Essai d’attraction des macrophages Transwell basé sur la fluorescence : une méthode in vitro pour étudier l’interaction tumeur-macrophage par chimiotaxie induite par des produits chimiques

En réponse à certains attractifs chimiques libérés par les tumeurs solides, les cellules immunitaires telles que les macrophages associés aux tumeurs ou les TAM s’infiltrent dans les tumeurs solides. Par la suite, ces TAM facilitent la progression tumorale.

Pour étudier les interactions entre les TAM et les cellules tumorales in vitro, il faut commencer par prendre une plaque multipuits avec un insert membraneux. Cette disposition sépare temporairement le puits en deux compartiments.

Ensuite, ajoutez une suspension de TAMs dans le compartiment supérieur du transwell.

Complétez le compartiment inférieur du transwell avec un milieu conditionné enrichi en attractifs chimiques sécrétés par les cellules tumorales.

Incuber l’assiette pendant le temps souhaité.

Pendant l’incubation, les modulateurs chimiques attirent les TAMs. Cela conduit au mouvement des TAM dans le compartiment inférieur via la membrane d’insertion poreuse par chimiotaxie induite par des produits chimiques.

Maintenant, retirez l’insert du puits. Transférez le milieu conditionné contenant la population migratrice de TAM dans une plaque appropriée pour la mesure fluorescente.

Traitez les cellules avec un tampon de lyse contenant un colorant fluorescent. Ce tampon lyse les macrophages. Finalement, les molécules de colorant se lient aux acides nucléiques, produisant une fluorescence améliorée.

Enfin, scannez la plaque à l’aide d’un lecteur de plaque à fluorescence. Une fluorescence élevée indique la migration réussie des macrophages par chimiotaxie induite par des produits chimiques.

Tout d’abord, amenez les matériaux nécessaires à température ambiante. Ajoutez 250 microlitres des cellules MV-4-11 préparées dans chaque insert. Ensuite, ajoutez 400 microlitres du milieu conditionné/fluide uniquement dans les chambres inférieures de la plaque à 24 puits, en veillant à ajouter les échantillons en trois exemplaires.

Incuber à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 4 heures. Ensuite, tapotez doucement l’insert sur la paroi intérieure du même puits et jetez l’insert. Pipetez doucement les cellules dans les puits de haut en bas trois fois pour mélanger.

Transférez 225 microlitres de cette suspension cellulaire dans les puits d’une plaque à paroi noire de 96 puits adaptée à la mesure fluorescente. Après cela, diluez le colorant CyQuant avec un tampon de lyse 4x dans un rapport de 1:75. Vortex brièvement et faites tourner la solution.

Transférez 75 microlitres de cette solution dans chaque puits de la plaque de 96 puits et incubez à température ambiante pendant 15 minutes. À l’aide d’un lecteur de plaques de fluorescence, lire la fluorescence et analyser les données comme indiqué dans le protocole texte.