Encyclopédie des expériences JoVE
Recherche sur le cancer
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Commencez par prendre une plaque multi-puits contenant des cellules adhérentes.
Traitez ces cellules avec un milieu contenant de la thymidine tritiée - une version radioactive de la thymidine - et incubez.
Pendant l’incubation, les cellules qui se répliquent activement incorporent de la thymidine radioactive. Cette thymidine s’apparie à l’opposé de l’adénosine, générant de l’ADN radiomarqué dans les cellules en prolifération.
Retirez le support usagé des puits. Ajoutez un tampon de lyse pour lyser les cellules et libérer de l’ADN dans la suspension.
Préparez l’ensemble du collecteur de cellules en plaçant les tubes collecteurs du moissonneur sur les puits de la microplaque.
Appliquez une pression d’aspiration pour permettre l’aspiration de l’ADN en suspension des puits. Cet ADN se dépose sur le papier filtre, formant des taches spécifiques.
Découpez les chads en papier filtre avec des taches d’ADN. Transférez ces tchads individuellement dans des flacons à scintillation.
Superposez le papier filtre avec un cocktail de scintillation. Placez le flacon dans un comptoir à scintillation liquide.
À l’intérieur du compteur, l’ADN marqué émet de l’énergie par désintégration radioactive. Cette énergie est absorbée par les composants du cocktail de scintillation. Finalement, les composants du cocktail commencent à transférer les impulsions, qui à leur tour sont absorbées par le capteur.
La quantité de radioactivité détectée détermine l’étendue de la division cellulaire.
Plaquez 100 000 cellules dans des puits triples dans une plaque de 24 puits. Après 46 heures, ajoutez de la thymidine tritiée au milieu de culture et incubez à 37 degrés Celsius pendant 2 heures.
Ensuite, après avoir retiré le milieu, ajoutez 300 microlitres de trypsine-EDTA préchauffée à 0,25 % et incubez pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius pour briser les cellules et libérer l’ADN. Ensuite, allumez le collecteur de cellules et allumez la pompe.
Placez le papier filtre dans le récupérateur de cellules. Continuez à collecter les tubes du collecteur de cellules dans un plateau vierge vide. Ensuite, appuyez sur prélavage pour mouiller le papier filtre. Placez les tubes collecteurs dans les puits d’échantillonnage et commencez.
Utilisez une source de lumière chaude pour sécher le papier filtre et disposez les flacons correspondants sur le plateau. Percez des feuilles de papier dans les flacons, puis ajoutez 2 millilitres de cocktail à scintillation liquide dans chaque flacon.
Incuber les flacons pendant 1 heure dans le compteur à scintillation avant de faire fonctionner la machine pour obtenir le nombre par minute de chaque échantillon, ce qui reflète la synthèse active de l’ADN.