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Pour isoler et purifier des noyaux intacts, commencez par prélever une fraction de noyaux bruts dans un tube. La fraction contient des noyaux intacts ainsi que des fragments de noyaux brisés et des débris.
Mélangez cette fraction avec un milieu à gradient de densité approprié de sorte qu’elle forme une suspension de la concentration la plus faible.
Maintenant, des solutions de couches de densités croissantes du même milieu de gradient sous la fraction des noyaux bruts pré-préparés pour générer un gradient de densité discontinu en plusieurs étapes. Cette étape permet à la fraction des noyaux bruts de former une bande au sommet du gradient.
Ensuite, centrifugez le tube à basse vitesse.
Sur la base des différences de forme et de masse, les noyaux intacts migrent différemment par rapport aux débris et aux fragments nucléaires. Il en résulte que les noyaux intacts forment une bande séparée.
Après centrifugation, localiser la bande distincte constituée de noyaux intacts à l’interface des solutions de gradient de densité.
À l’aide d’une pipette, aspirer les couches supérieures du gradient pour faciliter l’accès à la bande des noyaux purs. Recueillir la bande contenant les noyaux dans un tube frais.
Visualisez ces noyaux au microscope optique. Les noyaux intacts apparaissent parfaitement ronds avec une membrane nucléaire intacte qui les entoure.
Enfin, stockez la fraction nucléaire pure pour une analyse plus approfondie.
Ajoutez 200 microlitres de solution d’iodixanol à 50 % dans les noyaux pour une concentration finale de 25 % d’iodixanol et mélangez 10 fois avec la pipette réglée à 300 microlitres.
Ensuite, ajoutez 300 microlitres de solution d’iodixanol à 29 % sous le mélange à 25 % à l’aide d’une pointe fine P1000 pour éviter de mélanger les couches. Ajouter 300 microlitres de solution d’iodixanol à 35 % sous le mélange à 29 % avec une pointe fine P1000. Ensuite, retirez-le lentement.
Placez les échantillons dans une centrifugeuse à godets oscillants et faites-les tourner pendant 20 minutes à 3 500 x g à 4 degrés Celsius avec le frein desserré.
Retirez délicatement les échantillons sans les secouer et observez-les à la lumière. Une bande blanche claire de noyaux purs à 95 % doit être visible entre la deuxième et la troisième couche.
Pour isoler les noyaux, aspirez les couches supérieures pour exposer la bande blanche des noyaux à l’interface. Collectez la bande de noyaux dans un volume de 200 millilitres et transférez-la dans un tube frais. Ensuite, filtrez-le avec un filtre de 20 micromètres.
Vérifier les noyaux au microscope optique pour vérifier l’élimination des gros débris et l’intégrité de la membrane nucléaire. Ils doivent être ronds et la membrane nucléaire ne doit pas être déformée.