche et développement.

Quelles sont les capacités d'analyse statistique nécessaires avant la mise en œuvre du test des podocytes ?

Des outils statistiques rigoureux sont nécessaires pour analyser l'efficacité de la différenciation, la reproductibilité des tests et les effets des traitements, en veillant à ce que les données fondées sur les podocytes répondent aux normes de R&D d'entreprise pour la prise de décision.

Dérivation de podocytes rénaux humains à partir de cellules souches pluripotentes induites : une procédure de différenciation dirigée de podocytes rénaux matures à partir de cellules souches

JoVE Encyclopedia of Experiments

Recherche sur le cancer

0 vues • 4:19 min • April 30th, 2023

Les cellules matures peuvent être reprogrammées pour retrouver leur état indifférencié et prolifératif semblable à celui des cellules souches. Ces cellules reprogrammées sont appelées cellules souches pluripotentes induites ou IPSC. Pour différencier les cellules pluripotentes en cellules spécialisées dans les podocytes impliquées dans la filtration des déchets rénaux, il faut commencer par prendre une suspension d’IPSC humaines dans un milieu d’induction du mésoderme.

Transférez cette suspension sur une plaque de culture recouverte d’une matrice de base et incuberez. La matrice de socle facilite l’adhérence des IPSC à la base. Par la suite, les facteurs spécifiques présents dans le milieu induisent la différenciation des IPSC en cellules du mésoderme, cellules précurseurs des podocytes. Aspirez le support usé.

Complétez la plaque avec le volume souhaité d’un milieu d’induction intermédiaire du mésoderme et incubez pendant une durée prolongée. Cette étape conduit à la différenciation des cellules mésodermiques en podocytes immatures. Remplacer le milieu d’induction intermédiaire du mésoderme par une solution de trypsine pour dissocier les cellules adhérentes de la plaque.

Ensuite, centrifugez pour granuler les cellules. Jetez le surnageant contenant la solution de trypsine et les fragments de matrice. Remettre la pastille en suspension dans un milieu d’induction de podocytes. Transférez la suspension cellulaire dans une plaque de culture fraîchement enrobée. Incuber pour permettre le développement de plusieurs projections en forme de pied à partir de cellules intermédiaires, entraînant la formation de podocytes matures.

Après le comptage, remettez les cellules en suspension à 1 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre de concentration de milieu d’induction du mésoderme et aspirez la solution de matrice extracellulaire à partir des plaques à 2 revêtues de la matrice de la membrane basale. Rincez les plaques deux fois avec un milieu chaud et mélangez la suspension de cellules souches pluripotentes induite par l’homme avec un pipetage doux.

Ajoutez 1 millilitre de cellules dans chaque puits de la matrice de la membrane basale, 2 plaques à 12 puits revêtues et secouez doucement les plaques pour répartir les cellules plus uniformément. Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Aux jours 2 à 15 de la différenciation, remplacez le milieu d’induction du mésoderme par 1 millilitre de milieu d’induction intermédiaire du mésoderme par puits.

Si une croissance cellulaire importante et un épuisement rapide des nutriments sont observés, comme l’indique le jaunissement du milieu, le volume du milieu de différenciation intermédiaire du mésoderme peut être augmenté à 1,3 millilitre par puits. Au 16e jour de la culture, rincez les cellules intermédiaires du mésoderme avec un milieu chaud et incubez les cellules avec 500 microlitres de trypsine-EDTA à 0,05 % par puits pendant 3 minutes à 37 degrés Celsius.

Lorsque les cellules commencent à se dissocier, grattez les cellules avec un lève-cellules et mélangez doucement les cellules par pipetage. Arrêtez la réaction avec environ 2 millilitres de solution neutralisante de trypsine par puits et transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres. Portez le volume à 50 millilitres avec un fluide et récupérez les cellules par centrifugation.

Remettez en suspension le milieu d’induction des pastilles et des podocytes à raison de 1 fois 10 à la cinquième cellules par millilitre de concentration de milieu et ajoutez les cellules à des plaques revêtues de matrice de membrane basale à 2 revêtements. Ensuite, secouez doucement la plaque pour aider à répartir les cellules plus uniformément et placez les cellules dans l’incubateur jusqu’à 5 jours.