Modèle de cellules souches de gliome marquées à la luciférase : une méthode médiée par lentivirus pour préparer des cellules souches de gliome marquées à la luciférase pour des études thérapeutiques in vitro

Les cellules souches de gliome ou GSC sont une sous-population de gliome - un cancer des cellules gliales dans le cerveau.

Le marquage de ces GSC avec des enzymes bioluminescentes comme la luciférase permet d’établir des tests d’imagerie à haut débit pour le dépistage de drogues.

Pour préparer des CSG marquées à la luciférase, commencez par une culture de CSG dans un milieu de croissance approprié.

Centrifuger la culture pour obtenir une pastille cellulaire et retirer le surnageant.

Ajoutez des enzymes digestives appropriées à la pastille. Ces enzymes dissocient les amas de cellules et dégradent toute trace de tissu conjonctif pour obtenir une suspension unicellulaire.

Maintenant, centrifugez la suspension unicellulaire et retirez le surnageant. Remettez le granulé en suspension dans un milieu frais.

Ensuite, ensemencez la concentration souhaitée de cellules dans une plaque de culture.

Incuber la culture et laisser les cellules adhérer à la plaque de culture.

Par la suite, ajoutez le titre souhaité d’une construction de gène contenant un virus pour la protéine fluorescente verte améliorée par la luciférase ou EGFP et incubez.

Le virus interagit avec les récepteurs de surface des CSG, déclenchant la libération d’ARN viral contenant la luciférase-EGFP. Les enzymes cellulaires catalysent la transcription inverse de l’ARN en ADN double brin et l’intègrent dans le génome des GSC.

Lorsqu’elles sont visualisées au microscope à fluorescence, les cellules exprimant la luciférase apparaissent vertes en raison de la fluorescence émise par l’EGFP.

Commencez par prélever les cellules souches de gliome ou GSCs du milieu de culture et les centrifuger à 70 x g pendant 3 minutes à température ambiante. Après avoir retiré le surnageant, digérez les cellules avec de l’accutase pendant 4 minutes à 37 degrés Celsius.

À l’aide d’un embout de 200 microlitres, pipetez les cellules à plusieurs reprises pour dissocier et remettre en suspension la pastille cellulaire. Ajoutez les GSC à une densité de 200 000 cellules dans 1 millilitre de milieu de culture dans chaque puits d’une plaque de culture à 12 puits et incubez-les pendant la nuit.

Le lendemain, ajoutez 30 microlitres de surnageant du virus luciférase-EGFP dans chaque puits de la plaque. Centrifugez les cellules à 1 000 x g pendant 2 heures à 25 degrés Celsius et incubez-les pendant la nuit.

Le lendemain, remplacez le fluide dans les puits en recueillant les CGG, en les centrifugant, en éliminant le surnageant, en les remettant en suspension dans un milieu frais et en les replaquant. Cultivez les cellules pendant encore 48 heures.

Observez la plaque au microscope fluorescent et confirmez l’apparition de cellules GFP positives.