Encyclopédie des expériences JoVE
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Pour commencer, prenez un tube contenant des vésicules extracellulaires intactes ou VE.
Suspendez les VE dans le volume souhaité de tampon de lyse et sonicez l’échantillon. Ce traitement lyse la membrane EV et cisaille le matériel génétique, libérant les protéines dans le tampon.
Centrifugeuse pour granuler les débris cellulaires et le matériel génétique cisaillé. Prélever le surnageant contenant diverses protéines.
Ajoutez un colorant de chargement à l’extrait de protéine et passez-le sur un gel SDS-PAGE.
Trempez le gel dans une solution de coloration pour permettre aux molécules de colorant de se lier aux protéines. Localisez la bande colorée contenant la protéine souhaitée et excisez-la.
Coupez la bande colorée en petits morceaux pour améliorer l’accessibilité des protéines aux enzymes dans les étapes suivantes. Transférez ces morceaux dans un tube de microcentrifugation.
Ajoutez une solution de décoloration qui élimine le colorant colorant. Retirez la solution de décoloration usée.
Ajouter une solution de réduction. Incuber pour permettre à l’agent réducteur de cliver les liaisons disulfure dans les protéines, exposant ainsi les groupes sulfhydryles libres.
Traitez les protéines réduites avec une solution alkylante. Les groupes alkyle se lient aux groupes sulfhydryles libres, maintenant la protéine dépliée.
Jetez l’excès de solution et lavez les morceaux avec une solution déshydratante pour éliminer le réactif alkylant. Séchez complètement le gel.
Les morceaux de gel sont maintenant prêts pour une analyse protéomique plus approfondie.
Pour l’extraction des protéines, mélangez 50 microlitres de tampon RIPA avec l’échantillon EV pendant 5 minutes sur de la glace. Soniquez l’échantillon trois fois à 500 watts et 20 kilohertz pendant 5 secondes. Ensuite, retirez les débris vésiculaires par centrifugation à 20 000 x g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius.
Après avoir isolé les protéines, effectuez la migration des protéines dans le gel d’empilement d’un gel de polyacrylamide à 12 %. Fixez les protéines dans le gel avec du bleu de Coomassie pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, excisez chaque morceau de gel coloré et coupez-le en petits morceaux.
Faites passer les morceaux de gel par une série de lavages successifs comme décrit dans le manuscrit. Ensuite, séchez-les complètement avec un concentrateur sous vide. Après séchage, effectuez une réduction des protéines avec 100 microlitres de bicarbonate d’ammonium de 100 millimolaires contenant du dithiothréitol de 10 millimolaires pendant 1 heure à 56 degrés Celsius.
Ensuite, effectuez une alkylation des protéines avec 100 microlitres de bicarbonate d’ammonium de 100 millimolaires contenant de l’iodoacétamide de 50 millimolaires pendant 45 minutes dans l’obscurité. Lavez les morceaux de gel selon les instructions du manuscrit et séchez-les complètement sur le concentrateur sous vide.